張俊俠，魏燦英，焦小珂，肖禾（.成都大學(xué)醫(yī)護(hù)學(xué)院，成都 637；.四川廣元蓉成制藥有限公司，四川 廣元 68000）

小兒解表止咳口服液是集六十余載臨床實(shí)踐而形成的經(jīng)驗(yàn)方，該經(jīng)驗(yàn)方取《傷寒論》麻黃湯之義，選麻黃、杏仁、半夏等構(gòu)成，用于治療小兒呼吸道感染引起的咳嗽、痰多等癥，具有解表清熱、止咳祛痰、逐邪寧肺的功效，標(biāo)本同治，療效確切。小兒解表止咳口服液外觀為深棕色，不透明。其澄明度較差，且直接影響到產(chǎn)品外觀性狀的觀察和內(nèi)在質(zhì)量的穩(wěn)定性。因此，提高口服液澄明度顯得尤為重要。絮凝澄清法是一種有效的提高藥品質(zhì)量的澄清方法[1-2]，其中殼聚糖是一種新型的絮凝澄清劑，在中藥中已有成功應(yīng)用。已有學(xué)者從化學(xué)成分入手研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖對(duì)于大部分藥材提取液均能起到一定的澄清作用，并能充分保留有效成分，明顯提高有效成分的轉(zhuǎn)移率[3-7]。朱寧等[8-9]在丹參提取、排鉛口服液的澄清工藝改進(jìn)中應(yīng)用殼聚糖絮凝法，既不影響中藥質(zhì)量，又可節(jié)省生產(chǎn)成本，較傳統(tǒng)的中藥純化方法好。筆者以殼聚糖作為澄清劑對(duì)小兒解表止咳口服液進(jìn)行澄清處理，選擇最佳澄清工藝，并與醇沉法相比較，結(jié)合分光光度法觀察其澄清效果，并采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定指標(biāo)性成分鹽酸麻黃堿的含量，以確保澄清工藝的合理性。

1 材料

1.1 儀器

SPD-10Avp HPLC儀、G1314A-UV紫外檢測(cè)器（日本島津公司）；2TU-1901紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；BP211D分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；微孔濾膜（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，孔徑:0.45 μm）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。

1.2 藥品與試劑

小兒解表止咳口服液（四川廣元蓉成制藥有限公司，批號(hào):121101）；殼聚糖（青島海維康生物制品有限公司，批號(hào):01106）；鹽酸麻黃堿對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào):171241-201007，供含量測(cè)定用）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 殼聚糖溶液的制備

精密稱取殼聚糖1 g，加入1%醋酸溶液100ml，待溶脹后用磁力攪拌器攪拌使之完全溶解，即得1%殼聚糖溶液。

2.2 吸光度的測(cè)定

精密量取小兒解表止咳口服液1ml，置50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，以純水為空白對(duì)照，按分光光度法，采用l cm的石英吸收池，在520nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，吸光度值大小與溶液澄清效果成反比。

2.3 鹽酸麻黃堿的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱:C18（250mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相:乙腈-0.1%磷酸溶液（含0.1%三乙胺）（3∶97，V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng):205nm；流速:1.0ml/min；進(jìn)樣量:10μl。在此條件下，鹽酸麻黃堿與其他組分均可達(dá)到基線分離，理論板數(shù)以鹽酸麻黃堿色譜峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鹽酸麻黃堿對(duì)照品2.2507mg，置50ml量瓶中，用0.1 mol/L的鹽酸溶液定容，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密量取小兒解表止咳口服液5ml，加水10ml及濃氨試液0.5ml，用乙醚振搖提取5次（30、30、20、20、20ml），合并乙醚液，加鹽酸乙醇溶液（1→20）2ml，混勻，低溫回收溶劑至干，殘?jiān)靡掖?ml溶解并轉(zhuǎn)移至25ml量瓶中，加0.1 mol/L的鹽酸溶液至刻度，搖勻，即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察 取鹽酸麻黃堿對(duì)照品適量，加0.1 mol/L的鹽酸溶液制成質(zhì)量濃度分別為10、20、40、80、160μg/ml的系列對(duì)照品溶液，精密吸取系列對(duì)照品溶液適量，注入色譜儀進(jìn)行分析。以鹽酸麻黃堿峰面積積分值（y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y＝29378x－12327（r＝0.9999）。結(jié)果表明，鹽酸麻黃堿質(zhì)量濃度在10～160μg/ml范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.4 單因素試驗(yàn)考察澄清工藝

2.4.1 殼聚糖用量對(duì)澄清效果的影響 取小兒解表止咳口服液5份，各50ml，水浴加熱至80℃，分別按5%、10%、15%、20%、25%的用量加入1%的殼聚糖溶液，同時(shí)以100 r/min的速度勻速攪拌10min。4℃下靜置24h后，上清液濾過，轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中，加水至刻度。取此溶液1ml，置50ml量瓶中，加水定容，在520nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，并比較溶液的沉淀和澄明度情況以及鹽酸麻黃堿質(zhì)量濃度。殼聚糖用量對(duì)澄清效果的影響見表1。

表1 殼聚糖用量對(duì)澄清效果的影響Tab 1 Effects of the amounts of chitosan on the clarification

2.4.2 澄清溫度對(duì)澄清效果的影響 取小兒解表止咳口服液9份，各50ml，分別用水浴加熱至10、20、…、80、90 ℃，按15%的用量加入1%殼聚糖溶液，其余同“2.4.1”項(xiàng)下操作。澄清溫度對(duì)澄清效果的影響見表2。

2.4.3 澄清時(shí)間對(duì)澄清效果的影響 取小兒解表止咳口服液4份，各50ml，用水浴加熱至80℃，按15%的用量加入1%的殼聚糖溶液，同時(shí)以100 r/min的速度勻速攪拌10min。4℃分別靜置6、12、24、48 h，取上清液，濾過，取續(xù)濾液在520nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并比較溶液的沉淀和澄明度情況以及鹽酸麻黃堿質(zhì)量濃度。澄清時(shí)間對(duì)澄清效果的影響見表3。

表2 澄清溫度對(duì)澄清效果的影響Tab 2 Effects of clarification temperature of chitosan on the clarification

由表1～表3可知，隨著殼聚糖用量的逐漸增加，絮狀沉淀的量也逐漸增加，過濾也更加容易，澄明度更好，澄清劑加入量＞10%時(shí)，達(dá)到澄明效果，澄清劑的加入量對(duì)其澄明度影響力減小，綜合對(duì)口服液有效成分的保留及成本的考慮，選擇15%的殼聚糖加入量最為合適；各溫度下處理的供試品均產(chǎn)生較多絮狀沉淀，濾液顏色為半透明、紅棕色，但80℃處理的供試品溶液澄明度最好；對(duì)澄清時(shí)間考察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)靜置時(shí)間超過24h后，澄明度的變化不大。

2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)選澄清工藝[5]

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇殼聚糖用量（A）、澄清溫度（B）、澄清時(shí)間（C）為考察因素，以吸光度、鹽酸麻黃堿的質(zhì)量濃度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)定攪拌速度為100 r/min，攪拌時(shí)間為10min，用L9（34）正交表安排試驗(yàn)。因素與水平見表4；正交試驗(yàn)結(jié)果見表5；方差分析結(jié)果見表6。

表4 因素與水平Tab 4 Factors and Level

由表5、表6可知，各因素對(duì)澄清效果作用的主次順序?yàn)锳＞B＞C。其中，殼聚糖用量對(duì)吸光度和鹽酸麻黃堿質(zhì)量濃度的影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其他兩個(gè)因素均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此著重考慮A因素。綜合比較分析結(jié)果，并考慮實(shí)際生產(chǎn)需要，優(yōu)先考慮有效成分鹽酸麻黃堿的保留，最終確定最佳澄清工藝為A2B2C2，即1%殼聚糖溶液用量為15%，澄清溫度為80℃，澄清時(shí)間為24h。

2.6 不同澄清工藝的澄清效果比較

2.6.1 醇沉法 取小兒解表止咳口服液50ml，向其中緩緩加入無水乙醇50ml，同時(shí)用磁力攪拌器以100 r/min的速度勻速攪拌，至含乙醇量達(dá)到50%（原生產(chǎn)工藝）。4℃靜置24h，上清液濾過，回收乙醇至無醇味，轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中，加水至刻度，貯藏，備用。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 Results of orthogonal experiment

表6 方差分析結(jié)果Tab 6 Results of variance analysis

2.6.2 殼聚糖法 取小兒解表止咳口服液50ml，按“2.5”項(xiàng)下優(yōu)選的最佳工藝，用水浴加熱至80℃，加入1%的殼聚糖溶液15%，同時(shí)以100 r/min的速度勻速攪拌10min。4℃靜置24h，取上清液，濾過，轉(zhuǎn)移至100ml量瓶中，加水至刻度，貯藏，備用。

2.6.3 澄清效果比較 分別精密量取“2.6.1”、“2.6.2”項(xiàng)下溶液各1ml，置50ml量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，以蒸餾水為空白對(duì)照，照分光光度法，采用1 cm的石英吸收池，在520nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，比較溶液的沉淀和澄明度情況以及鹽酸麻黃堿質(zhì)量濃度。醇沉法與殼聚糖澄清法澄清效果比較見表7。

由表7可知，無水乙醇與殼聚糖均可以改善小兒解表止咳口服液的澄明度，但殼聚糖法的樣品澄明度優(yōu)于醇沉法樣品，并且醇沉法產(chǎn)生的沉淀呈細(xì)小顆粒狀，給過濾帶來很大困難，而殼聚糖法產(chǎn)生的沉淀呈疏松的絮狀，易于過濾。最佳工藝下的殼聚糖澄清法與醇沉法對(duì)鹽酸麻黃堿質(zhì)量濃度都影響較小且無明顯差異，可有效保留小兒解表止咳口服液的有效成分。綜上，殼聚糖澄清法較醇沉法的澄清效果更好，且工藝簡(jiǎn)便、節(jié)省時(shí)間。

表7 醇沉法與殼聚糖澄清法澄清效果比較Tab 7 Comparison of the clarification of alcohol precipitation process and chitosan clarification method

3 討論

本研究采用殼聚糖作為澄清劑用于小兒解表止咳口服液澄清工藝優(yōu)化，結(jié)合紫外-可見分光光度法與HPLC法檢測(cè)澄明度的變化和對(duì)鹽酸麻黃堿含量的影響，并通過正交試驗(yàn)優(yōu)化出最佳澄清工藝。

通過比較殼聚糖法與醇沉法發(fā)現(xiàn)，殼聚糖法所得的小兒解表止咳口服液澄明度優(yōu)于醇沉法，對(duì)鹽酸麻黃堿質(zhì)量濃度的影響與醇沉法相比無明顯差異，可有效保留有效成分。殼聚糖法操作簡(jiǎn)單，殼聚糖用量較少，相比于醇沉法更節(jié)約成本，故可以代替醇沉法用于小兒解表止咳口服液以改善其澄明度?？傮w上講，殼聚糖在中藥口服液澄清方面的研究已經(jīng)展示出良好的應(yīng)用前景，加強(qiáng)此方面的研究，有助于其在純化工藝方面的推廣應(yīng)用。

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