楊 然，朱海燕，趙明鏡，高永紅，王 顯

人THP－1細(xì)胞屬于急性髓系白血病細(xì)胞，是體外研究單核－巨噬細(xì)胞功能的良好替代品，該細(xì)胞經(jīng)佛波酯（PMA）誘導(dǎo)后分化為巨噬細(xì)胞［1］，而巨噬細(xì)胞能夠分泌腫瘤壞死因子α（TNF－α）、白細(xì)胞介素6（IL－6）和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等多種炎性細(xì)胞因子及趨化因子，進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化（AS）發(fā)生和發(fā)展。含藥血清能更好地反映藥物尤其是中藥復(fù)方在體內(nèi)通過血液循環(huán)產(chǎn)生藥理效應(yīng)的真實(shí)過程，有利于從細(xì)胞水平上探討中藥復(fù)方的作用機(jī)制，理論上提高了體外實(shí)驗(yàn)的真實(shí)性和可靠性。王顯教授在學(xué)習(xí)和總結(jié)古今醫(yī)家理論及經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對動(dòng)脈粥樣硬化的病因病機(jī)及其中西醫(yī)結(jié)合防治策略進(jìn)行創(chuàng)新性思考和探索，提出動(dòng)脈粥樣硬化“絡(luò)風(fēng)內(nèi)動(dòng)”學(xué)說［2］，指出“絡(luò)風(fēng)內(nèi)動(dòng)”乃急性冠脈綜合征的重要病機(jī)之一，并創(chuàng)制絡(luò)風(fēng)寧1號方用于冠心病不穩(wěn)定型心絞痛的治療，前期研究已證明絡(luò)風(fēng)寧1號方可顯著改善不穩(wěn)定型心絞痛的臨床癥狀，但其發(fā)揮作用的分子生物學(xué)機(jī)制尚不明確。結(jié)合既往研究，推測其通過抑制血管內(nèi)炎癥反應(yīng)來發(fā)揮作用。本研究通過脂多糖（LPS）刺激人單核－巨噬細(xì)胞系建立炎癥細(xì)胞模型，采用血清藥理學(xué)方法，以期為研究絡(luò)風(fēng)寧1號的抗炎作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥物與試劑 所用中藥均來自北京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。匹伐他汀鈣片（北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20080737）；佛波酯（PMA）（P1585）購自美國Sigma公司；脂多糖（tlrl－eblps）及Triozol Reagent均為Invivogen Life technologies產(chǎn)品；Human TNF－αELISA kit（EHC103a.48）購自欣博盛生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 動(dòng)物與細(xì)胞 SD（Sprague－Dawley）雄性大鼠24只，體重250g±10g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證編號為SCXK（京）2012－0009。THP－1單核細(xì)胞由中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 MultiSkan FC 酶標(biāo)儀購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清制備 24只SD 雄性大鼠，隨機(jī)分為空白組、絡(luò)風(fēng)寧1號組和匹伐他汀鈣組，分別以生理鹽水、15倍于人的絡(luò)風(fēng)寧1號藥液及15倍于人的匹伐他汀鈣藥液灌胃，劑量為1.2mL／100g，每日1次，連續(xù)7d。于末次給藥2h后，腹主動(dòng)脈采血，3 000g常溫離心后取上清液，收集各組含藥血清，56 ℃水浴30 min，滅活補(bǔ)體后分裝于1.5 mL EP 管中，置于－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 用含10%胎牛血清的RPMI Medium 1640培養(yǎng)基重懸原代細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞生長情況2d換1次液，4d傳1次代。選用6代～10代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 確定PMA最佳誘導(dǎo)濃度 調(diào)整細(xì)胞濃度為3.5×105個(gè)／L，接種于96孔板，每每孔100μL；每孔加入等體積的不同濃度PMA 溶液，使其終濃度分別為40nmol／L、80nmol／L、160nmol／L、320nmol／L、640nmol／L，每組6個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，分別誘導(dǎo)24h 及48h。棄上清，每孔加入100 μL 1mg／mL MTT 培養(yǎng)基溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后；棄上清，每孔加150μL DMSO，振蕩5min～10min，于酶標(biāo)儀550nm 處測各孔A 值。

1.2.4 確定絡(luò)風(fēng)寧1號方含藥血清最佳作用濃度向已分化好的巨噬細(xì)胞中依次加入5%空白血清、5%中藥血清、5%西藥血清、10%空白血清、10%中藥血清、10%西藥血清、15%空白血清、15%中藥血清、15%西藥血清、20%空白血清、20%中藥血清、20%西藥血清。每組6個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，孵育24h。

1.2.5 確定LPS最佳刺激濃度 向已分化好的巨噬細(xì)胞中加入100μL 濃度分別為20ng／mL、200ng／mL、2μg／mL、20μg／mL的LPS溶液，同時(shí)加入等體積含20%空白對照血清的培養(yǎng)基，則LPS終濃度分別為10ng／mL、100ng／mL、1μg／mL、10μg／mL，每組6個(gè)復(fù)孔，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，共同孵育24h。1.2.6 細(xì)胞上清MMP－9水平檢測 細(xì)胞培養(yǎng)方法同上，實(shí)驗(yàn)分組詳見表1。分別收集各組細(xì)胞上清液至無菌EP管中，置于－20 ℃冰箱保存，采用酶聯(lián)免疫吸附法，按ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作，1d～2d內(nèi)檢測完畢。

表1 實(shí)驗(yàn)分組及用藥

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果 倒置顯微鏡鏡下觀察，剛復(fù)蘇的THP－1單核細(xì)胞為非貼壁形式生長，體積較小，為圓形；培養(yǎng)4 8h后，細(xì)胞體積逐漸變大，細(xì)胞密度也增大。

2.2 不同濃度及時(shí)間PMA 對THP－1細(xì)胞增殖的影響 誘導(dǎo)24h、48h，PMA40nmol／L組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而PMA80nmol／L 組與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），且誘導(dǎo)24h時(shí)明顯高于誘導(dǎo)48h時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。故以PMA 80nmol／L誘導(dǎo)24h為最佳誘導(dǎo)條件。詳見表2。

表2 不同濃度及時(shí)間PMA 對THP－1細(xì)胞增殖的影響

表2 不同濃度及時(shí)間PMA 對THP－1細(xì)胞增殖的影響

與同組誘導(dǎo)48h比較，1）P ＜0.05；與對照組比較，2）P ＜0.01。

組別 n 誘導(dǎo)24h 誘導(dǎo)48h對照組6 0.130±0.085 0.120±0.006 PMA40nmol／L組 6 0.140±0.036 0.130±0.007 PMA80nmol／L組 6 0.150±0.0121）2）0.140±0.008 PMA160nmol／L組 6 0.140±0.011 0.130±0.006 PMA320nmol／L組 6 0.140±0.01 0.130±0.009 PMA640nmol／L組 6 0.130±0.007 0.130±0.005

2.3 不同濃度含藥血清對THP－1源性巨噬細(xì)胞增殖的影響 5%濃度的各組含藥血清對細(xì)胞有顯著增殖作用，與空白血清組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），故不選此濃度；10%濃度的中藥血清與10%濃度的空白血清相比抑制細(xì)胞增殖（P ＜0.01）；15%與20%空白血清組與5%空白血清組相比，則顯示出血清對細(xì)胞的毒性（P ＜0.01）；故以10%濃度的含藥血清為最佳濃度。詳見表3。

表3 不同濃度含藥血清抑制人THP－1源性巨噬細(xì)胞增殖的比較

表3 不同濃度含藥血清抑制人THP－1源性巨噬細(xì)胞增殖的比較

與5%空白血清組比較，1）P ＜0.01；與10%空白血清組比較，2）P ＜0.01。

組別 人THP－1源性巨噬細(xì)胞55%%空中白藥血血清清組組00..345100±±00..00351 41）5%西藥血清組 0.340±0.019 1100%%空中白藥血血清清組組 00..335100±±00..00210 52）1105%%西空藥白血血清清組組 00..330000±±00..00334 01）15%中藥血清組 0.290±0.014 1250%%西空藥白血血清清組組 00..323600±±00..00228 61）20%中藥血清組 0.260±0.028 20%西藥血清組 0.270±0.031

2.4 不同濃度LPS對人THP－1源性巨噬細(xì)胞增殖的影響 LPS可刺激細(xì)胞增殖，1μg／mL 組與對照組相比有明顯增殖作用（P ＜0.01）。詳見表4。

表4 不同濃度LPS對人THP－1源性巨噬細(xì)胞增殖的影響

表4 不同濃度LPS對人THP－1源性巨噬細(xì)胞增殖的影響

與對照組比較，1）P ＜0.01。

組別 人THP－1源性巨噬細(xì)胞對照組0.200±0.018 10ng／mL組 0.200±0.014 100ng／mL組 0.220±0.015 1μg／mL組 0.340±0.0261）10μg／mL組 0.260±0.0201）

2.5 絡(luò)風(fēng)寧1號含藥血清對單核－巨噬細(xì)胞MMP－9表達(dá)的影響 炎癥因子MMP－9的表達(dá)水平模型組明顯高于空白組（P ＜0.01），中藥血清高濃度組及西藥血清組低于模型組（P ＜0.01）；隨著中藥各組含藥血清液濃度的增加，MMP－9的表達(dá)逐漸降低（P ＜0.05）。詳見表5。

表5 各組細(xì)胞上清液MMP－9水平比較 ng／mL

表5 各組細(xì)胞上清液MMP－9水平比較 ng／mL

與空白組相比，1）P ＜0.01；與模型組相比，2）P ＜0.01。

組別 n MM－9空白組3 3.800±0.681模型組 3 5.200±0.6361）中藥血清（低）組 3 4.640±0.171中藥血清（中）組 3 4.170±0.2742）中藥血清（高）組 3 3.380±0.1032）西藥血清組 3 2.570±0.5272）

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化斑塊從穩(wěn)定變?yōu)橐讚p的過程涉及炎癥、免疫、代謝、凝血等多個(gè)環(huán)節(jié)，其中炎癥反應(yīng)是引起斑塊不穩(wěn)定的關(guān)鍵因素［3］。人THP－1細(xì)胞作為體外研究單核－巨噬細(xì)胞功能的良好替代品，經(jīng)PMA 誘導(dǎo)后分化為巨噬細(xì)胞［1］，而巨噬細(xì)胞能夠分泌TNF－α、IL－6和MMPs等多種炎性細(xì)胞因子及趨化因子。噻唑藍(lán)（MTT）法是一種用于檢測細(xì)胞的存活和生長的簡便方法，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT 結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比［4］，據(jù)此可檢測細(xì)胞的相對數(shù)和相對活力。

首先，篩選PMA 的最佳作用濃度。研究表明［5，6］，PMA 可 以 使 體 外 培 養(yǎng) 的 單 核 細(xì) 胞 分 化 為 巨 噬細(xì)胞。由于THP－1單核細(xì)胞為懸浮細(xì)胞，MTT 法測定細(xì)胞存活相對數(shù)，就能夠反映經(jīng)PMA 誘導(dǎo)后單核細(xì)胞的貼壁情況，即巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。本實(shí)驗(yàn)通過選取不同濃度的誘導(dǎo)劑及不同的誘導(dǎo)時(shí)間，篩選出巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化率最高的PMA 濃度，即為最佳誘導(dǎo)濃度。而含胎牛血清的完全培養(yǎng)基使細(xì)胞不斷增殖，不利于單核細(xì)胞貼壁分化［1］，故本實(shí)驗(yàn)選用基礎(chǔ)培養(yǎng)基以促進(jìn)細(xì)胞貼壁分化｛JP3。對于PMA 的誘導(dǎo)濃度，文獻(xiàn)一般采用80nmol／L～200nmol／L濃度誘導(dǎo)單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞，其中選用80nmol／L～160nmol／L濃度居多，故本實(shí)驗(yàn)設(shè)定40nmol／L、80nmol／L、160 nmol／L、320nmol／L、640nmol／L 5個(gè)濃度梯度。PMA作用24h后，在40nmol／L～80nmol／L 巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化率隨PMA 濃度升高而升高，在160nmol／L～640 nmol／L 巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化率隨PMA 濃度升高而降低。作用48h后，隨PMA 濃度的升高巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化率變化趨勢與作用24h的相同；但在相同濃度下，作用48 h巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化率低于作用24h。THP－1單核細(xì)胞與PMA（80nmol／L）培養(yǎng)24h，由懸浮細(xì)胞向貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)化，呈阿米巴樣生長，并伸出偽足，呈現(xiàn)巨噬細(xì)胞形態(tài)，轉(zhuǎn)化率達(dá)90%。所以本實(shí)驗(yàn)選擇80nmol／L 作為誘導(dǎo)THP－1單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞的最終濃度。

其次，確定了含藥血清的最佳濃度。血清藥理學(xué)是指用含有藥物成分的血清施加于體外實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系的一種半體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方法［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，5%濃度的各組含藥血清對細(xì)胞有顯著增殖作用，與空白血清組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01），故不選此濃度；10%中藥血清組與10%空白血清組相比抑制細(xì)胞增殖（P ＜0.01）；15%與20%空白血清組與5%空白血清組相比，則顯示出血清對細(xì)胞的毒性（P ＜0.01）。故以10%濃度的含藥血清為最佳濃度。

在確定以上兩個(gè)濃度的基礎(chǔ)上，確定最佳造模濃度。LPS、絲裂原即有絲分裂原，因可導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂而得名，包括LPS、美洲商陸（PWM）、刀豆蛋白A（ConA）等。LPS在體內(nèi)與可溶性CD14（sCD14）或細(xì)胞 膜 上 的 CD14（membrane－boundCD14moleeule，mCD14）受體結(jié)合，形成LPS 蛋白復(fù)合物（LpSbindingprotein，LBP），激發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答。有研究表明［8－10］，LPS濃度在1μg／mL、作用24h可充分誘導(dǎo)活化的巨噬細(xì)胞。LPS 通過與TLR4 受體結(jié)合導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NF－κB激活是引起大量炎性介質(zhì)表達(dá)的重要始動(dòng)因素［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPS 可刺激細(xì)胞增殖，10ng／mL與100ng／mL 組與對照組相比，細(xì)胞無明顯增殖（P ＞0.05）；1μg／mL 組與對照組相比有明顯增殖作用（P ＜0.01），故以1μg／mL的LPS為最佳造模濃度。經(jīng)過反復(fù)驗(yàn)證，單核－巨噬細(xì)胞炎癥模型制備成功，并將其用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性、動(dòng)態(tài)、復(fù)雜的炎癥性疾病。針對動(dòng)脈粥樣硬化的研究難點(diǎn)以及動(dòng)脈粥樣硬化引起急性心腦血管事件的發(fā)病特點(diǎn)，王顯教授提出動(dòng)脈粥樣硬化“絡(luò)風(fēng)內(nèi)動(dòng)”學(xué)說［12－14］，經(jīng)過10余年的臨床研究，認(rèn)為絡(luò)風(fēng)內(nèi)動(dòng)乃是急性心腦血管事件的重要病機(jī)，并在該學(xué)說指導(dǎo)下，研制出以祛風(fēng)除濕、益氣活血為主要功效的絡(luò)風(fēng)寧1號方，強(qiáng)調(diào)在益氣活血同時(shí)，應(yīng)加強(qiáng)“風(fēng)藥”的使用。該方以徐長卿、威靈仙、黨參、黃芪為主藥，方中藥物可能通過抗炎、調(diào)脂、抗栓、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等作用穩(wěn)定斑塊，防止急性冠脈綜合征的發(fā)作。

基質(zhì)降解是動(dòng)脈粥樣硬化高風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志，導(dǎo)致心肌梗死和中風(fēng)。基質(zhì)金屬蛋白酶是影響動(dòng)脈粥樣斑塊穩(wěn)定性的重要生物酶，能夠特異性的與細(xì)胞外基質(zhì)相結(jié)合，降解細(xì)胞外基質(zhì)，促使內(nèi)皮細(xì)胞遷移，導(dǎo)致斑塊纖維帽降解和斑塊破損［15］。

Peter等［16］在apoE－／－小鼠動(dòng)脈粥樣硬化病變中誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞過表達(dá)MMP－9，結(jié)果發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞過表達(dá)活化的MMP－9時(shí)顯著增加彈力蛋白的降解，誘導(dǎo)有效的斑塊破裂。敲除TLR4的ApoE－／－小鼠模型顯示，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊體積明顯減少，斑塊中的脂質(zhì)和巨噬細(xì)胞浸潤均降低，顯著下調(diào)了促炎因子表達(dá)水平，從而使斑塊趨于穩(wěn)定而不易破裂［17］。Blich等［18］將實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究的結(jié)果相互驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清液中TNF－α、MMP－9、IL－1與單核細(xì)胞趨化蛋白－1水平明顯增加，而TLR2和TLR4基因敲除后的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清液中上述細(xì)胞因子無明顯增加。臨床研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死患者血漿類肝素酶水平與穩(wěn)定型心絞痛患者和健康人相比明顯升高，而且肝素酶染色的易損斑塊與穩(wěn)定斑塊的病理標(biāo)本中，易損斑塊的肝素酶染色是增加的。由此得出被激活的巨噬細(xì)胞過量分泌相關(guān)炎性細(xì)胞因子，導(dǎo)致斑塊易損性增強(qiáng)，并可能與TLR2和TLR4基因調(diào)控有關(guān)。也有實(shí)驗(yàn)證明，激活TLR2、TLR4、TLR9 可上調(diào)MMP－1、MMP－2、MMP－3、MMP－8、MMP－9mRNA 的表達(dá)［19］。其中MMP－9與動(dòng)脈粥樣硬化關(guān)系密切，可作為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的標(biāo)志物［20］。目前證實(shí)LPS通過TLR4介導(dǎo)MMP－9及蛋白水解酶表達(dá)［21］，兩者可降解細(xì)胞外基質(zhì)引發(fā)AS 斑塊不穩(wěn)定［22，23］。因此，基于單核－巨噬細(xì)胞炎癥模型的成功制備，觀察絡(luò)風(fēng)寧1號含藥血清對炎癥因子MMP－9表達(dá)的影響，結(jié)果表明：絡(luò)風(fēng)寧1號含藥血清呈劑量依賴型抑制MMP－9表達(dá)。但其通過何種調(diào)控機(jī)制來發(fā)揮作用仍不清楚，可能通過抑制TLR4／NF－κB炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化來發(fā)揮抗炎作用。

［1］ 王術(shù)玲，潘華新，王培訓(xùn).THP－1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型的建立及鑒定［J］.中藥新藥與臨床藥理，2009，20（3）：281.

［2］ 王顯，胡大一.急性冠脈綜合征“絡(luò)風(fēng)內(nèi)動(dòng)”假說臨床研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2008，23（3）：204－208.

［3］ David S，Daniel G.Treating arteries instead of risk factors：A paradigm change in management of atherosclerosis［J］.Stroke，2010，41（6）：1193－1199.

［4］ 司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)［M］.世界圖書出版公司，1996：186－188.

［5］ Vosper H，Khoudoli GA，Palmer CN.The peroxisome proliferator activatedreceptor delta is required for the differentiation of THP－1monocytic cells by phorbol ester［J］.Nucl Recept，2003，1（1）：9.

［6］ 白智峰，成蓓，李長運(yùn)，等.胰島素對單核／巨噬源性泡沫細(xì)胞ACAT－1表達(dá)的影響［J］.中華內(nèi)分泌代謝雜志，2005，21（5）：473－474.

［7］ 王國佐，葛金文.血清藥理學(xué)方法在中藥研究中的進(jìn)展［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27（3）：78－80.

［8］ 張萃.LPS等絲裂原所致THP－1細(xì)胞活化增殖的優(yōu)化因素［J］.山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41（3）：222－224.

［9］ 李盛來，張迪亞，嚴(yán)杰，等.比較牙齦卟啉單胞菌脂多糖誘導(dǎo)THP－1和HL－60細(xì)胞分泌IL－1B 能力及相關(guān)信號通路受體的差異［J］.現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志，2008，22（2）：176－179.

［10］ 侯本祥，張琛，蔭俊.脂多糖對THP－1細(xì)胞CD14誘導(dǎo)表達(dá)的影響［J］.首都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，26（6）：711－713.

［11］ Erridge C，Moncayo－Nieto OL，Morgan R，et al.Acinetobacter baumannii lipopolysaccharides are potent stimulators of human monocyte activation via toll－like receptor 4signalling［J］.J Med Microbiol，2007，56（Pt 2）：165－171.

［12］ 王顯，楊巨成.急性冠脈綜合征“絡(luò)風(fēng)內(nèi)動(dòng)”假說及實(shí)踐［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2002，1（9）：19－22.

［13］ 王顯，楊巨成.急性冠脈綜合征“絡(luò)風(fēng)內(nèi)動(dòng)”假說再認(rèn)識［J］.中華中醫(yī)藥雜志2002，1（10）：8－10.

［14］ Xian W，Zhongxiang L，Junbo G，et al.Relationship between traditional chinese medicine syndrome type and coronary arteriography of acute coronary syndrome［J］.CJIM，2003，9（2）：116－119.

［15］ Fatar M，Stroick M，Griebe M，et al.Matrixmetallproteinases in cerebrovascular diseases［J］.Cerebrovaso Dis，2005，20（3）：141－151.

［16］ Peter J，Cough IG，Gomez PT，et al.Macrophage expression of active MMP－9induces acute plaque disruption in apoE－deficient mice［J］.Clin Invest，2005，116：59.

［17］ Michelsen KS，Wong MH，Shah PK，et al.Lack of toll－like receptor 4or myeloid differentiation factor 88reduces atherosclerosis and alters plaque phenotype in mice deficient in apolipoprotein E［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（29）：10679－10684.

［18］ Blich M，Golan A，Arvatz G，et al.Macrophage activation by heparanase is mediated by TLR－2and TLR－4and associates with plaque progression［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2013，33（2）：e56－e65.

［19］ Ehrentraut H，Meyer R，Schwederski M，et al.Systemically administered ligands of Toll－like receptor 2，－4，and－9induce distinct inflammatory responses in the murine lung［J］.Mediators Inflamm，2011，2011：746532.

［20］ Tretjakovs P，Jurka A，Bormane I，et al.Circulating adhesion molecules，matrix metalloproteinase－9，plasminogen activator inhibitor－1，and myeloperoxidase in coronary artery disease patients with stable and unstable angina［J］.Clin Chim Acta，2012，413（1－2）：25－29.

［21］ Grenier D，Grignon L.Response of human macrophage－like cells to stimulation by Fusobacterium nucleatum ssp.nucleatum lipopolysaccharide［J］.Oral Microbiol Immunol，2006，21（3）：190－196.

［22］ 周志斌，郭毅，王思鴻，等.基質(zhì)金屬蛋白酶9及轉(zhuǎn)化生長因子β1在人動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的表達(dá)及其與斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系［J］.中國動(dòng)脈硬化雜志，2006，14（3）：217－220.

［23］ 梁萍，孫雷，唐建武，等.細(xì)胞間粘附分子1、血管細(xì)胞粘附分子－1和腫瘤壞死因子－α在人動(dòng)脈粥樣硬化病灶中的表達(dá)及意義［J］.中國動(dòng)脈硬化雜志，2004，12（4）：427－429.