么乃全，李淑君，姜秀云，馬紅霞，高云航，王春芳，胡靜濤，徐鳳宇，胡桂學(xué)*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，長春130118;2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，長春130118;3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，長春130118)

鵝新城疫是由鵝副黏病毒(Goose paramyxovirus，GPMV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，15日齡以內(nèi)的雛鵝發(fā)病率和死亡率可達(dá)100%。1997年以來，該病成為了嚴(yán)重危害我國養(yǎng)鵝業(yè)的主要疫病之一。目前用于預(yù)防鵝新城疫的滅活疫苗成本相對較高，所以有必要研發(fā)新的疫苗防治該病。GPMV表面的HN(Hemagglutinin neuraminidase)糖蛋白是其主要保護(hù)性抗原之一［1］，與經(jīng)典雞新城疫病毒株相比，GPMV HN的個別氨基酸有所不同，抗原的差異使針對GPMV疫苗的研究具有重要意義［2］。DNA疫苗具有產(chǎn)生持久免疫應(yīng)答、制備簡單、省時省力、貯存運輸方便、應(yīng)用較安全、誘發(fā)細(xì)胞免疫和體液免疫等優(yōu)點，對病毒感染等需要細(xì)胞免疫清除病原的疾病預(yù)防更為有效［3］，但單基因疫苗刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力一般較常規(guī)疫苗弱，有必要配合高效的佐劑使用［4－5］。分枝桿菌的熱休克蛋白65(Heat shock proteins65，hsp65)是放線菌中特有的蛋白，不但作為主要保護(hù)性抗原［6］，還可抑制黑色素瘤的生長，減弱腫瘤誘發(fā)的血管生成作用［7］，并被證明對 C57BL/6小鼠是安全的［8］;可通過交叉遞呈經(jīng)MHCI途徑提高樹突狀細(xì)胞等對抗原的遞呈、加工能力［9］，作為分子伴侶發(fā)揮免疫佐劑作用，能有效提高小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答［10－11］。

本研究擬構(gòu)建含有MAP(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis，禽分枝桿菌副結(jié)核亞種)hsp65和GPMV HN融合基因的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染入Marc－145細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，以期為制備新型的GPMV DNA疫苗奠定基礎(chǔ)，也為探索hsp65在病毒DNA疫苗中的分子佐劑作用提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料 鵝新城疫病毒 MHK－1株、E.coli DH5α感受態(tài)、標(biāo)準(zhǔn)雞新城疫陽性血清、真核表達(dá)載體pVAX1、Marc－145細(xì)胞、pMD19－T－h(huán)sp65－2(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室);pMD19－T載體、Ex Taq DNA 聚合酶、dNTPs、NheⅠ、EcoRⅠ、XbaⅠ、DL2000、DL5000、T4DNA 連接酶、Trizol RNA Reagent(TaKaRa，大連寶生物工程有限公司);梭華－sofast轉(zhuǎn)染試劑盒、FITC標(biāo)記的兔抗雞熒光抗體(北京鼎國昌盛生物公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒、凝膠純化回收試劑盒(Trans，全式金生物公司);DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液、TBD標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(Thermo，賽墨飛世爾生物化學(xué)制品有限公司);化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 HN基因的擴(kuò)增 參考鵝源新城疫NA－1株、WF0株、JAU04株(GenBank登錄號分別為DQ659677.1、FJ754273.2、EF141104.1)的 HN 基因序列設(shè)計一對引物，由生工生物(上海)有限公司合成。上游P1∶5’TATGAATTCGACCGCGCGGTTAACA3’(劃線部分為 EcoRⅠ酶切位點);下游 P2∶5’GGGTCTAGATTAAATCCCATCATCCTTGAGG3’(劃線部分為XbaⅠ酶切位點)。按Trizol RNA Reagen操作說明提取雞胚尿囊液培養(yǎng)的鵝副黏病毒RNA，RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA參照全式金生物公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行，體系為:模板 RNA 5 μL，Random Primer(0.1 μg/μL)1 μL，2×T － S Reaction Mix 10 μL，RI Enzyme Mix 1 μL，RNase － free Water 3 μL，總體積20 μL。PCR擴(kuò)增HN基因反應(yīng)體系:cDNA 2 μL，dNTPs 2.5 μL，上游引物 P1 0.5 μL，下游引物 P2 0.5 μL，10×Ex Taq buffer 2.5 μL，Ex Taq DNA 聚合酶 0.3 μL，ddH2O 16.7 μL，總體積25 μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s;57.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 個循環(huán);72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取3 μL PCR產(chǎn)物于0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.3 MAP hsp65基因的擴(kuò)增 根據(jù)MAP K－10株(GenBank 登錄號:NC_002944.2)、Mycobacterium avium 104株(GenBank登錄號:NC_008595.1)hsp65基因的序列設(shè)計一對引物，由生工生物(上海)有限公司合成。上游P11∶5’GGCGCTAGCACCATGGCCAAGACAATT3’;(劃線部分為 NheⅠ酶切位點)下游 P22∶5’GGCGAATTCAGAGCCTCCACCGAAGTCC3’;(劃線部分為EcoRⅠ酶切位點)反應(yīng)體系:模板 pMD19－T －h(huán)sp65－2 2μL，dNTPs 2.5 μL，上游引物 P11 0.5 μL，下游引物 P22 0.5 μL，2×GC buffer 2.5 μL，Ex TaqDNA 聚合酶 0.3 μL，ddH2O 16.7 μL，總體積 25 μL。反應(yīng)條件:98 ℃預(yù)變性5 min;98℃變性1 min，62℃退火1 min，72℃延伸2 min，共35個循環(huán);72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取3 μL PCR產(chǎn)物于0.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.4 pVAX1－HN、pVAX1－h(huán)sp65－HN 真核表達(dá)載體的構(gòu)建 將hsp65和HN基因片段回收純化后分別與pMD19－T載體連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切及PCR鑒定，并送生物工程(上海)有限公司測序。

鑒定正確后，用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和EcoRⅠ雙酶切克隆質(zhì)粒pMD19－T－HN和載體pVAX1?；厥?、純化HN基因和pVAX1線性質(zhì)粒，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒pVAX1－HN，酶切及PCR鑒定。

將酶切及PCR鑒定正確的pVAX1－HN用限制性內(nèi)切酶NheⅠ和EcoRⅠ雙酶切pVAX1－HN和pMD19－T－h(huán)sp65?；厥?、純化 hsp65基因和pVAX1－HN線性質(zhì)粒，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切及PCR鑒定。

1.5 重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Marc－145細(xì)胞 在轉(zhuǎn)染前20 h，消化Marc－145單層細(xì)胞，轉(zhuǎn)入6孔板(孔底裝有處理過的蓋玻片)，每孔6×105個細(xì)胞，待細(xì)胞鋪板密度在75%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

梭華－sofast/DNA復(fù)合物的制備:分別將2 μg pVAX1－HN、pVAX1－h(huán)sp65－HN、pVAX1質(zhì)粒分別稀釋于不含血清和抗生素的DMEM中，使混合液的終體積均為100 μL;18 μL脂質(zhì)體分別稀釋于不含血清和抗生素的DMEM中，使混合液的終體積均為300 μL，輕輕混勻;將100 μL 脂質(zhì)體稀釋液滴加到100 μL質(zhì)粒稀釋液中，邊加邊混勻;室溫孵育20 min，將200 μL梭華－sofast/DNA復(fù)合物加入到6孔板中，輕輕搖動使均勻混合，置37℃培養(yǎng)48 h。

1.6 表達(dá)產(chǎn)物的檢測 取出細(xì)胞爬片，用pH為7.2的PBST溶液漂洗細(xì)胞3次，加入預(yù)冷的80%丙酮，固定30 min;用PBST液洗3次;5%脫脂奶粉封閉2 h，棄封閉液，PBST液洗3次;加入10倍稀釋的雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，37℃孵育1 h，PBST液洗3次;加1000倍稀釋好的兔抗雞熒光抗體，37℃溫箱中避光孵育1 h，PBST液洗3次后，取出細(xì)胞爬片，在熒光顯微鏡下觀察并照相。在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中加入Trizol，提取RNA、反轉(zhuǎn)錄后PCR檢測，方法如1.2、1.3 項。

2 結(jié)果

2.1 HN及hsp65的PCR擴(kuò)增 以hsp65基因的P11/P22為引物、pMD19－T－h(huán)sp65－2為模板PCR擴(kuò)增hsp65基因，以HN基因的P1/P2為引物、鵝新城疫病毒雞胚尿囊液的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板PCR擴(kuò)增HN基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，分別可見約1600、1700 bp的DNA片段，與預(yù)期片段大小相符(圖1)。

2.2 HN及hsp65基因的克隆及酶切鑒定 回收純化后的HN、hsp65 PCR產(chǎn)物與pMD19－T連接，分別構(gòu)建克隆質(zhì)粒pMD19－T－HN、pMD19－T－ hsp65，酶切、PCR結(jié)果說明所克隆序列與目的片段大小相近(圖2、圖3)。

圖1 hsp65和HN基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 重組質(zhì)粒pMD19－T－HN酶切及PCR鑒定結(jié)果

圖3 重組質(zhì)粒pMD19－T－h(huán)sp65酶切及PCR鑒定結(jié)果

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析 測序結(jié)果表明分別得到了1731、1626 bp的片段，應(yīng)用DNAman軟件，將所得HN序列(GHN)、hsp65(CDhsp65)序列分別與GenBank中相關(guān)11、12株序列(登錄號見圖4、圖5)進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)GHN與EF141104親緣關(guān)系最近，同源性為99%;CDhsp65與AE016958親緣關(guān)系最近，同源性為98.68%。說明已成功克隆到了HN、hsp65基因。

圖4 HN基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖5 hsp65基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.4 真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 重組質(zhì)粒pVAX1－h(huán)sp65－HN經(jīng)EcoRⅠ及XbaⅠ雙酶切后得到約1700 bp和4500 bp的條帶，經(jīng) NheⅠ及EcoRⅠ雙酶切后得到約1600 bp和4600 bp的條帶，經(jīng)NheⅠ及XbaⅠ雙酶切后的產(chǎn)物得到約3300 bp和3000 bp的條帶，PCR鑒定結(jié)果也獲得了約1700 bp和1600 bp的條帶，說明成功構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1－h(huán)sp65－HN(圖6)。

2.5 RT－PCR鑒定轉(zhuǎn)染結(jié)果 提取轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pVAX1－HN、pVAX1－h(huán)sp65－HN并培養(yǎng)后的Mack－145細(xì)胞的總RNA，得到如圖7所示的28s、18s、5s 3條帶。以提取的細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，分別以hsp65基因的P11/P22、HN基因的P1/P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了相應(yīng)大小DNA片段(圖8)，而以提取的空載體pVAX1轉(zhuǎn)染的Mack－145細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板PCR后則未見相應(yīng)條帶，從轉(zhuǎn)錄水平上說明了hsp65、HN兩基因在Mack－145細(xì)胞中獲得了表達(dá)。

圖6 重組質(zhì)粒pVAX1－h(huán)sp65－HN酶切及PCR鑒定結(jié)果

圖7 pVAX1－h(huán)sp65－HN和pVAX1－HN轉(zhuǎn)染Marc－145細(xì)胞RNA提取結(jié)果

圖8 pVAX1－h(huán)sp65－HN和pVAX1－HN轉(zhuǎn)染Marc－145細(xì)胞RT－PCR結(jié)果

2.6 表達(dá)產(chǎn)物的免疫熒光鑒定 轉(zhuǎn)染48 h后，用熒光顯微鏡觀察，重組質(zhì)粒pVAX1－HN、pVAX1－h(huán)sp65－HN轉(zhuǎn)染的Marc－145細(xì)胞均可見綠色熒光(圖9 A、B)，而pVAX1轉(zhuǎn)染的Marc－145細(xì)胞中未見熒光(圖9 C)，從蛋白水平上表明HN基因在Marc－145細(xì)胞中獲得了表達(dá)。本研究將hsp65基因插于啟動子和HN基因之間，所以對于質(zhì)粒pVAX1－h(huán)sp65－HN而言，HN的表達(dá)也間接說明了hsp65的表達(dá)。

圖9 真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Marc－145細(xì)胞后間接免疫熒光檢測結(jié)果(200×)

3 討論

從遺傳學(xué)方面分析，目前流行的基因Ⅶ型副黏病毒與經(jīng)典的新城疫病毒存在抗原差異［12］，推測此差異是應(yīng)用傳統(tǒng)新城疫弱毒疫苗預(yù)防本病效果不甚理想的原因之一，所以應(yīng)用新的臨床分離株研制疫苗對于鵝新城疫的防控更有意義。本研究也表明所用毒株MHK－1(臨床分離強(qiáng)毒株，另文報道)的HN基因與親緣關(guān)系最近的吉林省鵝源JAU04株(登錄號:EF141104.1)有1個氨基酸的差異，與山東農(nóng)業(yè)大學(xué)分離的雞源ytan－2－01株(登錄號:AAY56372.1)有5個氨基酸的差異，與中國農(nóng)業(yè)大學(xué)分離的雞源AG/Tianjin/07株(登錄號:ACM67336.1)有13個氨基酸的差異，與LaSota株的核苷酸同源性僅為80.33%。

在本研究過程中發(fā)現(xiàn)，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pVAX1－h(huán)sp65－HN、pVAX1－HN分別轉(zhuǎn)染到Marc－145細(xì)胞后，已經(jīng)鋪滿爬片的細(xì)胞有部分脫落，使致密的細(xì)胞間出現(xiàn)較大空隙，而空載體轉(zhuǎn)染組無此現(xiàn)象。推測可能是HN表達(dá)于細(xì)胞表面后，通過血凝素位點與細(xì)胞表面的唾液酸結(jié)合，使細(xì)胞表面的負(fù)電荷減少的緣故，這也是HN作為NDV抗腫瘤的主要功能蛋白的作用之一;但研究也表明新城疫病毒對腫瘤細(xì)胞的殺傷、裂解是有選擇性的，對正常細(xì)胞無殺傷作用［13］，而本研究的后續(xù)試驗也證實，所構(gòu)建的上述質(zhì)粒對BALB/c鼠和吉林白鵝是安全的。

本研究通過酶切和PCR證實，成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1－HN、pVAX1－h(huán)sp65－HN;轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平上均可檢測到pVAX1－HN、pVAX1－h(huán)sp65－HN在Marc－145細(xì)胞中的表達(dá)，為進(jìn)一步研究真核重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX1－h(huán)sp65－HN作為DNA疫苗及hsp65的免疫佐劑作用奠定了基礎(chǔ)。

［1］Miller P J，Afonso C L，Spackman E，et al.Evidence for a new avian paramyxovirus serotype 10 detected in 571 rockhopper penguinsfrom the Falkland Islands［J］.Virol，2010，573(21):496－504.

［2］Kapczynski D R，King D J.Protection of chickens against overt clinical disease and determination of viral shedding following vaccination with commercially available Newcastle disease virus vaccines upon challenge with highly virulent virus from the California 2002 exotic Newcastle disease outbreak［J］.Vaccine，2005，23(34):24－33.

［3］Vogel F R，Sarver N.Nucleic acid vaccines［J］.Clin Microbiol Rev，1995，8(3):406－410.

［4］侯俊玲，鄭亞東，景志忠，等.DNA疫苗免疫佐劑的研究進(jìn)展［J］.中國獸醫(yī)科技，2005，35(2):153－156.

［5］Sawant P M，Verma P C，Subudhi P K，et al.Immunomodulation of bivalent Newcastle disease DNA vaccine induced immune response by co－delivery of chicken IFN－γ and IL－4 genes［J］.Veterinary Immunology and Immunopathology，2011，144:36－44.

［6］Okada M，Kita Y.Anti－ tuberculosis immunity by cytotoxic T cells granulysin and the development of novel vaccines(HSP－65 DNA+IL－12 DNA)［J］.Kekkaku，2010，85(6):531－538.

［7］Yang J，Xie Y，Wang H，et al.Administration of heat shock protein 65 inhibits murine melanoma growth in vivo［J］.Mol Med Report，2012，6:1167.

［8］孫 琳，吳秀麗，王麗穎.hsp65－MUC1腫瘤疫苗對小鼠胰腺組織的分子模擬作用［J］.吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2011，37(1):15－17.

［9］Chen K，Lu J，Wang L，et al.Mycobacterial heat shock protein 65 enhances antigen cross－presentation in dendritic cells independent of Toll－like receptor 4 signaling［J］.Epub，2004，75(2):260 －266.

［10］Hua Wang，Xuejin Su.Recombinant heat shock protein 65 carrying PADRE and HBV epitopes activates dendritic cells and elicits HBV－specific CTL responses［J］.Vaccine，2011，29:2328 －2335.

［11］靳彥文，曹 誠，李 平，等.熱休克蛋白65增強(qiáng)小鼠對HBV DNA疫苗免疫反應(yīng)的研究［J］.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2006，30(1):11－14.

［12］李志杰，丁 壯，畢玉海，等.鵝源副黏病毒NA－1株與雞新城疫病毒 F48E9株的抗原變異關(guān)系分析［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報，2008，28(3):235－238.

［13］P V Ravindra，AshokK Tiwari，Bhaskar Sharma，et al，Newcastle disease virus as an oncolytic agent［J］.Indian J Med Res，2009，130(11):507－513.