張鑫宇，左偉勇，朱善元，夏曉莉，孫懷昌*

(1.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇 揚州 225009；2.江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術學院，江蘇 泰州 225300)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由ASF病毒(ASFV)引起的一種家豬和野豬的烈性傳染病，具有死亡率高和傳播迅速的特點，給疫區(qū)國家造成嚴重的經濟損失[1]。該病最早發(fā)現(xiàn)于肯尼亞[2]，隨后逐漸在非洲、歐洲和美洲等數(shù)十個國家傳播，并有繼續(xù)蔓延的趨勢[3]。近幾年來，我國周邊國家格魯吉亞、亞美尼亞、阿塞拜疆、俄羅斯等國先后發(fā)生多起ASF疫情[4]，但我國暫未發(fā)現(xiàn)ASF，因而建立有效的檢測方法對防止該病進入國內具有重要意義。

OIE推薦的ASF實驗室檢測方法有病毒分離、PCR、ELISA和熒光抗體試驗等[5]，這些診斷方法一般限制在ASFV參考實驗室內進行。Beggs等首次用膠體金快速免疫層析法(GICA)測定人絨毛膜促性腺激素[6]，后來逐步應用到微生物病原、抗體的快速檢測[7-8]，該方法具有快速、靈敏、特異等優(yōu)點，尤其適合臨床的快速診斷。ASFV E183L基因編碼的p54蛋白存在于病毒粒子內層囊膜，參與病毒的吸附與進入[9-10]，該蛋白可以刺激機體產生具有一定中和能力的抗體[11]，可以作為ASFV抗體診斷抗原[12]。本研究將表達的重組p54蛋白標記上膠體金顆粒，制備了一種ASFV抗體快速檢測膠體金試紙，在5 min～10 min內可以判定結果，適合臨床ASF血清學快速診斷、流行病學調查以及生豬國際貿易檢疫檢驗。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料及實驗動物 pET-30a(+)表達載體購自Novagen公司；大腸桿菌BL21(DE3)購自海基生物科技有限公司；pGEX-4T-1-E183L由葡萄牙Gulbenkian de Ciência研究所RM Parkhouse博士惠贈；豬瘟病毒(CSFV)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬細小病毒(PPV)及豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)抗體陽性血清均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所丁家波博士惠贈；ASFV抗體陽性和陰性豬血清、ASFV診斷抗原(ASF AG CYTO-SOL 92/1)由英國Pirbright研究所OIE ASF參考實驗室提供；所有工具酶購自TaKaRa公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗豬IgG(IgG-HRP)、氯金酸(HAuCl4)、牛血清白蛋白(BSA)、葡萄球菌A蛋白(SPA)、弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑購自Sigma公司；His親和層析凝膠購自Qiagen公司；CN1403硝酸纖維素膜購自Sartorius公司；硬質塑料底板、黏附吸水濾紙、玻璃纖維素膜以及塑料殼購自上海杰一生物技術有限公司；XYZ3060膠體金點樣系統(tǒng)為Biodot公司產品；2月齡姜曲海豬由江蘇省畜牧獸醫(yī)技術學院種豬場提供。

1.2 p 54基因片段亞克隆 利用DNAStar軟件包中Protean軟件對Ba71V株ASFV p54氨基酸序列進行分析，表明其前50個氨基酸為疏水性氨基酸集中區(qū)，不僅無潛在的B細胞表位，而且可能影響其在原核細胞中可溶性表達。從編碼第51個氨基酸DNA序列(GenBank FJ174390)開始，設計一對特異性引物：正向引物：5-TAGAATTCCTATTCTCTTCA AGAAAG-3；反向引物：5-TACTCGAGTTACAAGG AGTTTTCTAGG-3。

以質粒pGEX-4T-1-E183L為模板，擴增的p54基因片段(402 bp)，擴增產物經EcoRⅠ、XhoⅠ酶切后，連入載體pET-30a(+)，獲得重組質粒pETE183L，并轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞。

1.3 重組p 54蛋白表達、純化及鑒定 按照文獻[13]中的方法進行重組蛋白p54的誘導表達，超聲波破碎裂解細菌，SDS-PAGE對表達的重組蛋白進行初步鑒定。

按照Qiagen公司說明書，用His親和層析凝膠純化表達的重組蛋白，ND-1000紫外分光光度計定量蛋白，并用0.01 M pH7.4 PBS調整最終濃度為1 mg/mL。SDS-PAGE分析重組蛋白的純度。

以ASFV抗體陽性豬血清為一抗(1∶200)，以羊抗豬 IgG-HRP 為二抗(1∶10000)，western blot鑒定純化的重組蛋白。

1.4 抗p 54重組蛋白多抗制備 將1 mg純化的重組p54蛋白與等體積弗氏完全佐劑混合，乳化，肌肉注射2月齡姜曲海豬；免疫后第11 d，肌肉注射同樣劑量弗氏不完全佐劑乳化的重組蛋白；10 d后加強免疫1次。加強免疫后第7 d，無菌采集豬血，分離血清，以5 μg/mL重組蛋白p54包被酶標板，與連續(xù)10倍稀釋的豬血清進行間接ELISA，測定p54蛋白抗體的ELISA效價，同時設立陰性豬血清對照。飽和硫酸銨法沉淀免疫血清中的IgG，PBS 4℃透析過夜，紫外分光光度計測定蛋白濃度，-20℃保存。

1.5 重組p 54蛋白膠體金標記

1.5.1 膠體金溶液制備 用超純水配制0.01%HAuCl4溶液和1%枸櫞酸三鈉溶液，0.45 μm濾膜過濾配制的溶液，去除其中的聚合物以及其他可能混入的雜質，參照文獻[14]制備直徑為20 nm的膠體金。

1.5.2 重組p54蛋白預處理 PBS 4℃透析處理制備的p54重組蛋白，再用0.005%pH7.0的NaCl溶液4℃透析，除去蛋白中的高濃度鹽離子。10000×g 4℃離心1 h，去除蛋白聚合物。

1.5.3 重組p54蛋白膠體金標記及純化 參照文獻[15]，確定重組蛋白p54標記膠體金時的最佳pH以及最佳蛋白標記劑量。根據(jù)上述實驗結果，10 mL膠體金溶液中加入適量重組p54蛋白溶液，繼續(xù)攪拌30 min；緩慢加入適量的10%BSA，使其終濃度為1%，攪拌30 min；1200×g 4℃離心15 min，取上清液；12000×g 4℃離心30 min，棄上清液，沉淀用1 mL 0.01 mol/L pH9.2硼酸鹽緩沖液(含5%蔗糖、1%BSA、0.5%Tween-20、0.2%PEG20000以及0.02%疊氮鈉)懸浮。

1.6 試紙制備及判定

1.6.1 試紙組裝 采用XYZ3060膠體金點樣系統(tǒng)以2 μL/cm的噴量在玻璃纖維膜金標墊上均勻噴涂濃度為0.3 mg/mL金標抗原，37℃烘箱干燥1 h；以1 μL/cm噴量在硝酸纖維素膜噴涂 1 mg/mL SPA、0.5 mg/mL抗p54 IgG，分別作為檢測線(T線)和質控線(C線)，兩者線間距為5 mm，干燥后切割成4 mm寬的硝酸纖維素膜條，進行組裝[16]，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 檢測判定標準 吸取40 μL稀釋的血清，滴加于膠體金試紙的加樣孔中，室溫靜置5 min～10 min，判定結果。質控線和檢測線均出現(xiàn)紅色條帶為陽性；質控線出現(xiàn)紅色條帶，檢測線處無紅色條帶為陰性；質控線無紅色條帶則該試紙失效。

1.7 特異性試驗 用制備的膠體金試紙檢測已知的CSFV、PRV、PRRSV、PPV、PCV-2以及ASFV抗體陽性豬血清，并根據(jù)上述標準判定結果。

1.8 敏感性試驗 用PBS將制備的抗P54多抗分別稀釋至終濃度1000 ng/mL、800 ng/mL、600 ng/mL、400 ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL，取 40 μL 上述稀釋液滴加于試紙的加樣孔中，室溫靜置5 min～10 min，肉眼觀察并判定結果。

1.9 重復性試驗 取同一批次及3個不同批次制備的膠體金試紙對10份ASFV抗體陽性和10份ASFV抗體陰性的豬血清進行檢測，并比較檢測結果。

1.10 試紙比對試驗 將ASFV診斷抗原以23 μg/mL濃度包被酶標板，OIE間接ELISA[6]檢測141份待檢豬血清，其中26份為健康豬血清，24份為ASFV弱毒OURT88/3接種后第13 d的豬血清，34份為ASFV強毒(ASFV OURT88/1、Benin以及Georgia)攻毒后存活下來豬的血清，57份為剛果民主共和國疫區(qū)豬血清；同時采用western blot以及膠體金試紙對上述血清進行驗證，比較3種方法的檢測結果。

2 結 果

2.1 p 54基因亞克隆 PCR擴增編碼ASFVp54(aa 51～aa 183)基因，將其連入載體pET-30a(+)，采用EcoRⅠ和XhoⅠ進行酶切鑒定。結果表明重組質粒pET-E183L構建正確(圖1)。

圖1 重組質粒pET-E183L鑒定結果Fig.1 Identification of recombinant plasmid of pET-E183L

2.2 重組p 54蛋白表達、純化及鑒定 pET-E183L/BL21重組菌經IPTG誘導表達，SDS-PAGE電泳結果顯示，表達了約為21 ku的重組蛋白；親和層析法純化表達的重組蛋白，經分析，純化后的重組蛋白純度達94%；western blot試驗表明，該蛋白能夠與ASFV抗體陽性血清發(fā)生特異性反應(圖2)。

圖2 純化的重組p54蛋白western blot鑒定Fig.2 Identification of purified p54 by western blot

2.3 重組p 54蛋白多抗制備 將制備的重組p54蛋白免疫健康豬3次，分離豬血清，間接ELISA測定p54抗體，結果顯示制備的多抗與重組蛋白反應良好，效價達到 1∶106。

2.4 重組p 54蛋白膠體金標記 對膠體金標記條件進行優(yōu)化，結果表明最佳標記pH為8.0，最佳蛋白標記濃度為5 μg/mL。

2.5 特異性試驗 用制備的膠體金試紙對CSFV、PRV、PRRSV、PPV、PCV-2以及ASFV抗體陽性豬血清進行檢測，結果顯示，僅ASFV抗體陽性豬血清呈陽性反應，而其他血清均呈陰性反應(圖3)，表明該方法具有高度的特異性。

圖3 膠體金試紙?zhí)禺愋栽囼濬ig.3 Specificity of the colloidal gold strips

2.6 敏感性比較試驗 將制備的抗P54多抗梯度稀釋后，分別用膠體金試紙進行檢測，結果顯示當稀釋至200 ng/mL時，結果仍呈陽性，而100 ng/mL時呈陰性(圖4)。

圖4 膠體金試紙敏感性試驗Fig.4 Sensitivity of the colloidal gold strips

2.7 重復性試驗 用同一批次和不同批次膠體金試紙對10份ASFV抗體陽性和10份ASFV抗體陰性豬血清進行檢測，結果顯示，批內及批間檢測符合率為100%。

2.8 試紙條比對試驗 采用OIE ELISA、western blot以及膠體金試紙條對26份健康豬血清、24份ASFV弱毒免疫后第13 d采集的豬血清、34份ASFV強毒攻毒后存活豬血清以及57份剛果民主共和國疫區(qū)豬血清進行檢測，檢測結果如表1。以western blot為參照標準，OIE ELISA和膠體金試紙條檢測剛果民主共和國的豬血清與其陽性符合率分別為87.5%(42/48)和 91.7%(44/48)。

表1 不同ASFV抗體檢測方法比對Table 1 Comparison of different methods in detecting antibodies to ASFV

3 討 論

由于ASF可以感染各種年齡段的家豬和野豬，并且目前沒有預防該病的疫苗，因此快捷、準確的檢測方法是防止該病擴散蔓延的重要手段之一。OIE規(guī)定的檢測方法主要包括兩方面：一是病原檢測，這需要特定的儀器設備和專業(yè)的技術人員；二是血清學檢測，在ASF流行疫區(qū)和低毒力ASFV初期感染的地區(qū)，血清學方法是首推的診斷方法，其中最常用的是間接ELISA，所用包被抗原為病毒感染細胞的裂解物[5]，在制備抗原時，有散毒的風險，診斷陽性的血清還需用其他的免疫學方法進一步驗證。

膠體金免疫層析技術是近年來發(fā)展迅速的一項診斷技術，具有操作簡便、檢測靈敏度和特異性高、攜帶方便、肉眼直接觀察等優(yōu)點，與ELISA方法相比，更適合臨床和基層單位的使用。前期研究表明，ASFV感染后，結構蛋白p54激發(fā)豬體產生的抗體時間較早，抗體滴度高(數(shù)據(jù)尚未公開)，而SPA又可以與豬IgG及部分IgM結合。在此基礎上制備了以重組p54蛋白(aa 51～183 aa)為抗原，SPA捕捉膠體金標記的p54抗原抗體復合物為檢測系統(tǒng)的膠體金免疫層析試紙。通過對常見豬源CSFV、PRV、PRRSV、PPV、PCV-2抗體陽性的豬血清檢測，表明制備的膠體金試紙具有特異性良好，批內、批間重復性高的特點。

用該膠體金試紙檢測ASFV弱毒免疫后第13 d的豬血清，抗體檢測陽性率為100%，而OIE ELISA檢出陽性率為33.3%。Gallardo等認為這是由于待檢血清保存不善造成的[17]，本實驗中所用的血清保存了約兩年，抗體滴度可能有所下降，從而導致ELISA檢測敏感性降低；另外，最主要的是OIE ELISA包被的抗原為ASFV病毒感染細胞后提取的可溶性成分，在實際檢測中背景值較高，對于一些抗體滴度較低的血清樣品，高的背景值會影響陰性臨界值的確定，造成檢測結果的假陰性，OIE也認為用表達純化的蛋白作為ELISA包被抗原，檢測效果會更好[5,17]。在檢測ASFV抗體陰性和強陽性豬血清時，試紙條與OIE ELISA、western blot結果完全一致；對來自剛果民主共和國疫區(qū)幸存豬ASFV抗體檢測時，膠體金試紙檢測陽性率高于OIE ELISA和 western blot， 以 western bolt檢測結果為參照，膠體金試紙檢測符合率更高。上述結果表明，所制備的膠體金檢測試紙條比OIE ELISA具有更高的檢測準確性，尤其在ASFV感染早期的檢測。

[1]Straw B E,Zimmerman J J,Allaire S D,et al.Disease of Swine.9th ed[M].Wiley-Blackwell Publishing,2006.

[2]Montgomery R E.On a for m of swine fever occurring in British East Africa(Kenya Colony)[J].J Comp Pathol,1921,34:59-191.

[3]Nix R J,Gallardo C,Hutchings G,et al.Molecular epidemiology of African swine fever virus studied by analysis of four variable genome regions[J].Arch Virol,2006,151:2475-2494.

[4]Sánchez-Vizcaíno J M,Mur L,Martínez-López B.African swine fever:an epidemiologic update[J].Transbound Emerg Dis,2012,59:1-9.

[5]OIE.African swine fever.In:Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals[M].Office International des Epizooties,Paris,France(Chapter 2.8.1,NB:version adopted in May 2012).

[6]Beggs M,Novotny M,Samocdro S.A self performing chromatographic immunoassay for the qualitative determination of human chorionic gonadotrophin in urine and serum[J].Clin Chem,1990,36:1084-1085.

[7]夏興霞，孟祥升，王永山，等.大腸桿菌O157∶H7膠體金免疫層析檢測試紙條在感染牛和小鼠排菌檢測中的應用[J].中國獸醫(yī)科學，2012，42(3)：285-289.

[8]王鐵成，張濤，楊松濤，等.狂犬病病毒抗體膠體金檢測試紙的制備[J].生物工程學報，2011，27(5)：799-804.

[9]Rodriguez J M,Garcia-Escudero R,Salas M L,et al.African swine fever virus structural protein p54 is essential for the recruitment of envelope precursors to assembly sites[J].J Virol,2004,78(8):4299-4313.

[10]Gomez-Puertas P,Rodriguez F,Oviedo J M,et al.The African swine fever virus proteins p54 and p30 are involved in two distinct steps of virus attachment and both contribute to the antibody-mediated protective immune response[J].Virology,1998,243:461-471.

[11]Ruiz G F,Carnero M E,Caballero C,et al.Inhibition of African swine fever infection in the presence of immune serain vivoandin vitro[J].Am J Vet Res,1986,47(6):1249-1252.

[12]Gallardo C,Reis A L,Kalema-Zikusoka G,et al.Recombinant antigen targets for serodiagnosis of African swine fever[J].Clin Vaccine Immunol,2009,16(7):1012-1020.

[13]李新蘋，劉歡歡，普燕，等.重組凝乳酶原基因的原核表達及其抗血清的制備[J].細胞與分子免疫學雜志，2012，28(7)：715-721.

[14]高利利，程金平，劉元嫄，等.軟骨藻酸膠體金免疫層析檢測試紙條的研制[J].環(huán)境科學，2011，32(8)：2492-2496.

[15]宋陽威，張鑫宇，張常印，等.牛白血病病毒GP51蛋白在大腸桿菌中表達及膠體金免疫層析試紙條檢測方法的建立[J].中國預防獸醫(yī)學報，2010，32(4)：272-275.

[16]Jiang Tao,Liang Zhong,Ren Wei-wei,et al.A simple and rapid colloidal gold-based immunochromatogarphic strip test for detection of FMDV serotype A[J].Virol Sin,2011,26(1):30-39.

[17]Gallardo C,Blanco E,Rodriguez J M,et al.Antigenic properties and diagnostic potential of African swine fever virus protein pp62 expressed in insect cells[J].J Clin Microbiol,2006,44(3):950-956.