劉國欣，邢建國，李明春，付青姐，張彬（1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 8000；.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，烏魯木齊 80000；.解放軍第401醫(yī)院，山東 青島 66000）

T淋巴細(xì)胞是生物體內(nèi)最重要的免疫活性細(xì)胞之一，主行細(xì)胞免疫應(yīng)答，并參與體液免疫應(yīng)答，在人體的免疫系統(tǒng)功能中發(fā)揮著重要作用。T淋巴細(xì)胞膜上主要有電壓門控鉀離子通道（KV1.3）、Ca2+激活的鉀離子通道（KCa3.1）、陽離子通道（TRPM7）、氯離子通道（Clswell）4種離子通道[1]以及鈣離子通道（CRAC）激活的調(diào)控元件[基質(zhì)相互作用因子（STIM）1和組成分子orai1]，這些離子通道的活動與離子跨膜運(yùn)動、膜電位變化以及T淋巴細(xì)胞活化、增殖密切相關(guān)。KV1.3受膜電位控制，主要維持T淋巴細(xì)胞的靜息膜電位，它功能異常時，靜息電位降低，可抑制Ca2+進(jìn)入細(xì)胞，故它可以通過影響Ca2+濃度來影響T淋巴細(xì)胞的激活與功能，此外還參與T淋巴細(xì)胞的體積調(diào)節(jié)過程。KCa3.1受細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度調(diào)節(jié)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高是KCa3.1開放的主要原因，它在T淋巴細(xì)胞的活化過程中具有重要的作用[2]。T淋巴細(xì)胞上CRAC是細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞的唯一通路，它通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度來調(diào)控T淋巴細(xì)胞的活動[1]。TRPM7是一種非選擇性的陽離子通道，對Ca2+、Mg2+、K+、Na+在內(nèi)的眾多陽離子有通透性[3]，同時作為一種蛋白激酶可使自身或底物磷酸化[4]。Clswell是T淋巴細(xì)胞上的Cl－通道，正常狀態(tài)下不開放，當(dāng)細(xì)胞體積增大時，激活Clswell通道，Cl－由細(xì)胞內(nèi)流向細(xì)胞外，直至細(xì)胞體積恢復(fù)至原來體積時Clswell通道關(guān)閉[1]?？傊?，T淋巴細(xì)胞膜上的離子通道作為T淋巴細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一條重要途徑，在T淋巴細(xì)胞的激活、分化等其他功能中具有重要作用。

香菇多糖是從擔(dān)子菌傘科真菌香菇子實(shí)中提取出來的β-1，3-d-葡聚糖，從1970年Chihara第一次報(bào)道證實(shí)香菇多糖具有很強(qiáng)的抗腫瘤活性后，它被陸續(xù)證實(shí)具有明顯的抗菌、提高機(jī)體免疫等作用[3]。香菇多糖注射液作為一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的抗腫瘤輔助藥物，廣泛應(yīng)用于臨床，調(diào)查顯示它在許多醫(yī)院中藥制劑的應(yīng)用中排在前三位[5]。目前，對香菇多糖促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖與活化的機(jī)制研究相對較少，并且對T淋巴細(xì)胞的增殖與活化是否與T淋巴細(xì)胞膜上的離子通道有關(guān)的研究仍未見報(bào)道。本研究將從基因水平對香菇多糖的作用機(jī)制進(jìn)行研究，主要針對香菇多糖對小鼠T淋巴細(xì)胞膜上的離子通道基因表達(dá)的影響進(jìn)行探討。

1 材料

1.1 儀器

DynaMag-15型磁力架（美國Life Technologies公司）；超低溫冰箱（青島澳柯瑪電器公司）；TL988型實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）儀（西安天隆科技有限公司）；MTC100型恒溫混勻儀（杭州米歐儀器有限公司）；TGL16型高速低溫離心機(jī)（長沙英泰儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

香菇多糖注射液（金陵藥業(yè)股份有限公司，批號:121001.1，規(guī)格:1.0mg/2ml）；胎牛血清、免疫磁珠試劑盒（美國Hyclone公司）；RNA提取試劑盒、引物（基因序列見表1）、cDNA試劑盒、RNA擴(kuò)增試劑盒（大連寶生物工程有限公司）。

表1 基因序列Tab 1 Gene sequences

1.3 動物

健康KM小鼠40只，6～8周，♂，體質(zhì)量（24±4）g，由山東青島實(shí)驗(yàn)動物與動物實(shí)驗(yàn)中心提供[實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號:SCXK（魯）20090007]。

2 方法

2.1 分組與給藥

40只KM小鼠隨機(jī)均分為4組，即對照（等容生理鹽水）組與香菇多糖高、中、低劑量（12.5、2.5、0.5mg/kg）組。ip給藥，每天1次，連續(xù)30d。

2.2 T淋巴細(xì)胞的提取

末次給藥1 h后，處死小鼠，取出脾臟，置于冷PBS（含0.1%胎牛血清+0.02%檸檬酸鈉）中，用免疫磁珠法從脾臟中提取T淋巴細(xì)胞。

2.3 qRT-PCR的測定

收集細(xì)胞，Trizol法提取RNA，鑒定完RNA純度和完整性后，反轉(zhuǎn)錄制備cDNA；PCR條件為:95℃預(yù)變性30 s；95℃變性15 s，55 ℃退火30 s，60 ℃延伸30 s，循環(huán)數(shù)40次；72 ℃延伸5min終止反應(yīng)。qRT-PCR結(jié)束后，定量分析PCR獲得的熔解曲線和擴(kuò)增曲線結(jié)果的可靠性并設(shè)定循環(huán)閾值（Ct），以目的基因/β-actin比值分別代表各自相對表達(dá)水平。各組設(shè)3個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 香菇多糖對小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞KV1.3 mRNA表達(dá)的影響

與對照組比較，香菇多糖中劑量組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞KV1.3 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明，中劑量香菇多糖可以使小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞上KV1.3 mRNA表達(dá)增強(qiáng)。小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞KV1.3 mRNA的表達(dá)見圖1。

圖1 小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞KV1.3 mRNA的表達(dá)與對照組比較:＊P＜0.05Fig 1 mRNA expression of KV1.3 in T lymphocytes isolated from micevs.control group:＊P＜0.05

3.2 香菇多糖對小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞KCa3.1 mRNA表達(dá)的影響

與對照組比較，香菇多糖中劑量組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞KCa3.1 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明，中劑量香菇多糖可以使小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞上KCa3.1 mRNA的表達(dá)增強(qiáng)。小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞KCa3.1 RNA的表達(dá)見圖2。

3.3 香菇多糖對小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞orai1 mRNA表達(dá)的影響

圖2 小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞KCa3.1 mRNA的表達(dá)與對照組比較:＊P＜0.05Fig 2 mRNA expression of KCa3.1 in T lymphocytes isolated from micevs.control group:＊P＜0.05

與對照組比較，香菇多糖中劑量組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞orai1 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明，中劑量香菇多糖可以使小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞CRAC通路上的調(diào)控元件orai1 mRNA表達(dá)增強(qiáng)。小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞orai1 mRNA的表達(dá)見圖3。

圖3 小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞orai1 mRNA的表達(dá)與對照組比較:＊P＜0.05Fig 3 mRNA expression of orai1 in T lymphocytes isolated from micevs.control group:＊P＜0.05

3.4 香菇多糖對小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞STIM1 mRNA表達(dá)的影響

與對照組比較，香菇多糖中劑量組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞STIM1 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明，中劑量香菇多糖可以使小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞CRAC通路上的調(diào)控元件STIM1 mRNA表達(dá)增強(qiáng)。小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞STIM1 mRNA的表達(dá)見圖4。

圖4 小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞STIM1 mRNA的表達(dá)與對照組比較:＊P＜0.05Fig 4 mRNA expression of STIM1 in T lymphocytes isolated from micevs.control group:＊P＜0.05

3.5 香菇多糖對小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞TRPM7 mRNA表達(dá)的影響

與對照組比較，香菇多糖中劑量組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞TRPM7 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明，中劑量香菇多糖可以使小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞上TRPM7 mRNA表達(dá)增強(qiáng)。小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞TRPM7 mRNA的表達(dá)見圖5。

圖5 小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞TRPM7 mRNA的表達(dá)與對照組比較:＊P＜0.05Fig 5 mRNA expression of TRPM7 in T lymphocytes isolated from micevs.control group:＊P＜0.05

3.6 香菇多糖對小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞Clswell mRNA表達(dá)的影響

與對照組比較，香菇多糖中劑量組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞Clswell mRNA表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果表明，中劑量香菇多糖可以使小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞上Clswell mRNA表達(dá)增強(qiáng)。小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞Clswell mRNA的表達(dá)見圖6。

圖6 小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞Clswell mRNA的表達(dá)與對照組比較:＊P＜0.05Fig 6 mRNA expression of Clswell in T lymphocytes isolated from micevs.control group:＊P＜0.05

4 討論

香菇多糖主要用于腫瘤患者，臨床試驗(yàn)證明，它對人的惡性腫瘤具有有效的抑制作用[6]。它主要的作用機(jī)制是促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞增殖[7]，提高自然殺死（NK）細(xì)胞的活性，調(diào)節(jié)免疫力，從而維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，同時它還能促進(jìn)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮（NO）、白細(xì)胞介素（IL）-2來抵抗放療對機(jī)體的損傷[8]。T淋巴細(xì)胞上的CRAC是細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的重要通路[1]。STIM1和orai1作為CRAC通路中的調(diào)控元件作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的Ca2+庫，以致Ca2+持續(xù)釋放到細(xì)胞液內(nèi)，使游離Ca2+濃度升高，一定濃度的Ca2+與STIM1、orai1共同作用使細(xì)胞外的Ca2+進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度升高[9]。Ca2+作為第二信使，濃度升高能夠激活細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)，活化T淋巴細(xì)胞。Ca2+濃度升高還能激活離子通道KCa3.1，研究表明，KCa3.1的高表達(dá)能夠強(qiáng)烈地增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞的活性并促進(jìn)其增殖[10]。早在1988年就有研究表明，鉀離子通道的高表達(dá)能夠迅速地使小鼠胸腺細(xì)胞增殖[11]。KV1.3通道的表達(dá)與激活T淋巴細(xì)胞的活性以及增殖有著密切的關(guān)系[12]。qRT-PCR結(jié)果顯示，中劑量香菇多糖使KV1.3、KCa3.1、STIM1、orai1的基因表達(dá)明顯增強(qiáng)，因此可以推斷香菇多糖可以明顯增強(qiáng)小鼠T淋巴細(xì)胞的增殖和活性，其機(jī)制與影響KV1.3、KCa3.1、STIM1、orai1的基因表達(dá)有密切關(guān)系。

香菇多糖對細(xì)胞的體積具有一定的調(diào)控作用。T淋巴細(xì)胞上的Clswell在T淋巴細(xì)胞的體積調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，因此又稱它為容量調(diào)控氯離子通道[1]。通常Clswell與鉀離子通道共同作用使容積變大的T淋巴細(xì)胞恢復(fù)至正常體積，從而使T淋巴細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，發(fā)揮細(xì)胞免疫的功能。TRPM7是一種非選擇性的陽離子通道，對Ca2+、Mg2+、K+、Na+等眾多二價和單價陽離子有通透性，同時又是一種蛋白激酶，可使自身或底物磷酸化[4]。在T淋巴細(xì)胞的增殖活化過程中離不開底物磷酸化，同時，在T淋巴細(xì)胞正常功能的維持過程中離不開Ca2+、Mg2+、K+、Na+等眾多二價和單價陽離子平衡。因此，在T淋巴細(xì)胞的增殖活化過程中離不開Clswell通道和TRPM7通道。由此推斷香菇多糖對T淋巴細(xì)胞的一系列作用與對Clswell通道和TRPM7通道的基因表達(dá)關(guān)系密切。

Attia SM等[13]研究表明，香菇多糖對DNA的損傷修護(hù)作用具有劑量依賴性。付青姐等[14]研究香菇多糖保護(hù)小鼠脾臟抵御輻射損傷的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，香菇多糖在2.5、0.5mg/kg的劑量下可明顯緩解輻射造成的脾臟損傷。許多研究也證實(shí)，香菇多糖的免疫調(diào)節(jié)作用具有一定的劑量依賴性。本研究表明，香菇多糖在不同劑量下基因的表達(dá)有一定差異性，所有的基因表達(dá)結(jié)果顯示，中劑量的香菇多糖能夠使5種離子通道的基因表達(dá)上調(diào)，而高劑量和低劑量香菇多糖對5種離子通道的基因表達(dá)雖有所影響，但是均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明香菇多糖在適宜劑量下可以上調(diào)5種離子通道的基因表達(dá)，調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞活性，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用。

綜上所述，香菇多糖具有增加T淋巴細(xì)胞的增殖和活性、調(diào)節(jié)免疫的作用，與提高離子通道KV1.3、KCa3.1、TRPM7、Clswell以及Ca2+通道調(diào)控元件STIM1、orai1的基因表達(dá)有密切關(guān)聯(lián)。

[1]Cahalan MD，Chandykg.The functional network of ion channels in T lymphocytes[J].Immunol Rev，2009，231（1）:59.

[2]Kuras Z，Yun YH，Chimote AA，et al.KCa3.1 and TRPM7 Channels at the uropod regulate migration of activated human T cells[J].PLoS One，2012，7（8）:e43859.

[3]Baldoli E，Castiglioni S，Maier JA.Regulation and function of TRPM7 in human endothelial cells:TRPM7 as a ootential novel regulator of endothelial function[J].PloS One，2013，8（3）:e59891.

[4]田舜蓮，江慧，施靜.TRPM7:一種具有離子通道和激酶活性的雙功能膜蛋白[J].生理科學(xué)進(jìn)展，2009，40（3）:253.

[5]劉麗娟，季波.我院2010年中藥注射劑應(yīng)用情況分析[J].中國藥房，2011，22（35）:3342.

[6]Wang G，Lin W，Zhao R，et al.Effects of six polysaccharides extracted from plants on the immunological cells of mice[J].Wei Sheng Yan Jiu，2008，37（5）:577.

[7]林卡莉，陳同強(qiáng)，黃志華，等.香菇多糖對荷瘤鼠免疫細(xì)胞及生存率的影響[J].時珍國醫(yī)國藥，2009，20（12）:3077.

[8]Wang Y，Li MC，F(xiàn)u QJ.Protective effects of lentinan against T lymphocytes injury in mice under chronic radiation stress[J].Chinese Herbal Medicines，2013，5（1）:62.

[9]Rao A，Hogan PG.Calcium signaling in cells of the immune and hematopoietic systems[J].Immunol Rev，2009，231（1）:5.

[10]Beeton C，Wulff H，Barbaria J，et al.Selective blockade of T lymphocyte K（+）channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis，a model for multiple sclerosis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（24）:13942.

[11]Lewis RS，Cahalan MD.The plasticity of ion channels:parallels between the nervous and immune systems[J].Trends Neurosci，1988，11（5）:214.

[12]Hu L，Pennington M，Jiang Q，et al.Characterization of the functional properties of the Voltage-Gated potassium channel KV1.3 in human CD4+T lymphocytes[J].J Immunol，2007，179（7）:4563.

[13]Attia SM，Harisa GI，Abd-Allah AR，et al.The influence of lentinan on the capacity of repair of DNA damage and apoptosis induced by paclitaxel in mouse bone marrow cells[J].J Biochem Mol Toxicol，2013，27（7）:370.

[14]付青姐，李明春，柳迎華.輻射對小鼠脾臟損傷及香菇多糖的保護(hù)作用[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2013，30（6）:606.