鄺素娟，鄧春玉，楊 慧，饒 芳，劉曉穎，張夢(mèng)珍，朱杰寧，單志新，林秋雄，楊 敏，余細(xì)勇

［廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）醫(yī)學(xué)研究中心，廣東省心血管病研究所，廣東廣州 510080］

器官培養(yǎng)是將部分或整體器官在不損傷正常組織結(jié)構(gòu)的條件下進(jìn)行體外培養(yǎng)的技術(shù)。它與整體實(shí)驗(yàn)相比，具有條件恒定、因素單一、便于干預(yù)的優(yōu)點(diǎn)。與細(xì)胞培養(yǎng)相比，能更客觀地反映細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互聯(lián)系，并避免細(xì)胞異質(zhì)性和容易老化等缺點(diǎn)［1］。血管的器官培養(yǎng)因其組織結(jié)構(gòu)和功能系統(tǒng)的完整性，為研究藥物或生理活性物質(zhì)的長(zhǎng)效作用提供了有效的方法［2］。目前血管培養(yǎng)應(yīng)用比較多的是大血管。微細(xì)動(dòng)脈尤其是冠狀動(dòng)脈，因其血管壁平滑肌數(shù)量少、血管壁薄、管腔小，操作難度大，目前國(guó)內(nèi)甚少報(bào)道。但不同部位的血管存在異質(zhì)性，為建立微細(xì)動(dòng)脈的培養(yǎng)模型，以便于對(duì)微血管的功能進(jìn)行研究，本文采用大鼠冠狀動(dòng)脈血管環(huán)進(jìn)行培養(yǎng)，并利用工具藥檢測(cè)了其舒縮功能，發(fā)現(xiàn)本方法簡(jiǎn)單可行，可用于進(jìn)行微血管舒縮功能的研究，現(xiàn)將方法介紹如下。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 5-羥色胺（5-hydroxy tryptamine，5-HT）、血栓素 A2類似物 （9，11-Dideoxy-11α，9α-epoxymethanoprostaglandin，U46619）、乙酰膽堿（acetylcholine，ACh），均購(gòu)于Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基和青鏈霉素雙抗購(gòu)于Gibco BRL公司；胎牛血清購(gòu)于Hyclone公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)溶液 Krebs-Henseleit（K-H）溶液（mmol·L－1）：NaCl 119，NaHCO325，MgCl2·6H2O 1，KCl 4.7，KH2PO41.2，CaCl22.5，D-Glucose 11.1。高鉀 K-H溶液（含60 mmol·L－1KCl）：NaCl 63.7，NaHCO325，MgCl2·6H2O 1，KCl 60，KH2PO41.2，CaCl22.5，D-Glucose 11.1。高鉀無鈣液：用EGTA 0.05代替高鉀溶液中的CaCl2，其余成分與高鉀溶液的相同。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Sprague-Dawley（SD）大鼠，♂，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK（粵）2009-0011。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 610M型多通道血管張力測(cè)定儀（DMT公司，丹麥），PowerLab 8／30生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)（AD公司，澳大利亞）；DK-8D型電熱恒溫水槽（上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠）。StemiDV4型體視顯微鏡（ZEISS公司，德國(guó)）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)用品的消毒準(zhǔn)備 手術(shù)器械、顯微器械及固定心臟的硅膠脂盤用的75%乙醇浸泡消毒30 mim，然后用滅菌的去離子水沖洗數(shù)遍。PBS及其它用品高壓消毒，實(shí)驗(yàn)室環(huán)境用紫外燈照射30 min。

2.2 冠狀動(dòng)脈血管環(huán)的分離及培養(yǎng) 取SD大鼠，采用頸椎脫臼法處死并將其固定好，先用75%酒精棉球消毒胸腹部皮膚，用大組織鑷、組織剪剪開胸腹部皮膚，換另一組織鑷、組織剪剪開劍突下腹部肌肉及胸廓兩側(cè)，向上翻起胸廓充分暴露心臟，眼科鑷和眼科彎剪剪斷胸主動(dòng)脈等組織，取下心臟，放入4℃預(yù)冷的無菌PBS液中，并用PBS液沖洗3次，以洗凈殘余血液及血塊。在冰浴條件下顯微操作分離冠狀動(dòng)脈，以降低細(xì)胞組織的代謝，更好地維持血管的活性。操作時(shí)小心去除冠脈外周的心肌組織，避免鉗夾、牽拉血管，以免損傷血管平滑肌，修剪時(shí)注意保護(hù)血管壁的完整性，不要剪破管壁而影響張力。游離出冠狀動(dòng)脈，并剪成1.8～2.0 mm的血管環(huán)，置于培養(yǎng)皿中，用DMEM-F12培養(yǎng)基洗1遍，再加入2 ml含10%胎牛血清、1∶100雙抗的DMEM-F12培養(yǎng)基，在37℃、95%O2和5%CO2的通氣條件下孵育24 h。

2.3 血管環(huán)的固定 將培養(yǎng)好的血管環(huán)穿上兩根直徑40 μm的不銹鋼絲，平行固定于浴槽內(nèi)的兩個(gè)鉗夾上，一個(gè)鉗夾連接到螺旋測(cè)微器，用于調(diào)整脈管的周長(zhǎng)，另一個(gè)鉗夾連接到一個(gè)內(nèi)置的高靈敏度張力傳感器。浴槽內(nèi)預(yù)先放置5 ml 37℃預(yù)溫的K-H液。調(diào)節(jié)基礎(chǔ)張力至1.5 mN，平衡60 min，期間每隔15 min換液1次，并使張力維持在1.5 mN。在加入不同藥物后，血管張力的變化信號(hào)通過張力傳感器，再經(jīng)過數(shù)模轉(zhuǎn)換器輸入計(jì)算機(jī)，完成記錄。實(shí)驗(yàn)全程浴槽內(nèi)的K-H液持續(xù)通以含95%O2和5%CO2的混合氣，溫度控制在37℃±0.5℃。

2.4 血管功能性檢測(cè)［3］首先用含 60 mmol·L－1KCl的高鉀溶液刺激血管，檢測(cè)血管張力的反應(yīng)性。把浴槽內(nèi)的K-H液換成含高鉀的K-H液。高鉀使冠狀動(dòng)脈環(huán)產(chǎn)生收縮反應(yīng)，維持5 min待張力穩(wěn)定后，以5 min末的激活張力作為100%（張力單位為mN／mm），充分沖洗（沖洗5次，每次間隔5 min）至基線，間隔30 min后，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。前后兩次高鉀刺激，血管收縮的幅度相差不超過10%的用于下一步實(shí)驗(yàn)。

2.5 各種血管舒縮藥物對(duì)培養(yǎng)的冠狀動(dòng)脈環(huán)的作用 對(duì)血管功能性檢測(cè)合格的血管，采用累積給藥法，向浴液中分別加入各濃度梯度的血管收縮藥物5-HT、U46619、CaCl2及血管舒張藥物ACh，記錄血管張力的變化。

2.6 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以兩次高鉀誘發(fā)收縮張力的均值作為標(biāo)準(zhǔn)值100%，各收縮劑／高鉀收縮的幅度的百分比來表示；血管舒張劑是以收縮劑誘發(fā)的最大穩(wěn)定收縮幅度定為標(biāo)準(zhǔn)值100%，血管舒張／收縮的幅度以占標(biāo)準(zhǔn)值的百分比來表示，EC50表示產(chǎn)生50%最大效應(yīng)時(shí)的藥物濃度，pD2為產(chǎn)生最大效應(yīng)的50%時(shí)激動(dòng)劑摩爾濃度的負(fù)對(duì)數(shù)，pD2＝－lg（EC50）。所有數(shù)據(jù)均以ˉx±s表示，采用Prism3.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合，繪制收縮及舒張曲線，并根據(jù)E-quation 1求得lgEC50和最大收縮或舒張百分比的變化值（Emax）。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3．1 冠狀動(dòng)脈環(huán)對(duì)血管收縮劑5-HT的反應(yīng) 采用累積給藥法，加入5-HT，使浴槽中藥物濃度分別達(dá)到0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10μmol·L－1，記錄血管張力的變化。結(jié)果如下圖所示，培養(yǎng)的冠狀動(dòng)脈環(huán)對(duì)5-HT產(chǎn)生明顯的濃度依賴性收縮反應(yīng)，pD2為（7.02±0.58），Emax為（147.86±0.21）%，（n＝10），見 Fig 1。

Fig 1 Concentration-dependent contractive response of organ cultured coronary arterial rings induced by 5-HT（0.003－10μmol·L－1）

3．2 冠狀動(dòng)脈環(huán)對(duì)血管收縮劑U46619的反應(yīng) 采用累積給藥法，加入U(xiǎn)46619，使浴槽中藥物濃度分別達(dá)到0.01、0.03、0.1、0.3、1、3μmol·L－1，記錄血管張力的變化。結(jié)果如Fig 2所示，培養(yǎng)的冠狀動(dòng)脈環(huán)對(duì)U46619產(chǎn)生明顯的濃度依賴性收縮反應(yīng)，pD2為（6.48±0.28），Emax為（130.31±0.36）%，（n＝5）。

Fig 2 Concentration-dependent contractive response of organ cultured coronary arterial rings induced by U46619（0.01－3μmol·L－1）

Fig 3 Concentration-dependent contractive response of organ cultured coronary arterial rings induced by CaCl2（0.01－5 mmol·L－1）

Fig 4 ACh（0．003－30μmol·L－1）induced concentration-dependent relaxation of organ cultured coronary arterial rings after the 5-HT induced contraction

3．3 冠狀動(dòng)脈環(huán)對(duì)CaCl2的反應(yīng) 把浴槽中的K-H液換成無鈣高鉀溶液，待血管穩(wěn)定后，采用累積給藥法，加入CaCl2，使浴槽中藥物濃度分別達(dá)到 0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、5 mmol·L－1，記錄血管張力的變化。結(jié)果如Fig 3所示，培養(yǎng)的冠狀動(dòng)脈環(huán)對(duì)CaCl2產(chǎn)生明顯的濃度依賴性收縮反應(yīng)。pD2為（3.54±0.19），Emax為（131.56±0.41）%，（n＝7）。

3．4 冠狀動(dòng)脈環(huán)對(duì)血管舒張劑ACh的反應(yīng) 先用2μmol·L－15-HT預(yù)收縮血管環(huán)，待張力穩(wěn)定后加入ACh，使浴槽中藥物濃度達(dá)到 0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30 μmol·L－1，記錄血管張力的變化。結(jié)果如Fig 4所示，5-HT預(yù)收縮的離體培養(yǎng)的冠狀動(dòng)脈環(huán)對(duì)ACh產(chǎn)生舒張反應(yīng)，與5-HT預(yù)收縮的最大張力相比，呈濃度依賴性舒張作用，pD2為（6.99±0.23），Emax為（78.12±0.13）%，（n＝4）。

4 討論

血管器官培養(yǎng)的方法有多種，有簡(jiǎn)單孵育法、格柵培養(yǎng)法、瓊脂孔培養(yǎng)法等，其中最簡(jiǎn)單易行的是簡(jiǎn)單孵育法。此方法與細(xì)胞培養(yǎng)相比能更好地體現(xiàn)了血管作為一個(gè)整體的結(jié)構(gòu)和功能。

本文采用簡(jiǎn)單孵育法，以頸椎脫臼法處死大鼠，分離出冠狀動(dòng)脈環(huán)進(jìn)行體外培養(yǎng)。冠狀動(dòng)脈環(huán)培養(yǎng)24 h后，用兩根不銹鋼絲平行穿過血管腔，固定于張力測(cè)定儀的鉗夾上，對(duì)血管平滑肌進(jìn)行張力測(cè)定。發(fā)現(xiàn)血管收縮劑5-HT、U46619及CaCl2能使其產(chǎn)生濃度依賴性收縮，血管舒張劑ACh能使其產(chǎn)生濃度依賴性舒張，說明體外培養(yǎng)的離體冠狀動(dòng)脈平滑肌具有其類似于在體時(shí)的舒縮功能，此方法能用于進(jìn)行血管平滑肌舒縮功能的研究。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)血管的器官培養(yǎng)及張力測(cè)定的研究多見于大血管如主動(dòng)脈，微血管尤其是冠狀動(dòng)脈因其壁薄腔小，難于從組織完整分離而不損傷平滑肌，穿鋼絲做張力測(cè)定時(shí)又極易損傷血管內(nèi)皮，因此分離微血管做張力測(cè)定的操作難度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于大血管，筆者認(rèn)為操作中應(yīng)注意以下幾點(diǎn)。首先，動(dòng)物處死方法的選擇。動(dòng)物處死的方法有多種，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹⑷〔牟课贿x擇不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方法。頸椎脫臼處死法是大、小鼠最常用的處死方法，并且可避免麻醉藥對(duì)某些血管平滑肌的功能造成影響，進(jìn)行血管張力實(shí)驗(yàn)應(yīng)盡量采用此法。不管采用哪一種方法，都應(yīng)遵循安樂死的原則，使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物短時(shí)間無痛苦地死亡。其次，在血管的分離過程中要在冰浴下進(jìn)行，盡量降低組織代謝，保持血管良好的活性。游離血管時(shí)不要鉗夾、牽拉血管以免損傷平滑肌。外周的脂肪組織要去除干凈，因?yàn)檠芡饽ぶ車炯?xì)胞可釋放脂肪源性舒張因子，降低離體動(dòng)脈對(duì)收縮物質(zhì)的收縮反應(yīng)。在穿鋼絲時(shí)手要穩(wěn)，盡量在血管腔中間一次穿過，避免鋼絲刺到管壁平滑肌。穿血管的鋼絲應(yīng)保持筆直，避免折曲而損傷血管內(nèi)皮。張力測(cè)定全程通以混合氣，氣流的速度應(yīng)控制好（以3～5個(gè)氣泡／秒為宜），氣泡太大或太快會(huì)沖擊血管環(huán)及鋼絲，影響張力的測(cè)定，太小則不能為離體血管提供足夠的氧氣?？傊?，操作中保持血管平滑肌的完整性與良好活性是血管張力測(cè)定實(shí)驗(yàn)得以進(jìn)行的前提。本研究成功建立的冠狀動(dòng)脈環(huán)培養(yǎng)及張力測(cè)定技術(shù)，為研究各種因素對(duì)微血管的功能性影響提供了新的手段。

器官培養(yǎng)與細(xì)胞培養(yǎng)相比，具有相對(duì)的完整性，能更客觀地反映細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互關(guān)系。而單個(gè)細(xì)胞的體外培養(yǎng)，缺乏細(xì)胞間的聯(lián)系及信號(hào)的刺激，可致表面受體功能喪失和基因產(chǎn)物停止表達(dá)，失去其在器官水平時(shí)的形態(tài)甚至功能。例如，血管平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)，其表型可發(fā)生改變，可由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?。血管的器官培養(yǎng)則避免了這些影響，可有效彌補(bǔ)細(xì)胞培養(yǎng)的不足，在培養(yǎng)過程中還可于培養(yǎng)基中添加各種藥物和體液因子，因而越來越廣泛應(yīng)用于血管醫(yī)學(xué)的研究，尤其是研究血管平滑肌舒縮功能方面。

有文獻(xiàn)報(bào)道［4－5］胎牛血清可減弱收縮劑誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)大鼠腸系膜動(dòng)脈平滑肌收縮與內(nèi)皮依賴性舒張，而無血清的器官培養(yǎng)也可能導(dǎo)致血管出現(xiàn)一些功能的改變，例如收縮功能降低，受體激動(dòng)劑敏感性增加以及受體表達(dá)水平的改變［6－9］。不同器官的血管分布的受體種類和數(shù)量不一，存在著異質(zhì)性。本研究進(jìn)行器官培養(yǎng)的血管是大鼠冠脈，用無血清、胎牛血清的培養(yǎng)是否能引起類似的結(jié)果還不太清楚。下一步實(shí)驗(yàn)擬研究用無血清、胎牛血清和自體血清進(jìn)行血管器官培養(yǎng)，觀察與急性分離的血管平滑肌舒縮功能的差異。

當(dāng)然，器官培養(yǎng)屬于體外培養(yǎng)，血管處于一種松弛不受力的狀態(tài)，在此狀態(tài)下血管對(duì)某些刺激的反應(yīng)與生理情況下不同［10－13］，另外還缺乏在體時(shí)受到神經(jīng)體液因素及血流對(duì)管壁造成的壓力等因素的影響，與在體血管在生理結(jié)構(gòu)和功能上并不完全相同，所以不能將離體培養(yǎng)血管的實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全等同于在體，要客觀地評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)其整體的價(jià)值。

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