姚海榮 田 菁 李迎春 張文琪 郝 權(quán)

人體免疫系統(tǒng)正常情況下可以有效地維持抵抗外來病原侵襲、監(jiān)視自身變異細胞及避免自身過度免疫反應(yīng)的平衡狀態(tài)。而腫瘤的形成可能是由于某些轉(zhuǎn)化的細胞逃避機體免疫清除作用而得以持續(xù)發(fā)展［1］。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Treg）是一群具有免疫調(diào)節(jié)功能的抑制性細胞亞群，在天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)中均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，在抗腫瘤免疫應(yīng)答中也發(fā)揮抑制效應(yīng)，介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸［1-3］。目前許多研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌、卵巢癌、胃腸道腫瘤等多種腫瘤患者的外周血和腫瘤局部的Treg均增加［3］。本研究旨在探討卵巢癌腹腔微環(huán)境內(nèi)CD4+CD25+Treg發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能與卵巢癌患者年齡、腫瘤病理類型、臨床分期及分化程度是否相關(guān)，并探討初治及復(fù)發(fā)卵巢癌腹水內(nèi)Treg免疫調(diào)節(jié)功能差異，進一步分析Treg功能與患者疾病進展是否相關(guān)。并初步探討卵巢癌腹水內(nèi)Treg發(fā)揮作用的具體機制，為進一步針對卵巢癌的免疫治療提供新的視角。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器 人CD4+Multisort kit、人CD25磁珠Ⅱ、MACS免疫磁珠分離儀（德國Miltenyi公司），人重組IL-2（美國Peprotech公司），人淋巴細胞CD3單克隆抗體、人淋巴細胞CD28單克隆抗體、CFSE（美國eBioscience公司），人中合性抗IL-10單克隆抗體、人中和性抗TGF-β1單克隆抗體（美國Ab?cam公司），鼠抗人CD4-FITC單克隆抗體、鼠抗人CD25-PE單克隆抗體、鼠FITC IgG 1同型對照抗體、鼠PE IgG 1同型對照抗體（美國BD Pharmingen公司），RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（美國Hyclone公司），人外周血淋巴細胞分離液購自于天津灝洋生物公司。流式細胞分析采用FACScan分析（美國BD Biosciences公司），CFSE標記T細胞增殖采用Modfit軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.1.2 病例收集 病例選自2012年3月至2013年8月期間就診天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院28例卵巢癌患者，所有患者均經(jīng)病理診斷或細胞學(xué)診斷證實，其中，漿液性卵巢癌20例，其他8例。根據(jù)FIGO分期，Ⅰ～Ⅱ期9例，Ⅲ～Ⅳ期標本19例。根據(jù)卵巢癌分化程度，G1級5例，G2級10例，G3級13例。根據(jù)采集標本時患者臨床特征分為原發(fā)腹水標本（primary dis?ease，PD，初治患者）及復(fù)發(fā)腹水標本（recurrent dis?ease，RD，經(jīng)過手術(shù)及化療等抗腫瘤治療后復(fù)發(fā)）。年齡在39～75歲，平均年齡60（60.04±9.04）歲（表1）。所有腹水標本收集于卵巢癌患者腹腔穿刺術(shù)后，采用無菌引流袋置于冰中運送進行后續(xù)實驗，并于采集標本前取得了被采集人的知情同意，符合倫理學(xué)規(guī)定。

表1 卵巢癌腹水CD4+CD25+T細胞免疫抑制功能與臨床病理特點的關(guān)系Table 1 Relationship between CD4+CD25+T cell-mediated immu?no-suppression in ascites of OC patients and clinico-pathologic features

1.2 方法

1.2.1 腹水內(nèi)淋巴細胞的獲取 卵巢癌患者無菌腹水標本于4℃，1 500 r/min離心10 min，PBS重懸，經(jīng)40 μm濾器過濾去除細胞團。將75%Ficoll淋巴細胞分離液緩緩置于100%Ficoll淋巴細胞分離液上層，過濾后細胞懸液置于最上層，經(jīng)密度梯度離心法分離腹水內(nèi)淋巴細胞與腫瘤細胞［1］，從而獲取腹水內(nèi)淋巴細胞用于后續(xù)實驗。

腹水內(nèi)CD4+CD25+T細胞的分選及鑒定 獲取腹水內(nèi)淋巴細胞懸液，經(jīng)40μm濾器過濾后細胞計數(shù)，之后采用人CD4+Multisort kit獲得CD4+T細胞，進一步對總CD4+T細胞通過人CD25的磁珠陽性分選，得到CD4+CD25+T細胞以及CD4+CD25-T細胞，操作嚴格按照試劑盒說明進行。分離所得的CD4+CD25+T細胞一部分經(jīng)CD4-FITC單克隆抗體及CD25-PE單克隆抗體雙標，流式檢測濃度均＞90%。

CD4+CD25+T細胞免疫抑制功能及其機制的探究 應(yīng)用1.5 μmol/L的羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（CFSE）標記分選所得CD4+CD25-T細胞（至少0.5×105個細胞），室溫下孵育10 min，用預(yù)冷的胎牛血清終止標記反應(yīng)，熒光顯微鏡下觀察CFSE標記效果。將只含有CFSE標記的CD4+CD25-T細胞組作為對照組，其與自體CD4+CD25+Treg比例為1∶1或者1∶2下共培養(yǎng)，并分別加入/不加中和性抗IL-10單克隆抗體（2 μg/mL）、中和性抗TGF-β1單克隆抗體（20 μg/mL）及中和性抗IL-10單克隆抗體（2 μg/mL）和中和性抗TGF-β1單克隆抗體（20 μg/mL）作為實驗組，其中每組共培養(yǎng)體系內(nèi)均加入人淋巴細胞CD3單克隆抗體（1 μg/mL）、人淋巴細胞CD28單克隆抗體（1 μg/mL）以及人重組IL-2（150 IU/mL）作為激活因子。共培養(yǎng)5 d后，流式細胞儀檢測CFSE表達，并使用Modfit軟件分析CFSE數(shù)據(jù)計算各組增殖指數(shù)（PI），其中對照組抑制率為0，增值率為100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌腹水內(nèi)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞免疫抑制功能與臨床病理特征的關(guān)系

28例卵巢癌患者腹水分選后所得CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞與CFSE標記的自體CD4+CD25-T細胞以1∶1的比例共培養(yǎng)，與僅有CFSE標記的自體CD4+CD25-T細胞的對照組增殖PI相比較，研究顯示，腹水內(nèi)CD4+CD25+Treg免疫抑制功能與患者年齡、病理類型及組織分化程度無關(guān)，而與患者腫瘤分期相關(guān)，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)Modfit軟件測定各組CFSE標記T細胞增殖指數(shù)PI而得出Treg抑制率結(jié)果可見，19例Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌患者腹水內(nèi)Treg抑制自體CD4+CD25-T細胞增殖抑制率為（75.72±17.04）%，而9例Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者腹水內(nèi)Treg抑制率為（59.61±16.97）%，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.027，圖1，表1）。

2.2 初治與復(fù)發(fā)卵巢癌患者腹水CD4+CD25+T細胞免疫抑制功能的差異

15例復(fù)發(fā)卵巢癌患者腹水分選所得CD4+CD25+Treg對自體CD4+CD25-T細胞（比例為1∶1）增殖抑制率為（85.89±7.07）%，較13例初治卵巢癌患者腹水分選所得Treg免疫抑制能力（52.82±8.18）%顯著增強，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000 1，圖2，表2）。另外，卵巢癌患者在不同年齡、病理類型、腫瘤分期及腫瘤分化程度下，初治及復(fù)發(fā)卵巢癌患者腹水內(nèi)Treg免疫抑制功能均有顯著性差異，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表3）。

圖1 不同腫瘤分期卵巢癌患者腹水內(nèi)CD4+CD25+T細胞介導(dǎo)免疫抑制功能的差異Figure 1 Differences of CD4+CD25+Treg-mediated immuno-suppres?sion in ascites of OC patients with different tumor stages

圖2 初治與復(fù)發(fā)卵巢癌患者腹水CD4+CD25+T細胞介導(dǎo)免疫抑制功能的差異Figure 2 Differences of CD4+CD25+T cell-mediated immuno-suppres?sion in ascites of OC patients with primary and recurrent disease

表2 初治與復(fù)發(fā)卵巢癌患者腹水CD4+CD25+T細胞免疫抑制功能的差異Table 2 Differences of CD4+CD25+T cell-mediated immuno-suppres?sion in ascites of OC patients with the primary and recurrent diseases

2.3 卵巢癌患者腹水內(nèi)CD4+CD25+Treg抑制功能機制的體外探究

本研究采用中和性抗IL-10抗體及中和性抗TGF-β1抗體探究卵巢癌腹水CD4+CD25+T細胞介導(dǎo)免疫抑制功能與抑制性細胞細胞因子IL-10及TGF-β1是否相關(guān)。結(jié)果顯示，CD4+CD25+Treg與自體CD4+CD25-T細胞共培養(yǎng)體系內(nèi)加入中和性抗IL-10抗體，在Treg/CD4+CD25-T細胞比例1∶1及1∶2下Treg對CD4+CD25-T細胞增殖抑制率為（44.30±12.04）% 及（55.42±5.11）% ，對 照 組 為（90.26±4.81）%及（76.78±6.11）%，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，P=0.004及 P=0.01，圖 3A）。加入中和性抗TGF-β1抗體的實驗組Treg對CD4+CD25-T細胞增殖抑制率（比例 1∶1，62.63%±6.76%；比例 1∶2，58.42%±3.31%）較對照組抑制率（比例1∶1，88.59%±2.75%；比例1∶2，74.45%±3.33%）增強，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，兩組P=0.004，圖3B）。另外，共同加入中和性抗IL-10抗體及中和性抗TGF-β1抗體的實驗組內(nèi)Treg對自體CD4+CD25-T細胞增殖抑制率在兩者比例為 1∶1及 1∶2下分別為（18.26±2.42）%及（22.69±7.04）%，而對照組抑制率分別為（87.82±2.45）%及（73.15±3.39）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（n=3，兩組P=0.000 1，圖3C）。

表3 不同臨床病理特點下初治及復(fù)發(fā)卵巢癌腹水內(nèi)CD4+CD25+T細胞免疫抑制功能的差異Table 3 Differences of CD4+CD25+T cell-mediated immuno-suppression in ascites of OC patients with primary and recurrent disease based on different clinico-pathologic features

圖3 卵巢癌腹水內(nèi)Treg發(fā)揮免疫抑制功能機制Figure 3 Mechanism for suppression function of Treg obtained from ascites of OC patients

3 討論

腫瘤患者體內(nèi)許多可以被自體T細胞識別的腫瘤相關(guān)抗原目前已經(jīng)被證明是自身的正常組分。通過外周耐受抑制自身反應(yīng)性T細胞活性的機制，也同樣影響著對腫瘤相關(guān)的自身抗原的應(yīng)答，從而參與腫瘤在宿主體內(nèi)發(fā)生和發(fā)展。而腫瘤細胞可以產(chǎn)生一系列逃避抗腫瘤免疫反應(yīng)的機制，其中，CD4+CD25+Treg具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用［1，5］。有研究表明，CD4+CD25+Treg可抑制機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，減弱或抑制疫苗誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫作用［6-7］。多種腫瘤患者外周血及腫瘤局部，調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量增多或比例增加，更是調(diào)節(jié)性T細胞參與腫瘤免疫逃逸的有力佐證［8-9］。有報道指出，觀察卵巢癌患者腫瘤組織內(nèi)CD8+T/Treg的比例比單獨觀察Treg細胞數(shù)量能更好地預(yù)測患者的存活率［10］，預(yù)示Treg與效應(yīng)T細胞相互作用對腫瘤發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有重要作用。

另外，在胃和食管癌的患者外周血中的動態(tài)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)晚期患者的CD4+CD25+Treg比例比早期患者高，手術(shù)切除后Treg比例降低，但是復(fù)發(fā)后Treg又上升［11］。而在頭頸腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過手術(shù)、放化療治療的患者外周血Treg比例較原發(fā)腫瘤患者高，并且抑制功能增強［12］。有研究報道了從正常胰腺組織、不典型增生、原位癌直至進展期胰腺癌患者局部浸潤Treg的表達分布情況，發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤的發(fā)生、進展，Treg數(shù)目、比例逐漸上升，而同時局部浸潤的CD8+CTL則逐步減少乃至消失［13］。而在肝細胞癌的癌前病變、早期腫瘤和腫瘤的進展期，也有報道發(fā)現(xiàn)了完全一致的現(xiàn)象［14］，提示Treg與腫瘤發(fā)生發(fā)展及預(yù)后之間的密切聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)，28卵巢癌患者腹水內(nèi)CD4+CD25+Treg經(jīng)體外研究證實，在比例為1∶1下對自體CFSE標記的CD4+CD25-效應(yīng)性T細胞增殖抑制率與腫瘤分期相關(guān)，Ⅲ～Ⅳ期患者腹水內(nèi)Treg發(fā)揮免疫抑制功能明顯強于Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者腹水內(nèi)Treg（P＜0.05），且Treg發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能與卵巢癌患者年齡、腫瘤病理類型及分化程度無關(guān)。另外，本研究證實復(fù)發(fā)卵巢癌患者腹水內(nèi)CD4+CD25+Treg免疫抑制功能強于初治患者，且在各臨床病理條件下，均具顯著性差異（P＜0.000 1），提示卵巢癌腹水CD4+CD25+Treg免疫調(diào)節(jié)功能與腫瘤進展相關(guān)。

已有研究表明，Treg抑制效應(yīng)性T細胞的機制主要有兩種，即細胞直接接觸機制［15］和分泌抑制性細胞因子如IL-10及TGFβ1等的間接機制［12，15-17］。

在頭頸腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者外周血及腫瘤微環(huán)境內(nèi)Treg發(fā)揮免疫抑制功能與抑制性細胞因子IL-10及TGFβ1相關(guān)［17］。而卵巢癌患者腹腔微環(huán)境內(nèi)Treg發(fā)揮作用的具體機制尚不明確。本實驗通過體外實驗證實，在CD4+CD25+Treg/CD4+CD25-T 細胞比例為1∶1及1∶2共培養(yǎng)體系內(nèi)，無論是使用中合性抗IL-10抗體中和IL-10作用，還是使用中合性抗TGFβ1抗體中和IL-10阻斷TGFβ1作用，或者共同封閉兩種細胞因子作用，都明顯解除了Treg細胞對效應(yīng)性T細胞增殖的抑制作用（P＜0.05），提示卵巢癌腹腔微環(huán)境內(nèi)CD4+CD25+Treg可能通過分泌抑制性細胞因子IL-10及TGFβ1發(fā)揮作用。

綜上所述，卵巢癌腹腔微環(huán)境內(nèi)CD4+CD25+Treg發(fā)揮免疫抑制功能與卵巢癌分期及復(fù)發(fā)相關(guān)，且作用機制與分泌抑制性細胞因子IL-10及TGFβ1相關(guān)，為卵巢癌免疫治療提供一種新的靶點。有關(guān)Treg的研究極大地豐富了人類對于腫瘤免疫和免疫逃逸機制的認識，也為以往多種腫瘤免疫治療方案效果不佳的原因提供了新的解釋，為腫瘤的免疫治療提供更多新的思路。

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