賈桂枝，王洪新，李 紅，王翠瑤，戴紅良

（遼寧醫(yī)學院1.生物化學與分子生物學教研室、2.藥理學教研室、3.護理學院，遼寧錦州 121001）

心肌缺血／再灌注可引起心肌細胞廣泛性的壞死，促發(fā)心力衰竭，是目前世界上引起人類死亡的最重要原因之一［1］。缺血／再灌注損傷在人體會引起心肌細胞產(chǎn)生過多的活性氧，發(fā)生氧化應激性的損傷。H2O2等活性氧能改變心肌細胞內凋亡相關蛋白的表達水平，最終引發(fā)細胞凋亡［2］。因此，對抗由氧化應激介導的心肌細胞凋亡對于臨床治療各種缺血性心臟病意義重大。鈣調神經(jīng)磷酸酶（calcineurin，CaN）是目前已知唯一受鈣離子／鈣調素調節(jié)的蛋白磷酸酶類。在Ca2＋的激活下，對包括心肌細胞在內的多種細胞的凋亡進行調節(jié)［3－4］。有研究已證實缺血／再灌注損傷［5］、H2O2［6］及血清剝奪［7］等誘導的心肌細胞凋亡均與CaN有關。左卡尼汀是位于線粒體膜的機體內源性化合物，其主要作用是促進長鏈脂肪酸轉運至線粒體進行β氧化，為機體供能［8］。除此之外，左卡尼汀還具有明顯的抗氧化、抗凋亡活性［9－10］。其可通過緩解細胞內的Ca2＋超載，明顯抑制H2O2誘導的心肌細胞凋亡［10］。但左卡尼汀抗H2O2致心肌細胞凋亡的機制是否與CaN有關，仍缺乏相關報道。為此，本研究利用體外培養(yǎng)的新生大鼠心肌細胞，探討CaN在左卡尼汀抑制H2O2誘導心肌細胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 左卡尼汀、環(huán)孢素A（cyclosporin A，CsA）、胰蛋白酶、達爾伯克必需基本培養(yǎng)基（Dulbecco′s minimum essential medium，DMEM）低糖培養(yǎng)基均購于美國Sigma公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所；AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術有限公司；BCA蛋白定量試劑盒美國Pierce公司；cleaved caspase-3、Bcl-2及Bax一抗購于美國Cell Signaling公司；CaN一抗購自美國Santa Cruz公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗購于美國Sigma公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxide，HRP）標記的二抗購于美國Santa Cruz公司。

1.2 實驗動物 出生1～3 d的Sprague-Dawley（SD）大鼠乳鼠，♀♂不拘，由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供。動物合格證號：SCXK（遼）2003-0007。

1.3 心肌細胞培養(yǎng) 新生大鼠心肌細胞原代培養(yǎng)方法，參照文獻［10］。取出生1～3 d SD大鼠乳鼠，開胸取出心臟，用 D-Hanks液沖洗3次后剪成約1 mm3大小的碎塊，在37℃條件下，以0.8 g·L－1胰蛋白酶消化分離細胞。將消化完畢的細胞以差速貼壁法進行純化后，置于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁融合后，換以含0.04%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將細胞分組用于實驗。

1.4 實驗分組 在進行細胞凋亡及細胞內cleaved caspase-3、Bcl-2及Bax表達水平分析的實驗中，將體外培養(yǎng)的SD大鼠心肌細胞隨機分為正常對照組、H2O2處理組、左卡尼汀（1.2 mmol·L－1） ＋H2O2組和 CsA（CaN特異性抑制劑，1μmol·L－1）＋H2O2組。在檢測細胞內CaN表達的實驗中將其分為正常對照組、H2O2處理組、左卡尼汀（1.2 mmol·L－1）組和左卡尼?。獺2O2組。H2O2作用強度為200μmol·L－1、12 h刺激。左卡尼汀于加入H2O21 h前加入，CsA于加入 H2O230 min前加入［10－11］。左卡尼汀及 CsA均維持至 H2O2作用結束。

1.5 心肌細胞凋亡測定 將經(jīng)過處理的心肌細胞用1.25 g·L－1胰蛋白酶消化分離，調節(jié)細胞密度為1×109·L－1后，上流式細胞儀進行檢測。具體操作方法按照Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書進行。

1．6 Western blot 待各組細胞處理結束后，加細胞裂解液RIPA［（1%乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P 40，NP-40），0.5% 脫氧膽酸鈉，1%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS），0.1%苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）］提取細胞總蛋白，2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度。取50μg總蛋白，以1×樣品緩沖液配平上樣體積，沸水煮5 min后置10%SDS-PAGE中進行電泳，待電泳完成后電轉移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。用5%脫脂牛奶封閉1 h，接著加cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax、CaN及 GAPDH一抗 4℃孵育過夜。TBS-T充分洗膜后，以HRP標記的二抗室溫孵育2 h。TBS-T洗膜后，化學發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色。利用美國國立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，NIH）Image J 1.42軟件對掃描的條帶進行灰度分析。指定對照組蛋白表達為1，以其它組與對照組的比值反映各組的相對蛋白表達。

1.7 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)值以ˉx±s表示。組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2．1 左卡尼汀及CsA對心肌細胞凋亡的影響 Fig 1結果顯示，與對照組相比，H2O2處理組心肌細胞凋亡明顯增加。而左卡尼汀及CsA預處理能夠明顯降低H2O2誘導的心肌細胞凋亡。

Fig 1 Effect of L-carnitine and CsA on H 2O2-triggered apoptosis in rat cardiac myocytes（n＝4）

2．2 左卡尼汀及CsA對心肌細胞凋亡相關蛋白表達的影響 Fig 2結果顯示，與正常組比較，H2O2處理12 h后心肌細胞內cleaved caspase-3及Bax的表達明顯增加，而Bcl-2的表達卻明顯降低。左卡尼汀及CsA均能明顯地改善H2O2誘導的上述改變。

2．3 左卡尼汀對心肌細胞內CaN表達水平的影響Fig 3結果顯示，與正常組比較，H2O2處理12 h后心肌細胞內CaN表達水平明顯增加。左卡尼汀能明顯降低H2O2處理組心肌細胞CaN的表達。而其本身不影響CaN的表達。

3 討論

本實驗發(fā)現(xiàn)，左卡尼汀可通過抑制CaN的過表達以抑制氧化應激狀態(tài)下心肌細胞凋亡的發(fā)生。

目前越來越多的研究提示缺血／再灌注損傷與心肌細胞凋亡有著密切的關系。盡管缺血／再灌注引起凋亡的確切機制尚未完全闡明，但可以肯定其與氧化應激損傷、鈣超載有關［12－13］。H2O2可誘發(fā)心肌細胞內的鈣超載，引起心肌凋亡。而左卡尼汀能夠明顯地緩解鈣超載，抑制其細胞的凋亡［10］。CaN是細胞內鈣離子執(zhí)行功能的重要靶蛋白之一。最近的研究發(fā)現(xiàn)，CaN在H2O2誘導的心肌凋亡中發(fā)揮著重要作用［6］。本實驗也發(fā)現(xiàn)，在CaN經(jīng)其特異性抑制劑CsA阻斷后，H2O2所誘發(fā)的各種凋亡相關蛋白的表達得到明顯改善。具體表現(xiàn)為促凋亡蛋白cleaved caspase-3及Bax的表達下調，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達上調。心肌細胞的凋亡也明顯降低。而更為重要的是，左卡尼汀在抑制心肌細胞凋亡的同時，能夠明顯降低H2O2誘導下CaN的過表達，提示左卡尼汀的抗凋亡活性可能與其抑制CaN的過表達有關。

關于CaN誘導心肌細胞凋亡的機制，可能涉及以下幾個方面：① 與細胞凋亡信號調節(jié)激酶（ASK1）相互作用［14］；② 影響 Bad的磷酸化，拮抗Bcl-2家族抗凋亡作用［15］；③去磷酸化（活化）轉錄因子活化T細胞核因子3（nuclear factor of activated T cells 3，NFATc3），使其由胞質轉位于胞核，介導凋亡相關基因的表達［16］。而左卡尼汀抗心肌細胞凋亡的作用是否也涉及上述機制，仍有待于進一步的實驗論證。

總之，本研究證實左卡尼汀對H2O2誘發(fā)心肌細胞凋亡具有明顯的抑制作用，其作用機制可能與調控CaN的表達有關。該發(fā)現(xiàn)為左卡尼汀的臨床應用提供了實驗依據(jù)。

Fig 2 Effect of L-carnitine and CsA on apoptosis associated protein expression in rat cardiac myocytes（n＝3）

Fig 3 Effect of L-carnitine on H 2 O2-triggered CaN overexpression in rat cardiac myocytes（n＝3）

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