馬 彥，岑 雯，劉 昕，馮文莉(山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院皮膚科，太原 030001;通訊作者，E-mail:mayan197522@163.com)

近年來隨著新技術(shù)的開展和免疫抑制劑的應(yīng)用，侵襲性曲霉病的發(fā)病率在臨床呈現(xiàn)明顯上升趨勢且病死率高，而煙曲霉(Aspergillus fumigates，A.fumigatus)是其主要致病菌，因此探討煙曲霉感染的發(fā)病機(jī)制變得刻不容緩［1］。通過構(gòu)建基因敲除株對目的基因進(jìn)行研究是目前常用來研究煙曲霉的一種方法，既往的實(shí)驗(yàn)技術(shù)多數(shù)通過克隆技術(shù)將指定片段的基因進(jìn)行敲除，往往受到所選基因序列和載體酶切位點(diǎn)的限制，有時(shí)不能完整地敲除整個(gè)基因或者指定片段，且耗時(shí)較長，本研究通過使用融合PCR法成功構(gòu)建煙曲霉ssk1基因敲除株，節(jié)省時(shí)間，大大簡化了煙曲霉基因敲除載體構(gòu)建的過程，現(xiàn)具體說明如下。

1 材料和方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

煙曲霉ku80作為野生對照菌株，煙曲霉轉(zhuǎn)化用宿主菌為A.fumigatus ku80 pyrG－，該菌株為嘧啶營養(yǎng)缺陷株，在沒有尿苷和尿嘧啶的培養(yǎng)基上不能生長。篩選標(biāo)記pyrG來源于A.parasiticus(由杜克大學(xué)William J.Steinbach教授贈(zèng)送)。

1.2 培養(yǎng)基

GMM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(1 L):20×鹽溶液50 ml，微量元素液 1 ml，D － 葡萄糖10 g，瓊脂15 g(1.5%)，pH 值 6.5。

20 × 鹽溶液(1 L):NaNO3120 g，KCl 10.4 g，MgSO4·7H20 10.4 g，KH2PO430.4 g，加水至 1 L，室溫儲(chǔ)存。

微量元素液(1 L):ZnSO4·7H20 2.2 g，H3BO31.1 g，MnCl2·4H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.5 g，CoCl2·5H2O 0.16 g，CuSO4·5H2O 0.16 g，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.11 g，Na4EDTA 5.0 g。

溶壁酶:Vinoflow FCE(Novozymes公司);等滲培養(yǎng)基:1.2 mol/L MgSO4，10 mmol/L sodium phosphate，4 ℃保存;Trapping 緩沖液:0.6 mol/L sorbitol，0.1 mol/L Tris－HCl，4 ℃保存;STC 溶液:1.2 mol/L sorbitol，10 mmol/L CaCl2，10 mmol/L Tris － HCl pH 7.5，在4℃保存;聚乙二醇氯化鈣溶液:60%PEG，50 mmol/L CaCl2，50 mmol/L Tris－HCl pH 7.5在室溫保存;1.5%底層瓊脂培養(yǎng)基(SMM)∶20×鹽溶液50 ml，微量元素液1 ml，葡萄糖10 g，瓊脂15 g，山梨醇218.6 g，酵母提取物 1 g，pH 值6.5，加水至 1 L，高壓滅菌20 min。0.7%頂層瓊脂培養(yǎng)基:配方同上(1.5%)，將其中瓊脂改為7 g/L。

1.3 生物信息學(xué)分析

在煙曲霉基因組中(www.aspergillusgenome.org)找出與念珠菌ssk1基因同源的基因，并利用SMART軟件對此基因功能區(qū)進(jìn)行初步分析。

1.4 煙曲霉ssk1基因敲除的構(gòu)建

1.4.1 基因敲除的構(gòu)建 煙曲霉ssk1基因敲除構(gòu)建示意圖見圖1。

圖1 ssk1基因敲除構(gòu)建示意圖Figure 1 Sketch map of ssk1gene deletion

1.4.2 引物 本實(shí)驗(yàn)中所用引物見表1。

1.4.3 基因片段的擴(kuò)增與融合 本實(shí)驗(yàn)采用了兩輪PCR反應(yīng)，其體系及反應(yīng)條件如下。

第一輪PCR:以野生株基因組DNA為模板，首先分別使用F1、R1;F2、R2擴(kuò)增相應(yīng)的片段。以A.parasiticus DNA為模板使用引物pyrG－5’，pyrG－3’擴(kuò)增篩選標(biāo)記pyrG。具體PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件如下(試劑盒為NEB公司高保真融合PCR DNA 聚合酶):無核酸酶的水31.5 μl，5 × 緩沖液10 μl，10 mmol/L dNTPs 1 μl，10 μmol/L 上游引物 2.5 μl，10 μmol/L 下游引物2.5 μl，模板 DNA(濃度100 ng/μl)2 μl，高保真融合 PCR DNA 聚合酶 0.5 μl，合計(jì) 50 μl。

反應(yīng)條件:98 ℃ 5 min，98 ℃ 10 s，60 ℃30 s，72℃1 min，共30個(gè)循環(huán)。72℃ 10 min，4℃保存。

該反應(yīng)中F1、R1，F(xiàn)2、R2擴(kuò)增相應(yīng)序列片段均為1.0 kb。因?yàn)閿U(kuò)增條帶大小相等，且退火溫度差別不大，故使用相同的擴(kuò)增條件，產(chǎn)物標(biāo)記為P1，P2。擴(kuò)增篩選標(biāo)記 pyrG:使用引物 pyrG－5’和pyrG －3’，產(chǎn)物大小約為 2.3 kb，體系同前，PCR 反應(yīng)條件中延伸時(shí)間改為2 min，產(chǎn)物標(biāo)記為P3。

表1 本研究中所使用的引物序列Table 1 Sequences of the primer in this study

0.8 %瓊脂糖凝膠電泳，確定片段大小，并切膠純化。純化用試劑盒為:Fermentas公司的Gene JET gel extraction kit。

第二輪PCR反應(yīng):也是最重要的一步反應(yīng)即融合基因的擴(kuò)增。其反應(yīng)體系及反應(yīng)條件如下:無核酸酶的水 30.5 μl，5 × 緩沖液 10 μl，10 mmol/L dNTPs 1 μl，10 μmol/L 上游引物 2.5 μl，10 μmol/L下游引物 2.5 μl，模板 DNA 3 μl，高保真 DNA 聚合酶 0.5 μl，體系合計(jì) 50 μl。其中模板 DNA 為 P1，P2，P3三種產(chǎn)物各取1 μl的混合體，將延伸條件改為4 min進(jìn)行擴(kuò)增。其反應(yīng)條件如下:98℃ 10 s，60℃ 30 s，72 ℃ 4 min共1個(gè)循環(huán)，98 ℃ 10 s，62 ℃30 s，72℃ 4 min，共29個(gè)循環(huán)。72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

0.8 %瓊脂糖凝膠電泳，對比Marker確定正確大小的融合基因片段，切膠純化，并定量(試劑同前)。

1.4.4 原生質(zhì)體法構(gòu)建基因敲除株 250 ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.5% 酵母提取物+尿苷尿嘧啶(Uracil 0.14 g，Uridine 0.315 g)接種 Δku80 pyrG－菌懸液 2 ml，30 ℃，250 r/min搖床過夜培養(yǎng)(16 －20 h)。收集菌絲，使用Vinoflow FCE稱量3 g，放于干凈的40 ml等滲培養(yǎng)基中，充分吹打混勻。28℃，75 r/min搖床培養(yǎng)3－4 h。加入Trapping緩沖液4℃，3 500 r/min離心10 min;吸出離心管夾層的原生質(zhì)體，加3倍體積的STC溶液到原生質(zhì)體中，上下輕輕顛倒混勻，離心。吸出原生質(zhì)體層，用1 ml的STC溶液重懸原生質(zhì)體，觀察原生質(zhì)體狀態(tài)及濃度，適當(dāng)調(diào)整濃度。取5 μg的融合PCR產(chǎn)物加入到200 μl的原生質(zhì)體中，冰上靜置1 h。將200 μl DNA－原生質(zhì)體放入到1.25 ml的聚乙二醇氯化鈣溶液中，輕彈混勻，室溫放置20 min，加入3 ml STC，輕輕混勻，取300 μl與10 ml SMM頂層培養(yǎng)基混合后鋪板于1.5%的底層培養(yǎng)基上，放置于37℃孵箱中培養(yǎng)。具體實(shí)驗(yàn)方法見文獻(xiàn)［2］。

1.5 轉(zhuǎn)化子的驗(yàn)證

1.5.1 PCR驗(yàn)證 在GMM液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)單克隆轉(zhuǎn)化子，并提取基因組DNA。分別使用四組引物進(jìn)行擴(kuò)增(F1，R4;F4，R2;F1，pyrG －3’;R2，pyrG －5’)。

擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件如下:無核酸酶的水7 ul，2 × 緩沖液 10 μl，10 μmol/L 上游引物 0.5 μl，10 μmol/L 下游引物 0.5 μl，模板 DNA(濃度 100 ng/μl)2 μl，合計(jì) 20 μl。反應(yīng)條件:95℃ 5 min，95 ℃10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)。72 ℃延伸10 min，4℃保存。其中延伸溫度根據(jù)擴(kuò)增片段大小適當(dāng)調(diào)整。所用試劑為Thermo scientific Dream taq Green PCR Master mix(2×)。

1.5.2 Southern Blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子 提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA，使用ApaLⅠ過夜酶切，1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，具體實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明。所用試劑Roche公司的地高辛標(biāo)記SouthernBlot試劑盒。

2 結(jié)果

2.1 煙曲霉ssk1基因生物學(xué)分析

通過同源基因的序列比對我們在煙曲霉基因組中找到其同源基因?yàn)锳fu5g08390，位于5號染色體，編碼850個(gè)氨基酸，Smart軟件分析發(fā)現(xiàn)在560－718氨基酸間存在信號傳導(dǎo)受體區(qū)。序列同源性比較結(jié)果:黃曲霉相似性81%，土曲霉相似性73%，黑曲霉73%，構(gòu)巢曲霉72%，白念珠菌71%，裂殖酵母75%。

2.2 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

第一步PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2，可見分別獲得了大約1.0 kb的ssk1基因的上下游側(cè)翼序列。圖3可見獲得了大小約為2.3 kb的片段，為篩選標(biāo)記pyrG。第二步融合PCR擴(kuò)增結(jié)果可見有數(shù)條高亮條帶(見圖4)，其中大約為4.3 kb的片段為我們的目的片段。

圖2 ssk1基因上下游側(cè)翼序列PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 2 PCR amplification results of the flanking sequence of the ssk1 gene

圖3 篩選標(biāo)記pyrG基因擴(kuò)增結(jié)果Figure 3 PCR amplification results of the pyrG gene using the primer pyrG －5’and pyrG －3’

圖4 融合基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 4 PCR amplification results of the fushion PCR using the primer F1 and R2

2.3 轉(zhuǎn)化子PCR鑒定結(jié)果

原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化煙曲霉后挑取單克隆的轉(zhuǎn)化子在GMM液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，提取DNA鑒定。我們共使用四組引物進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證。

第Ⅰ組使用引物F1、R4進(jìn)行擴(kuò)增:由于R4引物設(shè)計(jì)在基因上，因此在野生株應(yīng)該出現(xiàn)條帶約為2 494 bp，在基因敲除株無條帶出現(xiàn)。菌株1，3，4，5無條帶出現(xiàn)為正確的基因敲除株，而轉(zhuǎn)化子2和野生株有條帶(見圖5)，說明轉(zhuǎn)化子2不是正確的基因敲除株。

第Ⅱ組使用F4、R2進(jìn)行擴(kuò)增分別擴(kuò)增轉(zhuǎn)化子。由于F4引物設(shè)計(jì)在基因上，因此在野生株可以出現(xiàn)條帶約為2 332 bp，在基因敲除株無條帶出現(xiàn)。由圖5可見轉(zhuǎn)化子1，3，4，5無條帶出現(xiàn)為正確的基因敲除株，而轉(zhuǎn)化子2和野生株有條帶，說明轉(zhuǎn)化子2不是正確的基因敲除株。

第Ⅲ組使用F1、pyrG－3’這對引物進(jìn)行擴(kuò)增。由于pyrG－3’在篩選標(biāo)記上，因此在野生株沒有條帶出現(xiàn)，在基因突變株有條帶大約1.0 kb，由圖5可見在野生株上無條帶出現(xiàn)，而在轉(zhuǎn)化子 1，2，3，4，5都有正確大小的條帶出現(xiàn)，說明均有篩選標(biāo)記進(jìn)入到轉(zhuǎn)化子中。

第Ⅳ組使用pyrG－5’、R2這對引物進(jìn)行擴(kuò)增。由于pyrG－5’在篩選標(biāo)記上，因此在野生株沒有條帶出現(xiàn)，在基因突變株有條帶大約3.5 kb的條帶。由圖6可見在轉(zhuǎn)化子1，2，3，4，5都有正確條帶出現(xiàn)說明均有篩選標(biāo)記進(jìn)入到轉(zhuǎn)化子中。

綜上可見1，3，4，5這四個(gè)轉(zhuǎn)化子為同源轉(zhuǎn)化子，而轉(zhuǎn)化子2為異源轉(zhuǎn)化子，也就是沒有結(jié)合到正確的位置上。

圖5 野生株與轉(zhuǎn)化子的PCR結(jié)果Figure 5 PCR results of wild strain and transformants

2.4 Southern blot驗(yàn)證結(jié)果

根據(jù)PCR的結(jié)果我們進(jìn)一步驗(yàn)證了轉(zhuǎn)化子1，3，4，5的正確性。從基因敲除構(gòu)建的示意圖我們可以看出在野生株使用限制性內(nèi)切酶ApaLⅠ酶切后得到大約4 806 bp大小的片段，而在基因敲除株則得到大約2 110 bp大小的片段(見圖7)，進(jìn)一步說明得到的轉(zhuǎn)化子1，3，4，5是正確的轉(zhuǎn)化子。

3 討論

由于煙曲霉致病引起的侵襲性曲霉病發(fā)病明顯增加，致力于煙曲霉研究的學(xué)者也越來越多，而目的基因的特異性敲除是一種常用的研究方法。既往的研究顯示多數(shù)學(xué)者采取了質(zhì)?？寺〉姆椒ǎ?］，為了提高煙曲霉轉(zhuǎn)化的效率，近年來使用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙曲霉的轉(zhuǎn)化方法有效地提高了轉(zhuǎn)化效率［3，4］。然而構(gòu)建敲除載體的過程仍然復(fù)雜，需要精心選擇酶切位點(diǎn)并構(gòu)建多個(gè)中間載體，耗時(shí)較長，且受到載體種類和酶切位點(diǎn)的限制，往往造成有些基因序列不能順利構(gòu)建載體，延長了研究周期。

圖7 使用Southern blot對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行驗(yàn)證Figure 7 The verification of the transformants using Southern blot

近年來很多學(xué)者嘗試改變構(gòu)建載體的方法，以更簡潔、更方便的方法來替代傳統(tǒng)的方法。融合基因法陸續(xù)有人報(bào)道［5，6］。融合 PCR(fusion PCR)是將任意兩條或三條具有同源區(qū)域的片段，通過PCR的方法實(shí)現(xiàn)連接的技術(shù)方法，融合PCR作為一種常用的構(gòu)建重組片段或重組載體的手段常用于基因功能研究，而隨著越來越多的基因組被測序出來，對目的基因進(jìn)行多種功能分析成為可能，如目的基因特異性敲除、目的基因過量表達(dá)或體外表達(dá)，或者對目的基因插入熒光標(biāo)記等。絲狀致病真菌煙曲霉基因敲除本身有一定的難度，有研究報(bào)道在雙相真菌馬爾尼菲青霉的載體構(gòu)建中有通過使用三步融合PCR法構(gòu)建成功的報(bào)道［7］。煙曲霉基因敲除載體的構(gòu)建近期也有人報(bào)道使用三步融合PCR的方法［8，9］，本實(shí)驗(yàn)中，不同于以往報(bào)道的三步融合基因法，采用兩步融合法。

首先，在引物設(shè)計(jì)時(shí)只是在特異基因的上下游側(cè)翼序列同要融合的基因即篩選標(biāo)記相鄰片段的引物上設(shè)計(jì)了15個(gè)堿基的互補(bǔ)序列(見表1中的紅色標(biāo)記序列)，并沒有在篩選標(biāo)記pyrG的上下游引物上設(shè)計(jì)與要融合的上下游側(cè)翼序列相鄰片段的互補(bǔ)序列，這樣設(shè)計(jì)的好處是篩選標(biāo)記的引物可以用途更廣，在構(gòu)建以pyrG為篩選標(biāo)記的其他基因敲除載體時(shí)都可以使用該對引物擴(kuò)增篩選標(biāo)記，更具有通用性，也節(jié)約了實(shí)驗(yàn)成本和時(shí)間，只需要針對特異的基因要融合的片段設(shè)計(jì)特異的引物序列即可。

其次，第二步融合PCR反應(yīng)中將不同來源的基因模板融合形成全長的過程和擴(kuò)增合并在一起進(jìn)行。有文獻(xiàn)報(bào)道先在不添加引物的情況下使用DNA聚合酶進(jìn)行片段的互補(bǔ)延伸產(chǎn)生中間產(chǎn)物，然后用中間產(chǎn)物作為模板再進(jìn)行全長序列的擴(kuò)增［10］;還有文獻(xiàn)則先將上下游序列同篩選標(biāo)記融合產(chǎn)生中間產(chǎn)物再通過一次巢氏PCR的方法獲得全長融合基因［9］。我們直接將三種片段產(chǎn)物進(jìn)行融合擴(kuò)增，減少了一次PCR的反應(yīng)過程，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間。在這里我們使用的三種模板的體積比為1∶1∶1，融合過程中各片段在體系中的濃度不同的學(xué)者有不同的見解。韓改革等認(rèn)為各片段在反應(yīng)體系中的終濃度≥15 ng/μl且摩爾比為 1∶1∶1 時(shí)較易獲得產(chǎn)物［8］，而劉增然等認(rèn)為上下游產(chǎn)物以及篩選標(biāo)記產(chǎn)物的比例為1∶1∶3也能獲得較好的效果［9］。我們的經(jīng)驗(yàn)是體積比為1∶1∶1，在其他基因敲除的過程中也取得了較好的效果。不同于上述兩位作者，他們都采用了三步法進(jìn)行融合PCR擴(kuò)增，而我們的試驗(yàn)中只使用了兩步也能成功獲得融合的目的片段。在這個(gè)PCR反應(yīng)條件中我們的第1個(gè)循環(huán)就是將模板相互融合的過程。這樣做減少了實(shí)驗(yàn)步驟，只要通過兩次PCR實(shí)驗(yàn)即可擴(kuò)增出需要的融合片段，純化后，進(jìn)行煙曲霉轉(zhuǎn)化，不同于克隆質(zhì)粒，需要進(jìn)行培養(yǎng)，大大節(jié)約了時(shí)間。我們進(jìn)行兩步PCR融合基因法構(gòu)建煙曲霉ssk1的基因突變株發(fā)現(xiàn)融合PCR的特異性可能會(huì)差一些，因此出現(xiàn)的條帶較多，合理調(diào)整PCR的反應(yīng)條件是比較重要的。如果擴(kuò)增的目的片段偏弱可以適當(dāng)降低第1個(gè)循環(huán)中的退火溫度，在第2－29個(gè)循環(huán)中退火溫度適當(dāng)提高可以增加產(chǎn)物的特異性，當(dāng)然不同的基因和引物可能需要的條件不同。如果條帶不清晰則需要重新調(diào)整反應(yīng)條件，進(jìn)一步優(yōu)化。不同的實(shí)驗(yàn)室根據(jù)自己的經(jīng)驗(yàn)可能有不同的方案。

總之，融合PCR這種技術(shù)在構(gòu)建煙曲霉基因敲除株的好處在于其不受序列本身和載體酶切位點(diǎn)的限制，在沒有合適的載體或者酶切位點(diǎn)時(shí)進(jìn)行基因敲除，融合PCR的方法不失為煙曲霉基因敲除的一個(gè)很好的策略。我們通過使用融合PCR技術(shù)得到了煙曲霉ssk1基因的全基因敲除株，這為我們的下一步的實(shí)驗(yàn)提供了良好的平臺(tái)。

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