吳健　侯和勝

摘 要：啟動(dòng)子是控制植物基因表達(dá)的重要DNA序列結(jié)構(gòu)，本文從高等植物ACO基因啟動(dòng)子克隆、順式作用元件分析及GUS基因表達(dá)等方面著眼，綜述該領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：乙烯；ACO啟動(dòng)子；順式作用元件；GUS基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.04.005

作為植物氣體激素，乙烯廣泛存在于植物的各個(gè)器官和組織中，對(duì)植物種子萌發(fā)、根毛萌發(fā)、植物開花、果實(shí)成熟、器官衰老等有廣泛的影響。同時(shí)乙烯在植物生物和非生物脅迫的響應(yīng)中也起到重要的作用，如機(jī)械傷害、冷害、漬水、病原菌入侵等方面，因此，抑制乙烯的產(chǎn)生可使許多重要農(nóng)產(chǎn)品的運(yùn)輸和貯藏更為方便，同時(shí)也延長了貨架期，可以增值增效。

早在1984年，Yang和Hoffman[1]就闡明了乙烯的合成途徑，見圖1。ACC氧化酶是乙烯生物合成途徑的關(guān)鍵酶，其在植物組織內(nèi)的產(chǎn)量和活性往往決定乙烯產(chǎn)生的速率，因此，研究ACO基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制對(duì)全面了解乙烯對(duì)植物的生理效應(yīng)及化控機(jī)理具有重要的意義。筆者主要闡述了高等植物ACO基因啟動(dòng)子的研究進(jìn)展，以期為今后ACO基因啟動(dòng)子的研究提供有價(jià)值的參考。

1 ACO基因啟動(dòng)子的克隆

啟動(dòng)子在基因表達(dá)調(diào)控中起著重要的作用，目前，對(duì)植物ACO基因啟動(dòng)子的研究主要集中在果實(shí)相關(guān)基因啟動(dòng)子上，研究較深入的有番茄E4基因、E8基因、多聚半乳糖酸酶（PC）基因和2A11基因、蘋果ACO1基因啟動(dòng)子，這些啟動(dòng)子都與果實(shí)成熟過程中的基因表達(dá)有關(guān)，但彼此同源性很小，在29%以下[2]。除了番茄外，也相繼從其他多種植物中克隆了ACO基因啟動(dòng)子（表1）。香蕉果實(shí)特異性ACO1啟動(dòng)子序列與Genbank中其他的植物果實(shí)相關(guān)基因啟動(dòng)子相比較，相似性很低，為19.9%～22.3%。其中與蘋果果實(shí)中表達(dá)的ACO基因啟動(dòng)子的相似性為20.0%；蘋果果實(shí)ACO啟動(dòng)子中有一段64 bp的正向重復(fù)序列，但與香蕉ACO1啟動(dòng)子的55 bp正向重復(fù)序列并無相似性，說明不同植物中功能相似的基因，其啟動(dòng)子間可能存在著很大的不同[3]。

2 ACO基因啟動(dòng)子順式作用元件

啟動(dòng)子序列結(jié)構(gòu)具有差異性，不同物種、不同組織中的啟動(dòng)子序列結(jié)構(gòu)并不相同[5]。一般的啟動(dòng)子序列由核心元件及上游元件組成，前者主要包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）及TATA-box，大部分高等植物啟動(dòng)子都含有TATA-box；上游元件又分為一般上游元件如CAAT-box和GC-box和特殊上游元件如G-box等[6]。研究表明，多數(shù)參與逆境脅迫應(yīng)答的基因啟動(dòng)子序列中還存在一些特殊的順式作用元件，如病蟲害脅迫響應(yīng)元件、高鹽脅迫響應(yīng)元件、干旱脅迫響應(yīng)元件等[7]。

在對(duì)歐洲葡萄、香蕉等植物ACO啟動(dòng)子順式作用元件的分析，發(fā)現(xiàn)了不同的順式作用元件（表2），其中TATA-box、G-box、CAAT-box在歐洲葡萄、香蕉ACO啟動(dòng)子中均存在，還發(fā)現(xiàn)在歐洲葡萄ACO2和香蕉ACO1啟動(dòng)子中都存在熱響應(yīng)元件HSE和茉莉酸甲酯響應(yīng)元件TGACG-motif，說明不同植物ACO基因啟動(dòng)子間可能存在相類似的功能，例如在熱響應(yīng)、植物激素響應(yīng)應(yīng)答中起調(diào)控作用。而它們中也存在一些不同的順式作用元件，例如在歐洲葡萄ACO1、ACO2啟動(dòng)子中都含有赤霉素響應(yīng)元件TATC-box，而香蕉ACO1啟動(dòng)子中沒有；在歐洲葡萄ACO1、香蕉ACO1啟動(dòng)子中含有脫落酸響應(yīng)元件ABRE，而歐洲葡萄ACO2啟動(dòng)子中沒有；說明不同植物的ACO啟動(dòng)子或相同植物不同ACO基因的啟動(dòng)子，其含有的順式作用元件有差別，它們的功能可能也有不同。

3 ACO基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因表達(dá)

將不同植物ACO基因的啟動(dòng)子片段與GUS報(bào)告基因連接，導(dǎo)入植物細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)不同植物的不同器官中表達(dá)差異很大。

經(jīng)GUS組織化學(xué)檢測(cè)后，90%甜瓜陽性轉(zhuǎn)化植株的花藥和80%甜瓜陽性轉(zhuǎn)化植株的成熟果皮被X-Gluc染成藍(lán)色，而對(duì)照（未轉(zhuǎn)化植株）與葉、莖、根、幼果中均未出現(xiàn)藍(lán)色，說明甜瓜ACO1基因的啟動(dòng)子能夠調(diào)控GUS基因在轉(zhuǎn)基因甜瓜的花藥和成熟果實(shí)的果皮組織中表達(dá)，而不能調(diào)控在葉、莖、根、幼果中表達(dá)。在果實(shí)成熟期（在植株上未采摘之前），GUS基因首先在果皮中表達(dá)，而在果肉中未檢測(cè)到表達(dá)，說明甜瓜果實(shí)成熟過程中，果皮中GUS基因的表達(dá)，促進(jìn)了乙烯的生物合成與果皮的成熟老化，使果實(shí)的硬度和貯運(yùn)性降低[8]。

桃ACO1基因的啟動(dòng)子能夠調(diào)控GUS基因在轉(zhuǎn)基因番茄和桃的葉片、子房、葉和果實(shí)的脫落區(qū)、果皮組織中表達(dá)，并且通過丙烯和機(jī)械傷害正向調(diào)節(jié)。桃ACO2基因啟動(dòng)子能夠調(diào)控GUS基因在幼嫩的維管束、成熟的果實(shí)、衰老的葉片、果實(shí)和葉的脫落區(qū)組織中表達(dá)[9]。番茄ACO1啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因番茄中的成熟果實(shí)的果皮、衰老葉柄的脫落區(qū)、未受精的花、機(jī)械傷害部位中表達(dá)。這些結(jié)果表明，ACC氧化酶在轉(zhuǎn)錄水平上能夠調(diào)控多種不同發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞類型和應(yīng)對(duì)一些外界刺激[10]。

4 結(jié) 語

乙烯代謝途徑是植物重要的代謝途徑，其相關(guān)酶基因的分子生物學(xué)研究越來越受重視。啟動(dòng)子作為一種基因表達(dá)的重要順式作用元件，從1983年第一株轉(zhuǎn)基因植物問世以來，一直是基因工程中的研究熱點(diǎn)。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，將會(huì)有更多植物的ACO基因的啟動(dòng)子被研究，從而使乙烯代謝途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理得到更深入的了解，相信會(huì)有更多、更好的通過調(diào)控內(nèi)源乙烯生物合成的轉(zhuǎn)基因的新品種出現(xiàn)，從而增加人們對(duì)植物基因表達(dá)調(diào)控的理解和認(rèn)識(shí)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Yang S F， Hoffman N E.Ethylene biosynthesis and regulation in higher plants[J].Annu Rev Plant Physiol，1984，35：155-189.

[2] 陳銀華，黃偉，王海.ACC氧化酶基因研究進(jìn)展[J].海南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，24（2）：194-199.

[3] 王新力，彭雪賢.香蕉果實(shí)成熟相關(guān)基因ACO1啟動(dòng)子區(qū)的克隆及其功能初探[J].生物工程學(xué)報(bào)，2001，17（4）：428-431.

[4] Atkinson R G， Bolitho K M， Wright M A， et al. Apple ACC-oxidase and polygalacturonase：Ripening-specific gene expression and promoter analysis in transgenic tomato[J].Plant Molecular Biology，1998，38（3）：449-460.

[5] 夏江東，程在全，吳渝生，等.高等植物啟動(dòng)子功能和結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，21（1）：7-14.

[6] 王穎，麥維軍，梁承鄴，等.高等植物啟動(dòng)子的研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報(bào)，2003，23（11）：2 040-2 048.

[7] 聶麗娜，夏蘭琴，徐兆師，等.植物基因啟動(dòng)子的克隆及其功能研究進(jìn)展[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2008，9（3）：385-391.

[8] 毛娟，陸璐，陳佰鴻，等.甜瓜CmACOⅠ啟動(dòng)子組織特異性表達(dá)研究[J].園藝學(xué)報(bào)，2013，40（6）：1 101-1 109.

[9] Rasoria A， Bertolasib B， Furini A， et al.Functional analysis of peach ACC oxidase promoters in transgenic tomato and in ripening peach fruit[J].Plant Science，2003， 165（3）：523-530.

[10] Blume B， Grierson D. Expression of ACC oxidase promoter-GUS fusions in tomato and Nicotiana plumbaginifolia regulated by developmental and environmental stimuli[J].The Plant Journal，1997，12（4）：731-746.

[2] 陳銀華，黃偉，王海.ACC氧化酶基因研究進(jìn)展[J].海南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，24（2）：194-199.

[3] 王新力，彭雪賢.香蕉果實(shí)成熟相關(guān)基因ACO1啟動(dòng)子區(qū)的克隆及其功能初探[J].生物工程學(xué)報(bào)，2001，17（4）：428-431.

[4] Atkinson R G， Bolitho K M， Wright M A， et al. Apple ACC-oxidase and polygalacturonase：Ripening-specific gene expression and promoter analysis in transgenic tomato[J].Plant Molecular Biology，1998，38（3）：449-460.

[5] 夏江東，程在全，吳渝生，等.高等植物啟動(dòng)子功能和結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，21（1）：7-14.

[6] 王穎，麥維軍，梁承鄴，等.高等植物啟動(dòng)子的研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報(bào)，2003，23（11）：2 040-2 048.

[7] 聶麗娜，夏蘭琴，徐兆師，等.植物基因啟動(dòng)子的克隆及其功能研究進(jìn)展[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2008，9（3）：385-391.

[8] 毛娟，陸璐，陳佰鴻，等.甜瓜CmACOⅠ啟動(dòng)子組織特異性表達(dá)研究[J].園藝學(xué)報(bào)，2013，40（6）：1 101-1 109.

[9] Rasoria A， Bertolasib B， Furini A， et al.Functional analysis of peach ACC oxidase promoters in transgenic tomato and in ripening peach fruit[J].Plant Science，2003， 165（3）：523-530.

[10] Blume B， Grierson D. Expression of ACC oxidase promoter-GUS fusions in tomato and Nicotiana plumbaginifolia regulated by developmental and environmental stimuli[J].The Plant Journal，1997，12（4）：731-746.

[2] 陳銀華，黃偉，王海.ACC氧化酶基因研究進(jìn)展[J].海南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，24（2）：194-199.

[3] 王新力，彭雪賢.香蕉果實(shí)成熟相關(guān)基因ACO1啟動(dòng)子區(qū)的克隆及其功能初探[J].生物工程學(xué)報(bào)，2001，17（4）：428-431.

[4] Atkinson R G， Bolitho K M， Wright M A， et al. Apple ACC-oxidase and polygalacturonase：Ripening-specific gene expression and promoter analysis in transgenic tomato[J].Plant Molecular Biology，1998，38（3）：449-460.

[5] 夏江東，程在全，吳渝生，等.高等植物啟動(dòng)子功能和結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，21（1）：7-14.

[6] 王穎，麥維軍，梁承鄴，等.高等植物啟動(dòng)子的研究進(jìn)展[J].西北植物學(xué)報(bào)，2003，23（11）：2 040-2 048.

[7] 聶麗娜，夏蘭琴，徐兆師，等.植物基因啟動(dòng)子的克隆及其功能研究進(jìn)展[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2008，9（3）：385-391.

[8] 毛娟，陸璐，陳佰鴻，等.甜瓜CmACOⅠ啟動(dòng)子組織特異性表達(dá)研究[J].園藝學(xué)報(bào)，2013，40（6）：1 101-1 109.

[9] Rasoria A， Bertolasib B， Furini A， et al.Functional analysis of peach ACC oxidase promoters in transgenic tomato and in ripening peach fruit[J].Plant Science，2003， 165（3）：523-530.

[10] Blume B， Grierson D. Expression of ACC oxidase promoter-GUS fusions in tomato and Nicotiana plumbaginifolia regulated by developmental and environmental stimuli[J].The Plant Journal，1997，12（4）：731-746.