李昌靈 ， 楊海麟 ， 李宇佶 ， 王 武 *

（1.江南大學(xué) 教育部工業(yè)微生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.懷化學(xué)院 生命科學(xué)系，湖南 懷化418008）

小球藻屬綠藻門 （Chlorophyta），小球藻屬（Chlorolla），是一類普生性單細(xì)胞微藻[1]。小球藻廣泛分布于淡水和海水中。小球藻除利用光能和無機(jī)碳（如CO2和碳酸鹽等）進(jìn)行光合自養(yǎng)以外，還可利用一種或多種有機(jī)物作為能源和碳源在黑暗中生長(zhǎng)[2-3]，即進(jìn)行異養(yǎng)發(fā)酵。小球藻富含油脂、蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素、食用纖維、微量元素和其它生物活性物質(zhì)[4]，具有降血壓、降血脂，抗動(dòng)脈粥樣硬化，增強(qiáng)免疫力，抗腫瘤以及抗病毒感染等保健功能[5]。小球藻為具保健功能的健康食品，其促進(jìn)健康主要營(yíng)養(yǎng)組分之一為蛋白質(zhì)或氨基酸[6]。蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)是評(píng)價(jià)小球藻營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的主要因素之一。小球藻細(xì)胞中蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16.0%~58.0%，且不同營(yíng)養(yǎng)因素及培養(yǎng)條件影響蛋白生物合成[7-8]。小球藻生長(zhǎng)和細(xì)胞組分（如，蛋白和油脂等）不僅受到培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)元素調(diào)控，而且受到環(huán)境條件影響。目前，營(yíng)養(yǎng)方式對(duì)小球藻油脂合成研究較多[2，9-10]。而營(yíng)養(yǎng)方式影響小球藻細(xì)胞生物合成蛋白及氨基酸的研究報(bào)道較少。作者研究考察3種發(fā)酵方式對(duì)小球藻細(xì)胞生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)及氨基酸合成的影響，以探索通過改變營(yíng)養(yǎng)方式調(diào)控小球藻胞內(nèi)蛋白含量及氨基酸組分的實(shí)現(xiàn)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小球藻（Chlorella vugaris）藻株 C9-JN2010：作者所在實(shí)驗(yàn)室從海水中分離并經(jīng)過人工選育獲得；培養(yǎng)基為修改Chu's Medium （MCM）培養(yǎng)基組分（mg·L-1）[11]；Nile red Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品；過硫酸鉀：愛建德固賽（上海）引發(fā)劑有限公司產(chǎn)品。

YXQ-LS-50S1型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；ZHWY200B型搖床：上海智城分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；DHP-2000型電熱恒溫培養(yǎng)箱：天津市華北實(shí)驗(yàn)有限公司產(chǎn)品；水平層流凈化工作臺(tái)：蘇州潔凈技術(shù)研究所產(chǎn)品；分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；F-4600熒光分光光度計(jì)，U3900紫外分光光度計(jì)：日立公司產(chǎn)品；1100 HPLC：美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

1.2.1 種子培養(yǎng)方法 挑取平板上培養(yǎng)藻株至含有1.0 mL dd H2O的2 mL離心管中，混合均勻。分別取適量藻接種于含有50.0 mL MCM培養(yǎng)基的250 mL三角燒瓶中，置于恒溫光照搖床中振蕩培養(yǎng)（培養(yǎng)條件為：25±1 ℃，光照強(qiáng)度 4 000 lux，光暗周期為 16 h∶8 h，pH 為 7.0）。

1.2.2 自養(yǎng)、混養(yǎng)與異養(yǎng)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 分別在1.0 L MCM中添加2.0 g NaHCO3進(jìn)行自養(yǎng)培養(yǎng)和添加5.0 g葡萄糖進(jìn)行異養(yǎng)及混養(yǎng)培養(yǎng)。將藻種接種于裝有150 mL MCM的500 mL搖瓶中，調(diào)整pH為7.0，初始接種量干重為0.155 g/L，于溫度為25±1℃，光強(qiáng)為4 000 lux，光暗周期為16 h∶8 h條件下自養(yǎng)和混養(yǎng)培養(yǎng)4 d。異養(yǎng)時(shí)用黑布包裹好避光培養(yǎng)。每天取樣一次，進(jìn)行相關(guān)參數(shù)的檢測(cè)。

1.2.3 生物量及比生長(zhǎng)速率檢測(cè) 藻生物量及比生長(zhǎng)速率采用修改的Wang[12]等方法測(cè)定。取藻液用無菌水進(jìn)行10倍梯度稀釋，于680 nm波長(zhǎng)測(cè)定稀釋樣品吸光值，另取各稀釋藻樣8 000 r/min離心5 min后，收集沉淀于恒溫箱80℃干燥至恒重并稱干重，并建回歸方程，并分別根據(jù)式1和式2計(jì)算其生物量和μ。

式（2）中：X1是第一次取樣時(shí)（t1）生物量，X2是第二次取樣時(shí)（t2）生物量。

1.2.4 蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)及氨基酸分析 HPLC法測(cè)定蛋白質(zhì)含量及氨基酸組成分析。色譜條件為：采用OPA FUOC柱前衍生化，柱溫 40℃（250×4.6 mm，5 um，ODSHYPERSIL），流動(dòng)相為A相和B相（表1），流量為1.0 mL/min，分別于338 nm和262 nm（Pro，Hypro）檢測(cè)。

表1 氨基酸分析儀所用流動(dòng)相Table 1 Mobile phase for analysis of amino acids by HPLC

1.2.5 氮質(zhì)量濃度測(cè)定 采用APP-UV法（GB11894-89）測(cè)定總氮。收集40 mL藻液于8 000 r/min離心5 min，取上清，分別在波長(zhǎng)220 nm和275 nm測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立回歸方程，氮質(zhì)量濃度（mg/L）=5.966 6（A220nm-2*A275nm）-0.035 8，r2=0.999 6），計(jì)算氮質(zhì)量濃度。

1.2.6 磷質(zhì)量濃度測(cè)定 采用鉬酸銨分光光度法（GB11893-89）測(cè)定總磷含量。收集40 mL藻液于8 000 r/min離心5 min，取上清，于波長(zhǎng)690 nm測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立回歸方程，磷質(zhì)量濃度（mg/L）=0.646 5 A690nm-0.008 5，r2=0.999 6，計(jì)算磷質(zhì)量濃度。

1.2.7 總糖測(cè)定 培養(yǎng)液中總糖濃度測(cè)定采用3，5-二-硝基水楊酸-分光光度法[13]。收集40 mL藻液于8 000 r/min離心5 min，取上清，按總糖測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)步驟操作，于540 nm下測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立回歸方程，糖質(zhì)量濃度 （mg/L）=1.07 A540nm-0.043 9，r2=0.999 8，計(jì)算 Glc 質(zhì)量濃度。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 采用Excell和Origin軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 自養(yǎng)、異養(yǎng)、混養(yǎng)模式對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

分別于異養(yǎng)、混養(yǎng)及自養(yǎng)方式下培養(yǎng)小球藻，其生長(zhǎng)效果見圖1。3種培養(yǎng)方式對(duì)小球藻生長(zhǎng)影響較大。異養(yǎng)條件下，小球藻在96 h進(jìn)入穩(wěn)定期，后期由于有機(jī)碳源不足導(dǎo)致細(xì)胞開始死亡。而混養(yǎng)條件下，在96 h培養(yǎng)基中有機(jī)碳含量接近零，后期藻生物量不降反升。相比較，自養(yǎng)小球藻利用無機(jī)碳的速率較慢導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)速度也更慢。在混養(yǎng)條件下，藻細(xì)胞更容易積累生物量，在168 h生物量可達(dá)1.5 g/L，而自養(yǎng)條件下藻生物量最低僅為0.73 g/L。同樣，藻細(xì)胞在混養(yǎng)時(shí)，比生長(zhǎng)速率和生物量產(chǎn)率在 96 h均最高， 分別為 0.526 d-1和 0.318 mg/（L·d）?；祓B(yǎng)時(shí)生物量最高，為自養(yǎng)時(shí)的2.16倍。作者結(jié)果支持混養(yǎng)小球藻能更有效積累生物量[9，14]。小球藻在光暗條件轉(zhuǎn)換過程中，能快速切換自養(yǎng)到異養(yǎng)代謝，反之亦然[15]。

圖1 自養(yǎng)、混養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)模式對(duì)C.vulgaris C9-JN2010的生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of autotrophic，heterotrophic and mixotrophic culturemodelson growth ofChlorella vulgaris C9-JN2010

混養(yǎng)方式下小球藻生物量積累更高，可能混養(yǎng)條件下藻細(xì)胞既可通過異養(yǎng)途徑快速利用葡萄糖進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，當(dāng)培養(yǎng)基中糖不足時(shí)，又可通過光合自養(yǎng)固定空氣中CO2，進(jìn)一步合成細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)及核酸等有機(jī)物從而促進(jìn)藻生物量積累。微藻自養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)主要通過獲取光能用于自身生長(zhǎng)，而光能不足難以維持細(xì)胞最優(yōu)生長(zhǎng)。在沒有光照時(shí)異養(yǎng)培養(yǎng)，適宜的碳源對(duì)藻獲得高生物量非常重要。Haass和Tanner報(bào)道了小球藻擁有一套誘導(dǎo)型己糖運(yùn)輸途徑利用葡萄糖[16]。大量研究表明Chlorella sp.不但能夠利用單糖（如，葡萄糖、果糖、半乳糖和甘露糖等），而且能夠利用二糖（如蔗糖和乳糖），而不同糖的利用速率不一導(dǎo)致藻細(xì)胞產(chǎn)率和生物量濃度的差異較大[17-20]。一般異養(yǎng)小球藻生物量約為自養(yǎng)的3-5倍[10，19]。甚至有研究報(bào)道小球藻異養(yǎng)時(shí)還能利用甘油，主要在藻細(xì)胞生長(zhǎng)后期，培養(yǎng)基中速效糖被消耗完之后會(huì)誘導(dǎo)微藻代謝機(jī)制發(fā)生改變，藻細(xì)胞會(huì)利用甘油、一些有機(jī)酸，甚至是復(fù)雜糖類作碳源[21]。混養(yǎng)時(shí)微藻可同時(shí)進(jìn)行異養(yǎng)和自養(yǎng)或單獨(dú)進(jìn)行異養(yǎng)或自養(yǎng)[22]，當(dāng)有機(jī)碳出現(xiàn)可改變小球藻異養(yǎng)和自養(yǎng)的代謝途徑[23]。因而，混養(yǎng)不是光合自養(yǎng)與異養(yǎng)簡(jiǎn)單的結(jié)合。此外，Cheirsilp和Torpee研究發(fā)現(xiàn)光照也可促進(jìn)藻細(xì)胞生長(zhǎng)積累生物量[24]。

2.2 不同培養(yǎng)模式下小球藻葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)與C/N利用效率比較

不同培養(yǎng)方式顯著影響藻細(xì)胞葉綠素含量，見圖2。在0~24 h，異養(yǎng)、混養(yǎng)和自養(yǎng)培養(yǎng)方式下，葉綠素含量均隨著藻細(xì)胞生長(zhǎng)增加，在24 h均達(dá)到最高值分別為 20.8、25.6、32.1 mg/g。24 h 后，葉綠素含量開始下降，尤其是異養(yǎng)條件下，于168 h降為最低是3.8 mg/g，在自養(yǎng)條件下葉綠素下降較慢，最終穩(wěn)定在25 mg/g左右。研究報(bào)道自養(yǎng)有利于葉綠素合成，而混養(yǎng)和異養(yǎng)不利于葉綠素積累[24-26]。Boussiba和Vonshak認(rèn)為氮是用于連續(xù)合成色素蛋白質(zhì)所必需的元素[27]。產(chǎn)生以上現(xiàn)象的主要原因?yàn)椋阂环矫?，小球藻?xì)胞在光合自養(yǎng)時(shí)，碳利用主要通過光合途徑卡爾文循環(huán)途徑固定CO2，進(jìn)一步形成合成各種所糖類、需氨基酸和蛋白質(zhì)及核酸等，需要合成大量光合色素來捕獲足夠能量。若氮源限制出現(xiàn)后，異養(yǎng)和混養(yǎng)能直接利用培養(yǎng)基中葡萄糖等碳源生長(zhǎng)繁殖，不需要光合作用固定CO2而抑制光合色素合成；另一方面，自養(yǎng)光合色素合成需要大量氮，培養(yǎng)基中氮含量過低不利于色素合成[28]。

3種培養(yǎng)方式下，小球藻對(duì)Glc和氮的利用效果見圖3和表2?；祓B(yǎng)時(shí)小球藻利用糖和氮速率最快，在120 h時(shí)糖濃度接近零，其糖利用率和消耗速率分別為 99.7%和 0.598 g/（L·d）。 至 96 h，氮質(zhì)量濃度降為0.5左右，其利用率與利用速率分別為99.9%和 13.98 mg/（L·d）。

圖2 自養(yǎng)、混養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)模式對(duì)C.vulgaris C9-JN2010胞內(nèi)光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.2 Effect of autotrophic，heterotrophic and mixotrophic cultures models on content of chlorophyll in cell C.vulgaris C9-JN2010

表2 自養(yǎng)、異養(yǎng)及混養(yǎng)條件下C.vulgaris C9-JN2010利用葡萄糖和氮效率Table 2 Efficiency of consuming Glc and nitrogen in the culture media by C.vulgaris C9-JN2010 in autotrophic，heterotrophic and mixotrophic cultures models

圖3 自養(yǎng)、異養(yǎng)及混養(yǎng)培養(yǎng)模式下C.vulgaris C9-JN2010消耗糖與氮的曲線Fig.3 Curves of consuming glucose and nitrogen by C.vulgaris C9-JN2010 in autotrophic，heterotrophic and mixotrophic cultures models

2.3 3種培養(yǎng)方式對(duì)藻體蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)及氨基酸組分的影響

小球藻C9-JN2010在自養(yǎng)條件下蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高為52.1%，但蛋白產(chǎn)率卻在混養(yǎng)時(shí)最高為0.097 g·L-1·d-1（表 3）。自養(yǎng)小球藻蛋白質(zhì)含量高于Mitra[9]等人報(bào)道，而混養(yǎng)與異養(yǎng)則稍低。一般地，小球藻內(nèi)蛋白質(zhì)、油脂及糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為51%~58%、14%~22%和12%~17%[5]。主要原因是自養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)，藻生物量過低導(dǎo)致最后蛋白質(zhì)產(chǎn)量低。當(dāng)?shù)狈Χ汲渥銜r(shí)，微藻細(xì)胞通過碳代謝進(jìn)入乙酰輔酶A使脂肪酸積累被激活，或碳參與把糖類或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為脂肪酸[29-30]，導(dǎo)致蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低。

3種培養(yǎng)方式下，小球藻均含18種氨基酸，且8種必需氨基酸比例高，約占總氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的40.0%（表3）。另外，在異養(yǎng)和混養(yǎng)條件下小球藻所有氨基酸比例基本相似，與自養(yǎng)時(shí)相比，其中Cyss、Thr、Tyr和 Met差異顯著，Cys-s質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別高為 78.57%， 而 Thr、Tyr及 Met分別低 21.6%、27.59%和33.33%（表4）?？赡茉?yàn)椴煌囵B(yǎng)方式下碳利用方式和途徑不同導(dǎo)致小球藻一些氨基酸代謝產(chǎn)生差異。García等認(rèn)為混養(yǎng)條件下細(xì)胞內(nèi)光合成分含量依賴于異養(yǎng)/自養(yǎng)代謝的比重[31]。

表3 自養(yǎng)、異養(yǎng)及混養(yǎng)培養(yǎng)模式下培養(yǎng)藻細(xì)胞蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)及產(chǎn)率Table 3 Content and productivity of protein from the algae biomass cultivated in autotrophism，heterotrophism and mixotrophism

表4 自養(yǎng)、異養(yǎng)及混養(yǎng)培養(yǎng)模式下藻細(xì)胞氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)及組成Table 4 Content and components of amino acids from the algae cell cultivated in autotrophism，heterotrophism and mixotrophism

續(xù)表4

3 結(jié)語

考察了自養(yǎng)、異養(yǎng)及混養(yǎng)條件下小球藻蛋白質(zhì)及氨基酸合成效果?；祓B(yǎng)藻細(xì)胞生長(zhǎng)更佳，生物量高達(dá)1.5 g/L，為自養(yǎng)時(shí)2.16倍，而自養(yǎng)時(shí)更有利于色素和蛋白質(zhì)合成，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別高達(dá)25 mg/g和52.1%。自養(yǎng)藻蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于Mitra[9]等人報(bào)道，而混養(yǎng)與異養(yǎng)則稍低，但混養(yǎng)時(shí)蛋白質(zhì)產(chǎn)率卻最高為0.097 g/（L·d）。3種方式培養(yǎng)小球藻均含18種氨基酸，且必須氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過40.0%。異養(yǎng)和混養(yǎng)小球藻各氨基酸比例基本相似，與純自養(yǎng)培養(yǎng)小球藻相比，Cys-s、Tyr和Met比例差異最顯著，為作者首次報(bào)道。自養(yǎng)能有效提高蛋白質(zhì)含量，而混養(yǎng)可顯著提高蛋白質(zhì)產(chǎn)率。營(yíng)養(yǎng)方式顯著影響小球藻蛋白質(zhì)合成及氨基酸組成，籍此可營(yíng)養(yǎng)方式是小球藻實(shí)現(xiàn)一些重要氨基酸積累策略。后續(xù)將優(yōu)化混養(yǎng)小球藻蛋白及氨基酸合成代謝調(diào)控策略，預(yù)期獲得更高的蛋白質(zhì)產(chǎn)率和提高一些氨基酸質(zhì)量濃度。

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