許冠華雷俊華金麗莎陳 喆

1浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州310006 2海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科3浙江省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室

·論 著·

隱丹參酮聯(lián)合順鉑作用于非小細(xì)胞肺癌PC9細(xì)胞的體外研究

許冠華1雷俊華2金麗莎1陳 喆3

1浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州310006 2海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科3浙江省中醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室

目的 觀察隱丹參酮（CPT）聯(lián)合順鉑（DDP）對(duì)非小細(xì)胞肺癌PC9細(xì)胞的抗腫瘤作用及其分子機(jī)制。方法 肺癌PC9細(xì)胞分為對(duì)照組、隱丹參酮組、順鉑組及聯(lián)合用藥組，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖凋亡，免疫印跡技術(shù)、RT-PCR檢測(cè)抗凋亡分子的表達(dá)、STAT3及上游調(diào)控激酶JAK2/SRC蛋白表達(dá)水平及磷酸化水平。結(jié)果 隱丹參酮聯(lián)合順鉑有明顯抑制肺癌PC9細(xì)胞增殖作用（P＜0.05），聯(lián)合用藥組作用于肺癌PC9細(xì)胞24h后，caspase 3和caspase 9及PARP剪切段蛋白表達(dá)明顯增高，高于對(duì)照組及單藥組；聯(lián)合用藥組Mcl-1、Bcl-2、XIAP、survivin抗凋亡蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），STAT3磷酸化Tyr705和ser727水平下降，其上游JAK2磷酸化水平下調(diào)，SRC蛋白及磷酸化水平變化不明顯。結(jié)論 隱丹參酮聯(lián)合順鉑具有協(xié)同抗肺癌PC9細(xì)胞作用，其作用機(jī)制可能是通過抑制STAT3磷酸化Tyr705和ser727表達(dá)水平，進(jìn)而下調(diào)Mcl-1、Bcl-2、XIAP、Survivin蛋白的表達(dá)，上調(diào)caspase 3和caspase 9及PARP剪切段蛋白表達(dá)。

非小細(xì)胞肺癌；PC9細(xì)胞；隱丹參酮；順鉑

目前，肺癌是全世界發(fā)病率和死亡率最高的腫 瘤，5年生存率僅為10%～15%[1-2]。晚期非小細(xì)胞肺癌標(biāo)準(zhǔn)一線治療仍為含鉑兩藥聯(lián)合方案化療[3]，化療對(duì)改善病情有一定效果，但同時(shí)對(duì)正常組織也存在毒性。本研究以隱丹參酮、順鉑單藥及兩藥聯(lián)合作用于肺癌PC9細(xì)胞，探討隱丹參酮聯(lián)合順鉑對(duì)人肺癌PC9細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其作用機(jī)制，為隱丹參酮治療腫瘤尋求理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材與試劑 隱丹參酮購自成都曼思特生物科技有限公司（批號(hào)MUST-11081109）；順鉑購自德州德藥有限公司（批號(hào)130303）；多克隆兔一抗Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bak、Mcl-1、survivin、XIAP、P-STAT3-tyr705/ser727、jak2、P-jak2、src、P-src均購自CST公司；多克隆兔一抗STAT3、β-Actin均購自CST公司；多克隆兔/鼠二抗均購自CST公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒/iTaq Universal SYBR Green Supermix購自Bio-Rad公司杭州寶成生物科技有限公司銷售商。

1.2 細(xì) 胞 PC9細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.3 儀 器 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，Thermo公司；超凈工作臺(tái)，蘇州精華設(shè)備公司；多功能全波長酶標(biāo)儀，Thermo公司；蛋白印記檢測(cè)系統(tǒng)，Bio-Rad公司；超低溫冰箱，SANYO；凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad公司；熒光定量PCR儀，RD公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) PC9細(xì)胞復(fù)蘇后以2×106/mL密度接種于25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞生長至80%～90%時(shí)用0.1%胰酶消化并傳代，選取對(duì)數(shù)生長期的PC9細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 取對(duì)數(shù)生長期的PC9細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)后，按（6～9）×103個(gè)細(xì)胞/200μL/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后，用不同濃度的隱丹參酮、順鉑及隱丹參酮與順鉑聯(lián)合應(yīng)用處理，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔。用MTT法分別檢測(cè)藥物與腫瘤細(xì)胞作用24、48、72h后的吸光度值（OD），各平行孔的OD值取平均數(shù)，將各測(cè)試孔的OD值減去本底OD值。計(jì)算腫瘤細(xì)胞的抑制率：抑制率=（1-給藥孔平均光密度值/對(duì)照組平均光密度值）×100%。

2.3 免疫印跡技術(shù)檢測(cè)藥物作用PC9細(xì)胞凋亡標(biāo)記蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長的PC9細(xì)胞，隱丹參酮、順鉑及聯(lián)合應(yīng)用處理24h后收集，加入細(xì)胞裂解液，冰上放置30min，每10min振蕩1次，離心13 300r/min 15min，取上清，以BSA法作蛋白定量后置-30℃貯存?zhèn)溆?。灌?0%SDS-聚丙烯酰胺凝膠，常規(guī)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗（1:1000），4℃孵育過夜，二抗（1: 1000），室溫孵育2h，ECL顯色。檢測(cè)Cleaved-PARP/ caspase3/caspase9等凋亡標(biāo)記蛋白酶原和剪切活化片段的表達(dá)水平，β-Actin檢測(cè)作為對(duì)照，進(jìn)行細(xì)胞間蛋白表達(dá)的比較。

2.4 免疫印跡技術(shù)、RT-PCR檢測(cè)PC9細(xì)胞抗凋亡分子蛋白表達(dá)水平和凋亡抑制因子基因轉(zhuǎn)錄水平取對(duì)數(shù)生長的PC9細(xì)胞，隱丹參酮、順鉑及聯(lián)合應(yīng)用處理24h后收集，加入細(xì)胞裂解液，冰上放置30min，每10min振蕩1次，13 300r/min離心15min，取上清，以BSA法作蛋白定量后置-30℃貯存?zhèn)溆?。灌?0% SDS-聚丙烯酰胺凝膠，常規(guī)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗（1:1000），4℃孵育過夜，二抗（1:1000），室溫孵育2h，ECL顯色。檢測(cè)抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2、Bcl-xl、survivin、XIAP和促凋亡蛋白Bak、Bax的表達(dá)，β-Actin檢測(cè)作為內(nèi)對(duì)照，進(jìn)行細(xì)胞間蛋白表達(dá)的比較。

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系PC9接種于6孔板，2× 105個(gè)細(xì)胞/孔，培養(yǎng)過夜至對(duì)數(shù)生長期。隱丹參酮組、順鉑組、隱丹參酮/順鉑聯(lián)合組分別作用12h，空白設(shè)為對(duì)照組，TRIZON提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄完成后熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Bcl-2、Survivin凋亡抑制因子基因轉(zhuǎn)錄水平。

2.5 免疫印跡技術(shù)檢測(cè)隱丹參酮聯(lián)合順鉑對(duì)PC9細(xì)胞STAT3及上游調(diào)控激酶Jak2/Src蛋白表達(dá)水平及磷酸化水平 隱丹參酮單藥組、順鉑單藥組、隱丹參酮/順鉑聯(lián)合組處理4h后，空白組設(shè)置為對(duì)照組。RIPA裂解液提取總蛋白，免疫印跡檢測(cè)STAT3及其上游調(diào)控激酶Jak2/Src表達(dá)水平和磷酸化水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用多因素方差分析。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對(duì)PC9細(xì)胞增殖作用的影響 隱丹參酮、順鉑及聯(lián)合用藥作用于PC9細(xì)胞后，MTT結(jié)果發(fā)現(xiàn)隱丹參酮10μM、順鉑5μg/mL具有明顯的協(xié)同抗非小細(xì)胞肺癌PC9細(xì)胞效應(yīng)，且隨著作用時(shí)間的延長，其抑制作用增強(qiáng)。見圖1（封二）。統(tǒng)計(jì)各藥物作用于PC9細(xì)胞存活率，與空白組比較，各用藥組24、48、72h PC9細(xì)胞存活率均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；隱丹參酮+順鉑組細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.05）。見表1。

3.2 PC9細(xì)胞凋亡標(biāo)記性蛋白表達(dá) 隱丹參酮10μM、順鉑5μg/mL及聯(lián)合用藥分別作用于PC9細(xì)胞24h，觀察caspase 3、caspase 9及PARP剪切段蛋白的表達(dá)，β-actin作為內(nèi)參。結(jié)果顯示，隱丹參酮及順鉑單藥組作用于 PC9細(xì)胞后 caspase 3、caspase 9及PARP剪切段蛋白表達(dá)不明顯，而兩藥聯(lián)合組caspase 3和caspase 9及PARP剪切段蛋白表達(dá)明顯增高，見圖2（封二）。

表1 各組PC9細(xì)胞24、48及72h存活率比較（±s） %

表1 各組PC9細(xì)胞24、48及72h存活率比較（±s） %

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與隱丹參酮組和順鉑組比較，△P＜0.05

組別空白對(duì)照組隱丹參酮組順鉑組隱丹參酮+順鉑組n/孔3333 24h 100 92.22±2.75* 85.19±2.4** 47.47±1.62*△48h 100 86.54±1.60* 73.99±0.98** 38.53±2.46**△72h 100 73.89±1.46** 59.14±0.89* 30.49±2.51*△

3.3 PC9細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 隱丹參酮10μM聯(lián)合順鉑5μg/mL作用于PC9細(xì)胞24h下調(diào)Mcl-1、Bcl-2、survivin、XIAP蛋白的表達(dá)，bax、bak、bcl-xl蛋白水平變化不明顯。見圖3（封二）。

3.4 PC9細(xì)胞抗凋亡因子mRNA表達(dá)水平 隱丹參酮組、隱丹參酮+順鉑組作用于PC9細(xì)胞12h，抗凋亡因子Bcl-2、survivinm mRNA表達(dá)水平均下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。隱丹參酮+順鉑組Bcl-2、survivin下調(diào)更顯著（P＜0.05）。見表2。

表2 各組PC9細(xì)胞Bcl-2、survivin比較（±s）

表2 各組PC9細(xì)胞Bcl-2、survivin比較（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與隱丹參酮組和順鉑組比較，△P＜0.05

組別空白對(duì)照組隱丹參酮組順鉑組隱丹參酮+順鉑組n/孔3333 Bcl-2 1 0.89±0.04* 1.22±0.03* 0.48±0.28**△survivin 1 0.82±0.01* 1.33±0.09** 0.32±0.02*△

3.5 藥物作用4h PC9細(xì)胞STAT3及上游調(diào)控激酶JAK2/SRC蛋白表達(dá)水平及磷酸化水平 隱丹參酮10μM聯(lián)合順鉑5μg/mL作用于PC9細(xì)胞4h，STAT3磷酸化Tyr705和ser727表達(dá)水平下降，其上游調(diào)控激酶JAK2磷酸化表達(dá)下降，SRC磷酸化表達(dá)水平變化不明顯，見圖4～5（封二）。

4 討論

隱丹參酮是丹參的脂溶性成分之一，具有菲醌結(jié)構(gòu)，菲醌結(jié)構(gòu)中包含的菲環(huán)結(jié)構(gòu)可與DNA結(jié)合，且呋喃環(huán)和醌類結(jié)構(gòu)可產(chǎn)生自由基，引起DNA損傷，從而抑制腫瘤細(xì)胞DNA的合成[5]。

caspase家族蛋白酶在細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵性作用。陳春雷等[6]研究提示隱丹參酮能明顯抑制人膽管癌HCCC-9810細(xì)胞的增殖，其作用機(jī)制是通過下調(diào)survivin基因表達(dá)及上調(diào)caspase-3蛋白表達(dá)來誘導(dǎo)HCCC-9810細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)，順鉑和隱丹參酮均能抑制肺癌PC9細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，但兩藥聯(lián)合后增殖抑制作用和凋亡誘導(dǎo)作用顯著高于單用順鉑或隱丹參酮，兩藥聯(lián)合進(jìn)一步增加了PC9細(xì)胞caspase 3和caspase 9的活化和PARP剪切段蛋白的表達(dá)，提示隱丹參酮能夠通過調(diào)控caspases家族增強(qiáng)順鉑對(duì)肺癌PC9細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用。

信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移侵襲、腫瘤新生血管生成、化療抗性密切相關(guān)[7]。STAT3蛋白通過SH2結(jié)構(gòu)域相互結(jié)合形成二聚體，迅速移位至核內(nèi)，與特異的DNA啟動(dòng)子序列結(jié)合，啟動(dòng)相應(yīng)的基因如抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-Xl、Mcl-1、Xiap和survivin、細(xì)胞周期調(diào)控基因cyclin D1和c-myc、血管生成因子VEGF、基質(zhì)金屬酶mmp2/9表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、存活、凋亡抗性、腫瘤新生血管形成及轉(zhuǎn)移侵襲[8]。應(yīng)用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)Bcl-2家族成員表達(dá)，提示隱丹參酮聯(lián)合順鉑下調(diào)Mcl-1、Bcl-2、survivin、XIAP蛋白表達(dá)。

最新研究發(fā)現(xiàn)[9]，抑制STAT3酪氨酸Tyr705水平可阻斷腫瘤細(xì)胞異?；罨腟TAT3信號(hào)通路，進(jìn)而促腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤新生血管形成和轉(zhuǎn)移侵襲，與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用可發(fā)揮增效減毒的功效。

本研究結(jié)果顯示，隱丹參酮聯(lián)合順鉑作用于PC9細(xì)胞通過抑制STAT3磷酸化Tyr705和ser727表達(dá)水平進(jìn)而下調(diào)Mcl-1、Bcl-2、XIAP、Survivin蛋白的表達(dá)及Bcl-2、Survivin的基因轉(zhuǎn)錄水平；提示隱丹參酮聯(lián)合順鉑協(xié)同抗腫瘤機(jī)制與其通過抑制STAT3磷酸化途徑有關(guān)。今后將在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究其抗腫瘤的深層次機(jī)制，為隱丹參酮聯(lián)合順鉑開發(fā)為臨床用藥提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of Cryptotanshinone Combined with Cisplatin on Non-small-cell Lung Cancer Cell PC9

XU Guan-hua1，LEI Junhua2，JIN Lisha1，CHEN Zhe3. 1.Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou（310006），China；2.Department of Oncology,Hospital affiliated to Hainan Medical College；3.Central Laboratory，Zhejiang Provincial Hospital of TCM.

Objective To study the effect of cryptotanshinone in combination of cisplatin on non-small-cell lung cancer（NSCLS）cell PC9 and its underlying molecular mechanism.Methods PC9 cells were divided into four groups:control,cryptotanshinone,cisplatin,and the combination of cryptotanshinone and cisplatin,the cells in each group were treated with the corresponding drugs.Apoptosis was assayed by MTT;protein markers of apoptosis and the protein expression and phosphorylation of STAT3 and JAK2/SRC were detected by immunoblotting and RTPCR.Results Cryptotanshinone combined with cisplatin significantly inhibited the proliferation of lung cancer PC9 cells（P＜0.05）.After treated with the combination of cryptotanshinone and cisplatin for 24h,the expression of cleaved caspase 3,cleaved caspase 9 and cleaved PARP in PC9 cells were significantly higher than that of control group and single drug groups;compared to other groups,the expression of protein markers of apoptostic Bcl-2,Mcl-1 and XIAP were reduced,STAT3 phosphorylation on Tyr705 and ser727 was decreased,and the upstream JAK2 phosphorylation level was lowered in the combination group（P＜0.05 or P＜0.01）,but the protein expression and phosphorylation of SRC did not differ.Conclusion Cryptotanshinone combined with cisplatin has synergistic effect on PC9 cells,which may be done by inhibiting the expression of STAT3 phosphorylation on Tyr705 and ser727, then downregulating the expression of Mcl-1,Bcl-2,XIAP and Survivin proteins and increasing the expression of cleaved caspase3,cleaved caspase 9,and cleaved PRAP.

non-small-cell lung cancer；PC9 cells；cryptotanshinone；cisplatin

2014-06-07

修回日期：2014-08-01

浙江省自然科學(xué)基金（No.LY13H290014）