陳瑤+王火旭

摘 要：概述了根腫病的危害與發(fā)生、病原菌的基本特征、病原菌的分離提純與人工接種方法以及十字花科大白菜抗根腫病的研究等。

關(guān)鍵詞：根腫??；蕓薹根腫菌；抗根腫病

中圖分類號：S436.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.04.020

根腫病是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae） 引起的一種十字花科（Cruciferae）植物的世界性病害。該病于1737年首次發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已蔓延至全世界，在溫帶地區(qū)此病發(fā)生率最高[1]。感病植物有花莖甘藍(lán)、白菜、蕪菁、花椰菜、芥菜、蘿卜、撇藍(lán)等。作為一種土傳病害，根腫病的病原菌在土壤中的存活時間能達(dá)到8年以上[2]。休眠孢子在無感病寄主植物的土壤中甚至可以存活20年[3]。近些年 ，該病的發(fā)病率持續(xù)升高，根腫病發(fā)生帶來的直接后果就是十字花科植物大面積減產(chǎn)，嚴(yán)重影響蔬菜的產(chǎn)量。

1 根腫病病原

根腫病的病原菌為蕓薹根腫菌。該病原菌屬根腫菌目。關(guān)于根腫菌目的分類地位，目前尚有爭議。但可根據(jù)Ainsworth在《菌物詞典》中所述，將此病原分為原生動物界、根腫菌門、根腫菌綱、根腫菌目、根腫菌科、根腫菌屬、蕓薹根腫菌[4]。根腫病菌的休眠孢子大小3.5 μm左右，萌發(fā)產(chǎn)生游動孢子。游動孢子直徑2.5～3.5 μm，前端有兩根長短不等的鞭毛，在水中能游動，靜止后呈變形體狀。

2 根腫病的發(fā)生

根腫菌病原菌主要危害十字花科植物的根部。休眠孢子在適宜的條件下萌發(fā)成游動孢子，游動孢子侵入寄主組織的根毛，進而進入寄主細(xì)胞內(nèi)并形成變形體。受侵染后的根組織大量增生，主根和側(cè)根形成數(shù)目和大小不等的膨大腫瘤。腫瘤的產(chǎn)生影響根的正常生長以及吸收能力。發(fā)病初期，植物地上部分幾乎不受影響，只在高溫晴朗天氣時表現(xiàn)出葉片下垂、萎蔫，晚上就能恢復(fù)。后期，植物的病情加重，生長遲緩，葉片變黃，甚至脫落，形成永久性的萎蔫，嚴(yán)重的使植物死亡。病根中的休眠孢子囊在腫根腐爛后會殘留在土壤內(nèi)，以待再次侵染以及度過不良環(huán)境[5]。根腫菌休眠孢子萌發(fā)的溫度為10～30 ℃，最適溫度24 ℃，致死溫度45 ℃。土壤相對濕度為60%～98%時最利于發(fā)病。太干的土壤不利于發(fā)病。此外，弱酸性的土壤最利于發(fā)病，最適pH值為5.4～6.5，pH值大于7.2時病害發(fā)生減輕。

3 根腫菌的分離提純

根腫病菌是一種寄生在植物組織中的專性寄生菌，不能獨立生長。這就給對它的研究增加了難度，所以菌體的分離提純成為研究根腫菌的重要技術(shù)。關(guān)于根腫菌的提純，Macfarlane[6]最早采用的方法是，將根腫組織研磨、過濾，反復(fù)離心后得到根腫菌休眠孢子。但若長期保存，懸浮液中其他微生物的存在和繁殖會對休眠孢子產(chǎn)生影響。Castlebury[7] 在Macfarlane方法的基礎(chǔ)上提出了一種提純根腫菌的改進方法。從被浸染的根系組織中提取根腫菌，通過一系列的離心，用50%的蔗糖溶液和蒸餾水離心之后，再通過連續(xù)梯度的LUDOX（硅溶膠，二氧化硅懸浮在NaOH中，pH=9.8）。此法能夠提取純凈的根腫菌休眠孢子并且能夠長期保存。楊佩文[8]提純根腫菌時通過研磨、過濾、反復(fù)離心，在沉淀中加50%的蔗糖溶液懸浮后離心取上清。這樣，可以除去休眠孢子中混有的細(xì)菌、植物根組織、淀粉、土壤顆粒以及其他微生物等雜質(zhì)，分離到較純的休眠孢子提取液。鄧潔等[9]認(rèn)為孢囊是孢子在植物組織中的存在形式，提純后仍會有粘連，采用蔗糖梯度方法不能實現(xiàn)植物碎片和雜菌的完全去除，4 ℃下雜菌會增殖，LUDOX方法準(zhǔn)備復(fù)雜，而濾膜法又使孢子大量損失，從而提出采用蔗糖梯度離心與超聲波破碎法結(jié)合來純化孢子。這能在較短時間內(nèi)獲得高純度的休眠孢子，在細(xì)菌培養(yǎng)基上只有一種雜菌即枯草芽孢桿菌休眠體。

4 根腫菌的人工接種

由于根腫菌是專性寄生菌，所以建立穩(wěn)定的帶菌活體系統(tǒng)尤為重要。目前，針對十字花科根腫病的接種方法有以下幾種。

（1）注射法。丁云花[2]認(rèn)為此法簡便易行且效果好。具體做法為：取新鮮或-18 ℃低溫保存的發(fā)病根組織，攪碎，經(jīng)紗布過濾后反復(fù)離心。棄去上清，用蒸餾水懸浮沉淀物，將接種液調(diào)至孢子濃度為1×108個· L-1的懸浮液。將發(fā)芽的種子播于消毒土中。取接種液2 mL注射于根際基質(zhì)。

（2）蘸根法。Williams[10] 認(rèn)為該法最好。先制備根腫菌孢子接種液，然后將10 d左右苗齡的無病蟲幼苗取出，根部用水洗凈，吸干水分。將根部浸入接種液中浸泡數(shù)小時后，將幼苗移植回原來的培養(yǎng)基質(zhì)中。

（3）菌土法。用珍珠巖作基質(zhì)，將菌根磨碎并均勻混于無菌土中，放入珍珠巖基質(zhì)事先挖好的小穴中。然后將出芽的種子移栽到菌土中。黃蓉[11]又將菌土法分為普通菌土法、密封菌土法、浸種+菌土法、浸種+密封菌土法4種方法。普通菌土法即將根腫組織打碎，菌根和土按1∶200（W/W）的比例混合成含水量為60%左右、pH值為5.5的菌土。白菜種子均勻播撒在含菌土的育苗塑料盤中。密封菌土法同普通菌土法相同，只是用塑料膜將配好的菌土密封，48 h后填入育苗塑料盤中。浸種法即種子在菌液中浸泡5 h后，再均勻播撒在育苗塑料盤中。試驗結(jié)果表明，各種接種方法都能使白菜感病，但接種效果因方法不同而表現(xiàn)出差異。密封菌土法接種優(yōu)于普通菌土法。浸種法接種效果雖然低，但浸種法與密封菌土法復(fù)合接種法發(fā)病率和病情指數(shù)高，為最佳的接種方法。

5 大白菜抗根腫病的研究

由于根腫病危害損失大，防治困難?？垢[病的研究就顯得尤為重要。

早在1989年，日本的吉川宏昭[12]就將抗病蕪菁77 b、ECD2號選系與感病的結(jié)球白菜松島新2號雜交，將抗性基因轉(zhuǎn)育到結(jié)球白菜上。得到F1、F2和回交一代、二代的群體。F1完全抗病，F(xiàn)2抗病和感病的分離比例為3∶1， 回交一代的分離比例為1∶1，回交二代都是抗病的。該研究表明，77 b的抗性是由顯性基因控制的，該基因可用于培育白菜類作物的抗根腫病品種，特別是結(jié)球白菜。譚翀等[13]從云南省玉溪和安寧地區(qū)的患病白菜根中采菌，并用菌土法對來自國內(nèi)外的18個抗根腫病大白菜品種進行抗病性鑒定。結(jié)果表明：CR-惠民、康根51和泰能舒根3個品種發(fā)病率分別為0，0，4%，對該生理小種均有抗性。且CR-惠民和康根51的田間經(jīng)濟性狀優(yōu)良，可作為云南省安寧、玉溪地區(qū)大白菜抗根腫病育種的材料。張敬文等[14]人發(fā)現(xiàn)外形美觀、豐產(chǎn)的新品種CR589大白菜為抗根腫病大白菜。該種于2008—2010年分別在山東、云南、貴州、湖北以及四川等地進行了3季多點抗性試驗。結(jié)果表明，該品種均抗根腫病、且同時抗病毒病和軟腐病。胡靖鋒等[15]用菌土法對從云南地區(qū)得到的110 份十字花科作物做抗根腫病鑒定。結(jié)果表明：蕪菁表現(xiàn)為高抗，它對根腫病的抗性要高于其他種類材料，甘藍(lán)類材料和甘藍(lán)型油菜材料間抗性無差異，花椰菜及青花菜材料對根腫病的抗性最弱。目前，日本和韓國使用的抗源基因均來自歐洲飼用蕪菁。

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)的聶凱[16]利用細(xì)胞核雄性不育“復(fù)等位基因”遺傳假說，將“msmsrr”基因型大白菜品系轉(zhuǎn)育成抗根腫病雄性不育系，育成了經(jīng)濟性狀優(yōu)良的抗根腫病雄性不育甲型“兩用系”和臨時保持系。耿新翠[17]在此基礎(chǔ)上，以抗根腫病普通心甲型雄性不育“兩用系”和桔紅心自交系為試材，進行了抗根腫病桔紅心大白菜核基因雄性不育系的轉(zhuǎn)育，實現(xiàn)了抗根腫病、桔紅心和核不育源的綜合利用。陳慧慧[18]篩選出與大白菜抗根腫病基因CRb緊密連鎖的分子標(biāo)記，并將CRb基因定位在0.18 cM的2個有較高通用性的共顯性標(biāo)記之間。她指出，大白菜抗根腫病基因有8個，分別有Crr1、Crr2、Crr3、Crr4、CRa、CRb、CRc和CRk。利用抗根腫病（clubroot resistance，CR）基因培育抗病品種是防治大白菜根腫病的最經(jīng)濟而且有效的方法。

6 總結(jié)與展望

迄今，我國對于十字花科根腫病的研究尚處于初級階段。該病具有遺傳機理復(fù)雜，發(fā)病后波及范圍廣，侵染后難以徹底根除等特點。而且引發(fā)該病的病原菌蕓薹根腫菌不能被離體培養(yǎng)，必須寄生在十字花科植物的根部才能夠萌發(fā)。這就導(dǎo)致研究的培養(yǎng)周期長，難度大。以目前的分離提純技術(shù)，在培養(yǎng)基中建立穩(wěn)定的帶菌活體系統(tǒng)難度大。這些都為根腫菌的科學(xué)研究帶來很大的難度。雖然近些年陸續(xù)有許多抗病品種被發(fā)現(xiàn)，但還存在局限性，未能成功的大范圍普及來對抗根腫病。通過開發(fā)藥物和土壤連做耕種的方法來防治根腫病也只能夠相對減輕植株發(fā)病的程度，并不能徹底根除。因此，當(dāng)前需要研究的主要內(nèi)容有：（1）進一步了解該病的致病機理，從分子水平徹底杜絕該病的發(fā)生；（2）尋找抗病基因，通過培育有效的抗病基因品種來防治該病的發(fā)生[19]；（3）篩選高效的抗病或耐病品種[20]。我國現(xiàn)階段在根腫病的研究和防治方面雖然取得了一定的成果，但沒有從根本上徹底消除該病的危害，因此，對抗根腫病的任務(wù)任重而道遠(yuǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Karling J S. The plasmodiophorales [M].New York：Hafner Publishing Co， 1968.

[2] 丁云花，簡元才.十字花科蔬菜根腫病菌生理小種及接種方法[J].中國蔬菜，2005（8）：29-31.

[3] 王靖，黃云，李小蘭，等.十字花科根腫病研究進展[J].植物保護，2011，37（6）：153-158.

[4] Ainsworth G C. Ainsworth and bisbys dictionary of the fungi[M].8th Ed. London： Comm onwealth Mycological Institute，1995：616.

[5] 司軍，李成瓊，任雪松，等.十字花科植物根腫病及抗根腫病育種研究進展[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2002，15（2）：69-72.

[6] Macfarlane I. A solution-culture technique for obtaining root-hair， or primary， infection by Plasmodiophora brassicae[J]. Journal of General Microbiology， 1958， 18（3）： 720-732.

[7] Castlebury L A，Maddox J V，Glawe D A. A technique for the extraction and purification of viable Plasmodiophora brassicae resting spores from host root tissue[J]. Mycologia，1994， 86（3）：458-460.

[8] 楊佩文，李家瑞，楊勤忠， 等.十字花科蔬菜根腫病菌休眠孢子的分離與檢測[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2002（3）：301-302，306.

[9] 鄧潔，程龍，劉誼. 根腫（ Plasmodiophora brassicae ）休眠孢子的純化和超聲波破碎方法研究[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2006，12 （2）： 269-272.

[10] Willams P H.Screening crucifers for multiple disease resistance crucifer workshop [M].Madison： University of Wisconsin，1981：168.

[11] 黃蓉，黃瑞榮，華菊玲.小白菜根腫病的接種方法及條件研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28（31）：252-255.

[12] 吉川宏昭.日本十字花科作物的抗根腫病育種[J].中國蔬菜，1989（3）：55-56.

[13] 譚翀，岳艷玲.不同大白菜品種對根腫病的抗性鑒定[J].中國蔬菜，2013（8）：91-94.

[14] 張敬文，張敬武，孫明遠(yuǎn).抗根腫病大白菜新品種CR589的選育[J]. 長江蔬菜，2013（10）：16-17.

[15] 胡靖鋒，吳麗艷，林良斌，等.用菌土接種法鑒定云南省主要十字花科作物對根腫病的抗性[J].中國蔬菜，2010（14）：71-74.

[16] 聶凱.將“msmsrr”基因型大白菜轉(zhuǎn)育成抗根腫病雄性不育系的研究[D].沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[17] 耿新翠.抗根腫病桔紅心大白菜雄性不育系轉(zhuǎn)育方法研究[D].沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[18] 陳慧慧.大白菜抗根腫病 CRb 基因緊密連鎖標(biāo)記的開發(fā)與定位[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（17）：3 551-3 557.

[19] 許磊，李宏博，林榮杓，等.大白菜的適宜AFLP-Pst Ⅰ/Mse Ⅰ引物組合[J].華北農(nóng)學(xué)報，2009（4）：96-101.

[20] 王淼，王劍，李宏博，等.利用抗、染根腫病F_2群體構(gòu)建大白菜AFLP遺傳連鎖圖譜[J].華北農(nóng)學(xué)報，2009（2）：64-70.