蔣娟娟 婁青林 高雪艷 申志祥 卞茸文

糖尿病已是公認(rèn)的全球公共衛(wèi)生問題，在美國(guó)、歐洲等主要的發(fā)達(dá)國(guó)家，糖尿病已經(jīng)成為終末期腎臟病(ESRD)最常見的病因;在中國(guó)等發(fā)展中國(guó)家，糖尿病的發(fā)生率亦顯著增加，糖尿病所致的糖尿病腎病進(jìn)入ESRD患者數(shù)量亦逐漸上升［1］。糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制不明，目前認(rèn)為高血糖(HG)是引起靶器官損害的根本原因，蛋白尿是糖尿病腎病獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，高血壓、脂代謝紊亂、胰島素抵抗等因素共同作用參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展［2-4］。近年有學(xué)者提出糖尿病患者使用免疫抑制劑雷帕霉素(rapamycin，RPM)具有一定的腎保護(hù)作用。因此，本研究針對(duì)2型糖尿病常見的HG高胰島素環(huán)境，探討RPM對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 HK-2株購(gòu)自武漢中國(guó)典藏物培養(yǎng)中心(美國(guó)ATCC)江蘇省人民醫(yī)院腎病實(shí)驗(yàn)室，RPM購(gòu)自福建科瑞藥業(yè)有限公司，小鼠抗人單克隆抗體actin、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，pmTOR抗人抗體、p70S6K抗人抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司，MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組:HK-2置于5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，細(xì)胞80%融合時(shí)0.25%胰酶消化傳代，取5～13代用于實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前無血清同步24 h。采用MTT法測(cè)定不同濃度(1、10、100 nmol/L)RPM 培養(yǎng)不同時(shí)間(0、12、24、48 h)后HK-2細(xì)胞的活性。實(shí)驗(yàn)分組如下:(1)正常糖組(NG，5.5 mmol/L);(2)高糖組(HG，25.0 mmol/L);(3)HG+RPM(1、10、100 nmol/L)組。(4)HG+100 nmol/L RPM+胰島素(Ins，1、10、100 nmol/L)組。

1.2.2 免疫印跡法(western blot)檢測(cè)蛋白表達(dá):采用western blot方法測(cè)定不同組雷帕霉素靶蛋白(pm-TOR)和P70核糖體S6激酶(p70S6K)蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)方法:HK-2細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞提取總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，取60 μg蛋白樣品100℃變性5 min。SDS-PAGE凝膠電泳2 h，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入pmTOR或p70S6K抗人抗體4℃孵育過夜，HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，ECL顯色成像，凝膠分析系統(tǒng)定量，比較目的條帶或內(nèi)參條帶的吸光度。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 14.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度RPM培養(yǎng)不同時(shí)間對(duì)HK-2細(xì)胞增殖抑制率的影響 不同濃度(1、10、100 nmol/L)RPM 分別刺激0、12、24、48 h后，結(jié)果顯示 HK-2細(xì)胞增殖抑制率具有濃度-時(shí)間依賴性。100 nmol/L RPM刺激48 h，HK-2細(xì)胞增殖抑制率接近50%。

2.2 HK-2細(xì)胞pmTOR蛋白的表達(dá) HG顯著上調(diào)HK-2細(xì)胞pmTOR蛋白的表達(dá)，而RPM可拮抗HG上調(diào)HK-2蛋白表達(dá)的效應(yīng)。不同濃度RPM組顯示，隨濃度升高，RPM抑制HK-2 pmTOR蛋白表達(dá)的作用越顯著(P ＜0.05)。見圖1，2。

2.3 HK-2細(xì)胞p70S6K蛋白的表達(dá) HG可顯著上調(diào)p70S6K蛋白表達(dá)，RPM可拮抗 HG上調(diào) HK-2 p70S6K蛋白表達(dá)的作用。隨RPM濃度升高，其抑制p70S6K蛋白表達(dá)作用越顯著(P＜0.05)。見圖3。

2.4 不同濃度胰島素對(duì)RPM抑制HG環(huán)境下pmTOR蛋白表達(dá)的影響 在100 nmol/L RPM和HG環(huán)境下，分別加入1、10、100 nmol/L胰島素后測(cè)定pmTOR蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示加入1、10 nmol/L胰島素后pm-TOR的表達(dá)與HG+100 nmol/L RPM組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，而加入100 nmol/L濃度的胰島素可抑制RPM的作用(P＜0.05)。見圖4。

圖1 RPM抑制HG上調(diào)HK-2 pmTOR蛋白表達(dá)圖譜

圖2 RPM抑制HG上調(diào)HK-2 pmTOR蛋白表達(dá)半定量分析

圖3 RPM抑制HG上調(diào)p70S6K蛋白表達(dá)的半定量分析

圖4 不同濃度胰島素對(duì)HG環(huán)境下RPM抑制pmTOR蛋白表達(dá)的半定量分析(n=3)

3 討論

糖尿病腎病是糖尿病引起的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，在我國(guó)已經(jīng)是慢性腎功能衰竭的第3位病因［5］，我國(guó)50%的透析患者為糖尿病引起的腎?。?］。迄今為止，糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制依然不明，近年有學(xué)者提出糖尿病患者使用免疫抑制劑RPM具有一定的腎保護(hù)作用，其在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中的作用逐漸引起眾多學(xué)者的關(guān)注［7］。

RPM是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，目前主要用于器官移植排斥反應(yīng)的預(yù)防和治療［8］。RPM主要通過哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路發(fā)揮作用，mTOR活化后，可導(dǎo)致下游的2個(gè)重要的效應(yīng)因子p70S6K活化和真核細(xì)胞起始因子-4E-結(jié)合蛋白1(4EBP-1)活化。p70S6K可使S6磷酸化，促進(jìn)翻譯過程的啟動(dòng)，促進(jìn)RNA和蛋白質(zhì)的合成。p70S6K激活后，也可通過周期素依賴激酶(cdks)促進(jìn)細(xì)胞周期的發(fā)展。RPM能與哺乳動(dòng)物mTOR相互作用，抑制p70S6K活化和4EBP-1磷酸化，參與細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖、代謝的調(diào)節(jié)，并反饋性調(diào)節(jié)胰島素的敏感性，與2型糖尿病、肥胖等疾病的發(fā)生密切相關(guān)［9］。

足細(xì)胞肥大在慢性腎臟疾病包括糖尿病腎病進(jìn)展中有重要作用，相關(guān)動(dòng)物模型研究已經(jīng)證實(shí)RPM干預(yù)可延緩腎小球硬化，改善糖尿病腎病的進(jìn)展。使用RPM可抑制足細(xì)胞肥大，抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖，抑制Ⅳ型膠原產(chǎn)生，延緩腎小球硬化，改善早期糖尿病腎?。?0］。推測(cè)此類效應(yīng)與RPM使用后抑制mTOR通路活化密切相關(guān)。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)RPM可延緩糖尿病腎病的小管間質(zhì)損害，減少蛋白尿。但亦有臨床研究認(rèn)為RPM可引起患者蛋白尿，其機(jī)制未進(jìn)一步探討，因此RPM與糖尿病腎病之間的關(guān)系及作用機(jī)制目前仍不明確［11］。

本研究采用體外實(shí)驗(yàn)研究RPM對(duì)HG環(huán)境下HK-2細(xì)胞影響，結(jié)果顯示HG可顯著活化HK-2 pm-TOR通路，RPM可通過mTOR/p70S6K通路拮抗HG對(duì)HK-2效應(yīng)，且在一定范圍內(nèi)，濃度越高效應(yīng)越顯著。100 nmol/L RPM可抑制HG誘導(dǎo)的pmTOR蛋白表達(dá)，加入100nmol/L胰島素可抑制RPM的作用，提示高濃度胰島素對(duì)RPM干預(yù)的HG環(huán)境下mTOR通路有逆轉(zhuǎn)作用。有文獻(xiàn)報(bào)道RPM可反饋性地調(diào)節(jié)胰島素的敏感性，兩者在糖尿病腎病的動(dòng)物及人體內(nèi)的影響機(jī)制目前還不明確，需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上，本研究針對(duì)2型糖尿病常見的HG高胰島素環(huán)境，觀察RPM干預(yù)對(duì)HK-2細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示RPM可通過mTOR/p70S6K通路抑制HG對(duì)HK-2效應(yīng)，提示RPM可影響HG狀態(tài)下mTOR/p70S6K通路，在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中起一定的作用。本研究?jī)H從體外實(shí)驗(yàn)探討，其他相關(guān)的研究亦多局限于細(xì)胞和(或)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以糖尿病腎病患者為研究對(duì)象的體內(nèi)研究目前尚少，RPM在糖尿病腎病患者體內(nèi)的作用效應(yīng)尚需進(jìn)一步明確。

［1］Leite RS，Marlow NM，F(xiàn)ernandes JK.Oral health and type 2 diabetes［J］.Am J Med Sci，2013，345(4):271-273.

［2］Lin X，Tao L，Tang D.Gene therapy，a targeted treatment for diabetic nephropathy［J］Curr Med Chem，2013，20(30):3774-3784.

［3］莊文翔，申志祥，張鵬翎.老年2型糖尿病患者血清超敏C反應(yīng)蛋白與糖尿病腎病相關(guān)性分析［J］.實(shí)用老年醫(yī)學(xué)，2009，23(4):296-298.

［4］趙大鵬，隋艷波，欒仲秋，等.糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，9(36):47-48.

［5］王笑云.老年糖尿病腎病腎衰竭診治進(jìn)展［J］.實(shí)用老年醫(yī)學(xué)，2007，21(5):294-298.

［6］張愉.老年糖尿病腎病研究進(jìn)展［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2011，8(32):15-17.

［7］Blagosklonny MV.Rapamycin-induced glucose intolerance:hunger or starvation diabetes［J］.Cell Cycle，2011，10(24):4217-4224.

［8］Lieberthal W，Levine JS.Mammalian target of rapamycin and the kidney.Ⅰ.The signaling pathway［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2012，303(1):F1-10.

［9］Gupta A，Gupta P，Biyani M.Targeted therapies in diabetic nephropathy:an update［J］.J Nephrol，2011，24(6):686-695.

［10］Inoki K，Mori H，Wang J，et al.mTORc1 activation in podocytes in a critical step in the development of diabetic nephropathy in mice［J］.J Clin Invest，2011，121(6):2181-2196.

［11］Godel M，Hartleben B，Herbach N，et al.Role of mTOR in podocyte function and diabetic nephropathy in human and mice［J］.J Clin Invest，2011，121(6):2197-2209.