陳 珊，華 梅，劉 迪，趙書博，李 凡，劉東波，夏紅梅

(東北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130024)

纖維素是由吡喃型D－葡萄糖以β－1，4－糖苷鍵連接而成的直鏈大分子，是自然界中最廣泛存在的一類碳水化合物，也是地球上最豐富的再生資源。利用生物技術(shù)對(duì)植物纖維素進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化以生成人類急需的能源和化工原料等，將對(duì)緩解人類社會(huì)環(huán)境污染、食物短缺和能源危機(jī)等具有重大意義［1］。微生物所產(chǎn)生的纖維素酶的降解作用是纖維素資源開發(fā)利用的有效途徑，這些纖維素酶主要包括:內(nèi)切葡聚糖酶(endo－l，4－β－D－glucanase，EC3.2.l.4)、外切葡聚糖酶［纖維二糖水解酶(l，4－β－D－glucan cellobiohydrolase，EC3.2.l.9l)和纖維糊精酶(cellodextrinase，EC3.2.l.74)］及β－葡萄糖苷酶(β－glucosidase，EC3.2.1.21)［2］。

產(chǎn)纖維素酶的微生物廣泛分布于真菌、細(xì)菌、放線菌等菌屬中，之前的研究多集中在木霉屬和青霉屬等真菌方面，但研究結(jié)果顯示雖然這些真菌產(chǎn)生的纖維素酶種類較多，活力較高，但仍然不能滿足實(shí)際生產(chǎn)的需求，特別是真菌在降解纖維素時(shí)還具有培養(yǎng)周期長(zhǎng)、易染菌、耐堿性差、難以實(shí)現(xiàn)大工業(yè)生產(chǎn)等不足。近年來，陸續(xù)出現(xiàn)了細(xì)菌降解纖維素的報(bào)道，產(chǎn)芽孢細(xì)菌因具有特化的芽孢，在耐酸堿、耐高溫等方面顯現(xiàn)了獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［3］，更利于實(shí)際操作和工業(yè)生產(chǎn)，因此成為目前纖維素降解微生物研究的重要方向。

本文從長(zhǎng)白山森林土壤中篩選到了一株產(chǎn)纖維素酶的地衣芽孢桿菌，對(duì)其進(jìn)行了分類鑒定，并研究了菌株產(chǎn)纖維素酶的最佳條件，為該菌的進(jìn)一步應(yīng)用及對(duì)纖維素的有效轉(zhuǎn)化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 培養(yǎng)基

1.1.1 富集培養(yǎng)基

羧甲基纖維素鈉(CMC－Na)，1%;Mandels 無機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽液［4］;蛋白胨，1%;瓊脂粉，1.5%;自然pH。

1.1.2 篩選培養(yǎng)基

CMC－Na，1%;Mandels 無機(jī)營(yíng)養(yǎng)鹽液;瓊脂粉，1.5%;自然pH。

1.1.3 產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基

CMC－Na，1%;NaCl，0.5%;KH2PO4，0.1%;MgSO4，0.02%;蛋白胨，1%;pH 7.2。

1.2 菌株的分離篩選

采集長(zhǎng)白山森林土壤，置于無菌水中振蕩，打散后取上層水樣接入富集培養(yǎng)基中，連續(xù)富集培養(yǎng)3 次后，將上清液梯度稀釋涂布或劃線于篩選培養(yǎng)基平板上30℃培養(yǎng)至菌落長(zhǎng)出，經(jīng)剛果紅染色、NaCl 脫色后，觀察菌落周圍是否有透明圈生成，并測(cè)定透明圈直徑與菌落直徑的比值，選取比值較大的菌株接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，測(cè)定發(fā)酵液的酶活性。

1.3 CMC 酶活力的測(cè)定

取1.5 mL 0.05mol/ L 緩沖液配制的1.0% CMC 溶液，加入0.5mL 適當(dāng)稀釋的酶液，50℃反應(yīng)30min 后用DNS 法測(cè)定酶解產(chǎn)生的還原糖量，酶活單位采用國(guó)際單位(International Unit，IU)，即在實(shí)驗(yàn)條件下1 mL 酶液1 min 產(chǎn)生1?mol 還原糖的酶量作為1 個(gè)酶活單位U［5］。

1.4 菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［6］進(jìn)行。分子生物學(xué)鑒定及進(jìn)化分析依據(jù)該菌株的16S rDNA 序列，具體方法為首先提取菌株的基因組DNA［7］，以該基因組為模板擴(kuò)增菌株的16S rDNA。所用PCR 引物為細(xì)菌鑒定通用引物:27F 5＇－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3＇，1492R 5＇－ACGGCTACCTTGTTACGACT－3＇。PCR 反應(yīng)程序:94℃4 min;94℃1min，55 ℃30 s，72℃2min，30 個(gè)循環(huán);72℃10min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的條帶回收后與PMD－18T 載體連接送長(zhǎng)春庫美測(cè)序公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI 進(jìn)行BLAST 分析，以ClustalX 進(jìn)行多序列比對(duì)后，采用MEGA4.0 的Neighbor－Joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 發(fā)酵溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

將2ml 種子液接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，分別置于25℃、30℃、37℃、40℃和45℃搖床中振蕩培養(yǎng)，間隔12h取樣。將發(fā)酵液樣品在8000rpm 條件下離心10min，所得上清液即為粗酶液。測(cè)定不同粗酶液樣品的CMC 降解活性，選取不同溫度下達(dá)到產(chǎn)酶高峰時(shí)的酶活性做比較，以最高活性為100%，其余活性換算為相對(duì)活性作圖，研究不同發(fā)酵溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

1.6 培養(yǎng)基初始pH 對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

配制初始pH 分別為5、6、7、8、9 的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，接種后在測(cè)得的最適培養(yǎng)溫度下振蕩培養(yǎng)，間隔12h取樣。將發(fā)酵液樣品在8000rpm 條件下離心10min，測(cè)定上清液的CMC 降解活性，選取不同初始pH 培養(yǎng)基中達(dá)到產(chǎn)酶高峰時(shí)的酶活性做比較，以最高活性為100%，其余活性換算為相對(duì)活性作圖，研究培養(yǎng)基不同初始pH 對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

1.7 碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

改變產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的碳源種類，濃度均采用1%，接入2ml 種子液后置于最適培養(yǎng)溫度下?lián)u床振蕩培養(yǎng)，達(dá)到產(chǎn)酶高峰后測(cè)定不同碳源條件下粗酶液的CMC 降解活性，研究不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

1.8 氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

分別選取典型的有機(jī)氮和無機(jī)氮作為產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的氮源，濃度均采用1%，接入2ml 種子液后置于最適培養(yǎng)溫度下?lián)u床振蕩培養(yǎng)，達(dá)到產(chǎn)酶高峰后測(cè)定不同氮源條件下粗酶液的CMC 降解活性，研究不同氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種的篩選

以CMC－Na 為唯一碳源進(jìn)行菌種篩選，待細(xì)菌在平板上生長(zhǎng)后，用0.1%的剛果紅水溶浸染15min，再用1M 的NaCl 水溶液脫色。剛果紅可將CMC－Na 染成紅色，而纖維素降解菌株周圍由于分泌的纖維素酶使CMC 降解為小分子糖不著色，因此可以明顯的觀察到透明圈的存在(圖1)。應(yīng)用本方法成功的從長(zhǎng)白山森林土壤中篩選到了多株對(duì)CMC 具有降解活性的菌株，選擇其中的芽孢桿菌DS1309 做為進(jìn)一步的研究對(duì)象。

圖1 剛果紅染色后菌株周圍形成的透明圈

2.2 菌種的鑒定

菌株DS1309 在CMC 培養(yǎng)基及普通細(xì)菌培養(yǎng)基上生長(zhǎng)菌落呈污白色，干燥，粗糙，不透明，中間凸起。菌體在顯微鏡油鏡下觀察呈桿狀，產(chǎn)芽孢，革蘭氏染色為陽性，顯微形態(tài)圖見圖2。

在形態(tài)學(xué)觀察的同時(shí)對(duì)菌株進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定。菌株16S rDNA 序列分析結(jié)果表明，該菌株的16S rDNA 序列與地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)16S rDNA 序列的同源性高達(dá)99%，將相關(guān)序列通過ClustalX 進(jìn)行多序列比對(duì)后，利用MEGA4.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示在系統(tǒng)發(fā)育上菌株DS1309與地衣芽孢桿菌屬于同一分支。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，確定該菌株為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。

2.3 地衣芽孢桿菌DS1309 產(chǎn)酶條件的研究

2.3.1 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

將2ml 種子發(fā)酵液接種于產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，置于不同溫度下振蕩培養(yǎng)，間隔12h 取樣測(cè)定上清液的酶活性。結(jié)果顯示在30℃左右菌體生長(zhǎng)旺盛，發(fā)酵液酶活力最高(圖3)，因此確定菌株DS1309 產(chǎn)纖維素酶的最適發(fā)酵溫度為30℃。

圖2 菌株DS1309 的顯微形態(tài)圖

圖3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

2.3.2 培養(yǎng)基初始pH 對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

制備產(chǎn)酶培養(yǎng)基分裝至三角瓶中，分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH 為5、6、7、8 和9，接入2ml 種子液后，置于最適溫度30℃下培養(yǎng)，間隔12h 取樣測(cè)定上清液的酶活性，選取達(dá)到產(chǎn)酶高峰時(shí)的酶活性作圖。由圖4可知，初始發(fā)酵pH 對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響比較明顯，在pH6.0 范圍內(nèi)，隨著初始pH 的升高，CMC 降解酶活力增強(qiáng)，pH 為6.0 時(shí)菌株所產(chǎn)酶活力最高;pH 進(jìn)一步升高后，發(fā)酵液酶活力迅速降低，在pH7.0 時(shí)酶活力僅為pH6.0 培養(yǎng)基中活力的40%，說明菌株DS1309 產(chǎn)纖維素酶的最適發(fā)酵初始pH 為6.0。

圖4 培養(yǎng)基初始pH 對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

2.3.3 不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

分別選取CMC－Na、葡萄糖、蔗糖、麩皮和玉米秸稈作為產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的碳源，研究不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。結(jié)果(圖5)表明菌株DS1309 對(duì)碳源利用廣泛，除了能夠以CMC－Na 為碳源外，還能夠利用單糖、雙糖及麩皮、玉米秸稈等天然纖維素。碳源對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶的影響順序?yàn)槠咸烟牵菊崽牵钧熎ぃ居衩捉斩挘綜MC－Na，最佳利用碳源為葡萄糖。同時(shí)研究也顯示出，以葡萄糖和蔗糖為碳源時(shí)，產(chǎn)酶高峰出現(xiàn)較晚，推測(cè)當(dāng)培養(yǎng)基中單糖和雙糖濃度較高時(shí)，有利于菌株的生長(zhǎng)，但是對(duì)菌株產(chǎn)酶有產(chǎn)物抑制作用;隨著碳源的利用，糖濃度降低，抑制作用解除，纖維素酶產(chǎn)量迅速提高。

2.3.4 不同氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

分別選取有機(jī)氮蛋白胨、酵母粉，無機(jī)氮NH4NO3、(NH4)2SO4 以及提供無極氮形式的有機(jī)物尿素作為氮源，研究不同氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。結(jié)果(圖6)表明有機(jī)氮作為氮源的條件下，菌株發(fā)酵液的酶活力較高，最佳的氮源為酵母粉。同時(shí)結(jié)果還表明菌株能夠利用硝酸鹽生長(zhǎng)并產(chǎn)酶，但對(duì)于銨鹽形式的無機(jī)氮源利用較差。

圖5 碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

圖6 氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

3 結(jié) 語

本文采用唯一碳源法從長(zhǎng)白山森林土壤中篩選到了一株具有纖維素降解酶活力的芽孢桿菌DS1309，根據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果和16SrDNA 的系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定該菌株為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。采用液體振蕩培養(yǎng)的方法，優(yōu)化了菌株DS1309 產(chǎn)CMCase 的發(fā)酵條件，結(jié)果顯示，菌株產(chǎn)酶的最適培養(yǎng)溫度是30℃，培養(yǎng)基最適初始pH 為6.0，產(chǎn)酶的最適碳源為葡萄糖，最適氮源為酵母粉，在最優(yōu)條件下發(fā)酵48h 后酶活可達(dá)到1.82 IU/mL。

［1］SunY，ChengJ.Hydrolysis of lignocellulosic materials for ethanol Production:a review［J］.Bioresour Technol，2002，83:1－11.

［2］王鳳超.未培養(yǎng)微生物來源的纖維素酶功能基因的篩選［M］.濟(jì)南:山東大學(xué)碩士學(xué)位論文，2008.

［3］Trivedi N，Guota V，Kumar M，et al.An Alkali－h(huán)alotolerant Cellulase from Bacillus flexus Isolated from Green Seaweed Ulva lactuca［J］.Carblhydrate polymers，2011，83:891－897.

［4］高培基，曲音波，王祖農(nóng).纖維素酶解過程的分析和測(cè)定［J］.生物工程學(xué)報(bào)，1988，4(4):321－325.

［5］姚強(qiáng)，黃琰，陳冠軍.產(chǎn)耐堿性纖維素酶絲狀真菌的篩選及鑒定［J］.山東大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，40(1):119－124.

［6］東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］.北京:科學(xué)出版社，2001.

［7］F.M.奧斯伯，R.布倫特，R.E.金斯頓，等.精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南［M］.北京:科學(xué)出版社，2008.