向紅，王雅莉，邱桐，金堯，楊雪芳（.甘肅中醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室/甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000；.甘肅中醫(yī)學(xué)院中藥資源教研室，蘭州 730000）

急性肺損傷發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜、致病環(huán)節(jié)多、病死率高，已成為臨床危重病學(xué)研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。但是，目前中醫(yī)、西醫(yī)都沒有確切的方法和藥物阻止其疾病發(fā)展[1-2]。紅芪為豆科植物多序巖黃芪（Hedysaryum Polybotrys）的干燥根[3]，紅芪水提物是從紅芪中提取的一種復(fù)合生物堿，研究已證實(shí)其可提高肺表面活性物質(zhì)含量、清除自由基、減少過氧化物酶和丙二醛生成、增強(qiáng)免疫力、抗衰老[4-7]。已有研究證明，紅芪水提物能減輕新生兒呼吸窘迫綜合征時(shí)肺臟的出血、充血、水腫及炎細(xì)胞浸潤，使肺表面活性物質(zhì)的分泌增加[8]。腫瘤壞死因子（TNF）-α是炎癥因子網(wǎng)絡(luò)的啟動(dòng)因子，白細(xì)胞介素（IL）-10與核因子（NF）-κB活化有關(guān)，二者在急性肺損傷的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[9-10]。本研究擬通過觀察紅芪水提物對(duì)急性肺損傷模型大鼠各病理指標(biāo)的影響，探討其對(duì)急性肺損傷模型大鼠的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

潔凈工作臺(tái)（天津市泰斯特儀器有限公司）；KX31型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；Microm HM315型切片機(jī)（美國Thermo公司）；YB-6LF型生物組織包埋機(jī)（湖北亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；FA1204B型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥材

紅芪生藥材由甘肅中醫(yī)學(xué)院中藥藥劑教研室提供，經(jīng)筆者鑒定為真品。

1.3 試劑

內(nèi)毒素（LPS，美國Sigma公司）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；TNF-α、IL-10免疫組化試劑盒（武漢博士德生物技術(shù)有限公司）。

1.4 動(dòng)物

SPF級(jí)Wistar成年大鼠60只，♀♂兼用，體質(zhì)量（200±20）g，購自甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用合格證號(hào):SCXK（甘）2011-0001-0000372]。

2 方法

2.1 復(fù)制模型與分組、給藥[11-14]

ip LPS（5mg/kg）以復(fù)制大鼠急性肺損傷模型。60只Wistar大鼠隨機(jī)均分為6組，即正常對(duì)照組（等容生理鹽水）組、模型（等容生理鹽水）組、地塞米松（10mg/kg）組與紅芪水提物高、中、低劑量（5.2、2.6、1.3 g/kg）組，復(fù)制模型4 h后ig給藥，每天1次，連續(xù)3 d。

2.2 指標(biāo)的檢測(cè)

2.2.1 肺系數(shù)（LI）、肺濕/干質(zhì)量比（W/D）與肺含水率的測(cè)定

末次給藥后，脫頸處死大鼠，取大鼠全肺，用濾紙吸取浮在臟器表面的血液或體液，用電子天平稱定質(zhì)量，按如下公式計(jì)算LI:LI＝肺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）×10。取大鼠左肺，稱濕質(zhì)量后，置烤箱中（60℃，48 h），取出，稱干質(zhì)量，然后計(jì)算W/D與肺含水率:W/D＝肺濕質(zhì)量（mg）/肺干質(zhì)量（mg）×100%；肺含水率＝（肺濕質(zhì)量－肺干質(zhì)量）/肺濕質(zhì)量×100%。

2.2.2 肺組織病理學(xué)檢測(cè) 取大鼠右肺中葉用4%甲醛固定48 h，切取肺組織塊2～4mm3常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，用蘇木紫-伊紅染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肺泡間隔病變、炎癥細(xì)胞浸潤、血管瘀血狀況等組織形態(tài)學(xué)變化。

2.2.3 免疫組化法檢測(cè)TNF-α、IL-10蛋白的表達(dá) 取大鼠右肺中葉組織，常規(guī)脫蠟、水化后，檸檬酸浸泡，高壓鍋加熱進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶和生物素，再按以下步驟進(jìn)行操作:①滴加正常山羊血清封閉，溫箱育10min，傾去，勿洗；②滴加一抗工作液（TNF-α、IL-10均稀釋150倍），37℃3 h，PBS沖洗3次，每次3min；③滴加二抗，37℃15min，PBS沖洗3次，每次3min；④滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液，37℃15min，PBS沖洗3次，每次3min；⑤滴加DAB顯色劑，3min后放入自來水中浸泡10min；⑥蘇木素復(fù)染2min，鹽酸酒精分化，再放入氨水中浸泡；⑦脫水、透明、封片，鏡下觀察。所有切片放大倍數(shù)為40倍，每張切片觀察隨機(jī)選取10個(gè)視野（直徑為1mm），利用LEICAQwin圖像分析軟件測(cè)定陽性反應(yīng)物相對(duì)含量的平均灰度值，以其單位面積平均灰度作為表達(dá)量的參數(shù)。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 紅芪水提物對(duì)模型大鼠LI、W/D與肺含水率的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠LI、W/D、肺含水率增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，紅芪水提物高、中、低劑量組大鼠LI、W/D、肺含水率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。紅芪水提物對(duì)模型大鼠LI、W/D與肺含水率的影響見表1。

表1 紅芪水提物對(duì)模型大鼠LI、W/D與肺含水率的影響（）Tab 1 Effects of water extract of H.polybotrys on LI，W/D and moisture content of lung in model rats（）

表1 紅芪水提物對(duì)模型大鼠LI、W/D與肺含水率的影響（）Tab 1 Effects of water extract of H.polybotrys on LI，W/D and moisture content of lung in model rats（）

與正常對(duì)照組比較:＊P＜0.01；與模型組比較:#P＜0.05vs.normal control group:＊P＜0.01；vs.model group:#P＜0.05

組別正常對(duì)照組模型組地塞米松組紅芪水提物高劑量組紅芪水提物中劑量組紅芪水提物低劑量組肺含水率，%80.24±1.9089.58±0.89＊83.61±1.10#83.33±1.46#86.69±1.17#86.92±0.75#n 101010101010 LI 0.55±0.0361.16±0.14＊0.65±0.069#0.60±0.068#0.78±0.090#0.84±0.070#W/D 5.10±0.469.66±0.82＊6.12±0.40#6.04±0.56#7.56±0.64#7.67±0.44#

3.2 紅芪水提物對(duì)模型大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)的影響

正常對(duì)照組大鼠肺組織未見明顯異常，肺泡結(jié)構(gòu)清晰，大小均勻，肺泡壁薄，肺泡隔微血管無充血、瘀血；模型組大鼠肺泡和肺間質(zhì)水腫，肺間隔明顯增寬，肺泡腔變窄，肺泡內(nèi)滲出物較多，炎性細(xì)胞浸潤，可見較多的中性粒細(xì)胞、紅細(xì)胞；地塞米松組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)尚清晰，破壞較輕，肺充血水腫減輕，炎性細(xì)胞浸潤現(xiàn)象明顯減輕或者消失；紅芪水提物高劑量組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔變窄，紅細(xì)胞及中性粒細(xì)胞滲出減輕，肺組織病理損傷明顯改善；紅芪水提物中、低劑量組大鼠肺泡腔內(nèi)出血程度、水腫及肺泡腔內(nèi)炎癥細(xì)胞數(shù)量低于模型組。紅芪水提物對(duì)模型大鼠肺組織病理學(xué)的影響見表2。

表2 紅芪水提物對(duì)模型大鼠肺組織病理學(xué)的影響Tab 2 Effects of water extract of H.polybotrys on histological changes of lung tissue in model rats

3.3 紅芪水提物對(duì)模型大鼠TNF-α、IL-10蛋白表達(dá)的影響

3.3.1 紅芪水提物對(duì)模型大鼠TNF-α蛋白表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠肺組織TNF-α蛋白表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，紅芪水提物高、中劑量組大鼠肺組織TNF-α蛋白表達(dá)減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。紅芪水提物對(duì)模型大鼠TNF-α蛋白表達(dá)的影響見表3。

表3 紅芪水提物對(duì)模型大鼠TNF-α蛋白表達(dá)的影響（）Tab 3 Effects of water extract of H.polybotrys on the expression of TNF-α protein in model rats（）

表3 紅芪水提物對(duì)模型大鼠TNF-α蛋白表達(dá)的影響（）Tab 3 Effects of water extract of H.polybotrys on the expression of TNF-α protein in model rats（）

與正常對(duì)照組比較:＊P＜0.01；與模型組比較:#P＜0.01vs.normal control group:＊P＜0.01；vs.model group:#P＜0.01

組別正常對(duì)照組模型組地塞米松組紅芪水提物高劑量組紅芪水提物中劑量組紅芪水提物低劑量組平均灰度值66.45±9.56128.06±10.13＊95.56±6.65#75.06±4.65#79.67±7.17#98.83±10.70 n 101010101010

3.3.2 紅芪水提物對(duì)模型大鼠IL-10蛋白表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠IL-10蛋白表達(dá)減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，紅芪水提物高、中、低劑量組大鼠IL-10蛋白表達(dá)增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。紅芪水提物對(duì)模型大鼠IL-10蛋白表達(dá)的影響見表4。

表4 紅芪水提物對(duì)模型大鼠IL-10蛋白表達(dá)的影響（）Tab 4 Effects of water extract of H.polybotrys on the expression of IL-10 protein in model rats（）

表4 紅芪水提物對(duì)模型大鼠IL-10蛋白表達(dá)的影響（）Tab 4 Effects of water extract of H.polybotrys on the expression of IL-10 protein in model rats（）

與正常對(duì)照組比較:＊P＜0.01；與模型組比較:#P＜0.01vs.normal control group:＊P＜0.01；vs.model group:#P＜0.01

組別正常對(duì)照組模型組地塞米松組紅芪水提物高劑量組紅芪水提物中劑量組紅芪水提物低劑量組平均灰度值112.06±10.1366.45±9.56＊106.07±7.17#98.56±6.65#94.83±10.70#82.52±10.13#n 101010101010

4 討論

本研究中，ip LPS以后，大鼠肺組織出現(xiàn)明顯腫脹、全肺充血，LI、W/D及肺含水率明顯升高，光鏡下大鼠肺組織呈現(xiàn)明顯的急性肺損傷病理變化，說明急性肺損傷模型復(fù)制成功。ig紅芪水提物后各組大鼠肺損傷程度明顯改善，提示紅芪水提物可以有效地改善急性肺損傷狀況，使大鼠肺組織腫脹減輕，LI、W/D及肺含水率下降，肺組織病理損傷指標(biāo)明顯改善。同時(shí)，與模型組比較，紅芪水提物高、中、低劑量組大鼠TNF-α蛋白表達(dá)水平明顯減弱，紅芪水提物高、中劑量組大鼠IL-10表達(dá)明顯增強(qiáng)，證實(shí)了紅芪對(duì)炎性因子的調(diào)節(jié)作用，說明紅芪可以通過降低TNF-α等前炎性反應(yīng)因子、增強(qiáng)抗炎因子IL-10的表達(dá)，重建體內(nèi)炎癥介質(zhì)/抗炎介質(zhì)的平衡，從而抑制急性肺損傷的發(fā)展，對(duì)急性肺損傷模型大鼠具有保護(hù)作用。其中，紅芪水提物高劑量組效果明顯，其對(duì)TNF-α和IL-10蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用均優(yōu)于中、低劑量組。紅芪水提物對(duì)TNF-α與IL-10調(diào)節(jié)的作用機(jī)制可能是[15-16]:（1）紅芪水提物通過降低細(xì)胞前炎癥因子，從而抑制中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞炎癥介質(zhì)的釋放；（2）紅芪水提物可以改善肺泡細(xì)胞的缺氧和營養(yǎng)缺乏，增強(qiáng)抗炎因子的表達(dá)；（3）紅芪水提物能夠修復(fù)受損的內(nèi)皮細(xì)胞，阻斷其與中性粒細(xì)胞的黏附，從而抑制其他炎癥介質(zhì)，如前列腺素、IL-6和IL-8等的釋放。

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