葛燕梅，葉 艷，張林杰

（安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，安徽合肥 230032）

抗微管藥物紫杉醇作為一種化療藥物應(yīng)用于胃癌的治療，其主要?dú)麢C(jī)制在于能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。Bim（Bcl-2 interacting mediator of cell death）是 BH3-only（Bcl-2 homology 3（BH3）-only）蛋白家族中促凋亡成員之一，被報(bào)道在多種腫瘤細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮了重要作用［1］。目前研究認(rèn)為抗微管化療藥物作用于腫瘤細(xì)胞可通過上調(diào)Bim活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［2－3］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Bim僅僅在對(duì)紫杉醇敏感的細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，而在相對(duì)不敏感的細(xì)胞系BGC-823中表達(dá)沒有明顯變化［4－5］。因此，針對(duì)化療藥物相對(duì)不敏感的細(xì)胞株，是否能通過外源性分子的作用上調(diào)Bim的表達(dá)以增強(qiáng)其對(duì)化療藥物的敏感性，值得進(jìn)一步的研究探討。已有研究表明PI3K／Akt信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物抵抗中發(fā)揮重要作用，而SHIP2（SH2 domain containing inositol 5-phosphatase 2）分子是肌醇5－磷酸酶家族成員之一，可以通過水解PI（3，4，5）P3的第5位磷酸導(dǎo)致 PI（3，4）P2形成，從而阻斷Akt及其下游效應(yīng)分子的有效活化，負(fù)向調(diào)節(jié)PI3K／Akt信號(hào)通路［6－7］。而作為 Akt下游靶分子之一的轉(zhuǎn)錄因子FoxO3可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)Bim的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［8］。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pCMV6-SHIP2，同時(shí)聯(lián)合抗微管化療藥物紫杉醇的作用，以期了解外源性SHIP2分子的過表達(dá)是否能增強(qiáng)BGC-823對(duì)紫杉醇的敏感性，并進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 SGC-7901及BGC-823細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。DMEM高糖培養(yǎng)基、胰酶購自Gibco公司；小牛血清購自杭州四季青公司。小鼠抗人SHIP2抗體，小鼠抗人Bim抗體購自Santa Cruz公司，兔抗人pAkt（Ser473）抗體，兔抗人Akt抗體購自Cell Signaling公司。小鼠抗人β-actin抗體及辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體，羊抗兔IgG抗體購自武漢博士德公司。LipofectamineTM2000脂質(zhì)體購自Invitrogen公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）購自 Sigma公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司，Bim引物由上海生工生物有限公司合成。pCMV6-SHIP2載體購自O(shè)rigene公司。GV112-Puromycin-Bim慢病毒顆粒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建和包裝。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 BGC-823細(xì)胞在含10%的小牛血清、1%雙抗的高糖 DMEM培養(yǎng)基，5%CO2，37℃，飽和濕度溫箱培養(yǎng)，細(xì)胞呈貼壁生長。取對(duì)數(shù)生長期的BGC-823細(xì)胞分別接種于相應(yīng)培養(yǎng)板（6孔板接種細(xì)胞數(shù)4×105／孔，24孔板接種細(xì)胞數(shù)1×105／孔）。待細(xì)胞生長到80%～90%融合時(shí)，棄去原液換成含10%小牛血清無抗生素的高糖DMEM培養(yǎng)基，應(yīng)用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000分別包裹SHIP2真核表達(dá)載體（pCMV6-SHIP2）和空載體（pCMV6），瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BGC-823細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的BGC-823細(xì)胞作為空白對(duì)照。

1.2.2 GV112-Puromycin Bim慢病毒顆粒感染細(xì)胞及穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選 取對(duì)數(shù)生長期的BGC-823細(xì)胞接種于24孔板，接種密度為4×105／孔。待細(xì)胞生長到50%～60%融合時(shí)，棄上清，加入GV112-Puromycin-Bim慢病毒顆粒，同時(shí)加入終濃度為8 mg·L－1的凝聚胺（Polybrene）以促進(jìn)感染。實(shí)驗(yàn)分為3組：空白對(duì)照組、GV112-Puromycin陰性對(duì)照組和GV112-Puromycin-Bim實(shí)驗(yàn)組。分別于8、24 h后更換為普通培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。5 d后，分別收集細(xì)胞蛋白和RNA，Western blot和qRT-PCR分別檢測Bim蛋白和mRNA的變化以明確感染效果。然后，將細(xì)胞傳代至含1 mg·L－1嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，進(jìn)行陽性克隆篩選。感染細(xì)胞經(jīng)嘌呤霉素篩選，1周后空白對(duì)照組細(xì)胞全部死亡，陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞部分死亡，繼續(xù)嘌呤霉素篩選培養(yǎng)，2周后陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞出現(xiàn)增殖，3周后收集嘌呤霉素陽性的細(xì)胞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)，分別為GV112-Puromycin陰性對(duì)照細(xì)胞（BGC-823·ControlshRNA）和GV112-Puromycin-Bim慢病毒顆粒感染的穩(wěn)定細(xì)胞（BGC-823·Bim-shRNA）。

1.2.3 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western blot） 收集細(xì)胞，加入50μl細(xì)胞總蛋白裂解液，冰上裂解30 min，然后4℃14 000×g離心30 min后取上清液，此為細(xì)胞總蛋白。用BCA法進(jìn)行蛋白定量后，加入等體積的2×SDS凝膠上樣緩沖液，煮沸3 min使蛋白變性。取30μg的蛋白在不同濃度的SDS-PAGE凝膠中電泳，再轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用含質(zhì)量濃度為50 g·L－1脫脂奶粉的TBST封閉2 h，一抗4℃孵育過夜后，TBST洗3次，每次10 min，再加HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗（1∶5 000），室溫孵育1h，TBST洗3次，每次10 min。ECL顯色，天能全自動(dòng)凝膠數(shù)碼成像系統(tǒng)照相并分析結(jié)果。用等量β-actin蛋白上樣作為對(duì)照。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR） 用TRIzol法提取不同時(shí)間點(diǎn)的BGC-823細(xì)胞的總RNA，并進(jìn)行質(zhì)量鑒定。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明，冰上操作將不同時(shí)間點(diǎn)的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以逆轉(zhuǎn)錄出的cDNA為模板建立反應(yīng)體系（20μl）。Bim引物序列：5′-GCC CCT ACC TCC CTA CAG AC-3′（上游），5′-ATG GTG GTG GCC ATA CAA AT-3′（下游）。反應(yīng)條件為Stage1：預(yù)變性：95℃ 10 s；Stage2：PCR反應(yīng)：95℃ 5 s，60℃ 30 s，共 40個(gè)循環(huán)，所有PCR實(shí)驗(yàn)均以同時(shí)擴(kuò)增β-actin為內(nèi)參對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束后，用ABIStepOne Plus PCR System軟件分析，繪制PCR定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出目的基因的Ct值，由于Ct值代表基因的起始拷貝數(shù)，因此可根據(jù)Ct值比較基因的表達(dá)量。各目的基因表達(dá)水平的差異比較：相對(duì)含量（relative quantification，RQ）＝2－△△Ct?！鳌鰿t＝（Ct處理組目的基因－ Ct處理組內(nèi)參基因）－（Ct對(duì)照組目的基因－Ct對(duì)照組內(nèi)參基因）。mRNA水平以 RQ表示。

1.2.5 PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 收集經(jīng)紫杉醇作用后的細(xì)胞上清，用預(yù)冷PBS洗滌2次，低速離心棄上清，每孔加入750μl PI（5 mg PI、0.1 g枸櫞酸鈉、100 ml ddH2O、100μl Triton X-100）37℃避光作用20 min后收集細(xì)胞，4℃避光過夜。次日上流式細(xì)胞儀（FASCalibur）檢測。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果用WinMDI 2.9軟件分析，亞二倍體峰（subG1）所占的比例即細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)的錄入和分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用ˉx±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2．1 紫杉醇誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞凋亡和Bim的表達(dá)選用 0.3μmol·L－1紫杉醇在不同時(shí)點(diǎn)（0、8、16、24、36、48 h）分別處理 SGC-7901和 BGC-823細(xì)胞，并對(duì)其細(xì)胞凋亡率進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)0.3μmol·L－1紫杉醇誘導(dǎo) SGC-7901 48 h凋亡率為（54.2±0.8）%，而 BGC-823 48 h凋亡率僅為（25.6±1.6）%（Fig 1A），說明BGC-823細(xì)胞對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)的凋亡不敏感。同時(shí)用Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)分別檢測0.3μmol·L－1紫杉醇作用BGC-823一系列時(shí)點(diǎn)（0、8、16、24、36、48 h）的 Bim蛋白和mRNA的變化水平，發(fā)現(xiàn)隨紫杉醇作用時(shí)間延長，相對(duì)不敏感細(xì)胞株BGC-823中Bim蛋白和mRNA表達(dá)均無明顯變化（Fig 1B，C）。

Fig 1 Paclitaxel-induced apoptosis and the expression of Bim in gastric cancer cellsA：Paclitaxel（0.3μmol·L－1）induces apoptosis in BGC-823 and SGC-7901 cells at different time points；B：The expression level of Bim protein in BGC-823 cells treated with paclitaxel at different time points；C：The expression level of Bim mRNA in BGC-823 cells treated with paclitaxel at different time points.

2．2 過表達(dá)SHIP2可上調(diào)Bim蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)BGC-823細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性 在相對(duì)不敏感細(xì)胞株BGC-823中轉(zhuǎn)染pCMV6-SHIP2質(zhì)粒，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體（pCMV6）細(xì)胞作為對(duì)照組，24 h后收集蛋白，Western blot檢測 SHIP2、pAkt、Akt和Bim蛋白的變化，實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)檢測Bim mRNA的變化水平。結(jié)果顯示過表達(dá)SHIP2，降低了Akt的磷酸化水平，并且上調(diào)了Bim的表達(dá)（Fig 2A）；同時(shí)，過表達(dá)SHIP2時(shí)，Bim mRNA的水平明顯升高（Fig 2B）。加入0.3μmol·L－1紫杉醇誘導(dǎo)48 h，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡顯示轉(zhuǎn)染pCMV6-SHIP2的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（Fig 2C）。

Fig 2 The effect of SHIP2 over-expression on paclitaxel-induced apoptosis in BGC-823 cellsA：The expression level of SHIP2，pAkt，Akt and Bim proteins in BGC-823 cells after transfection of pCMV6-SHIP2 plasmid；B：The expression level of Bim mRNA in BGC-823 cells after transfection of pCMV6-SHIP2 plasmid；C：Paclitaxel induced apoptosis in BGC-823 cells after transfection of pCMV6-SHIP2 plasmid.**P＜0.01 vs pCMV6＋Paclitaxel.

2．3 GV112-Puromycin-Bim慢病毒顆粒有效干擾BGC-823細(xì)胞內(nèi)Bim的表達(dá) 采用GV112-Puromycin-Bim慢病毒顆粒感染BGC-823細(xì)胞，分別用Western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)檢測Bim蛋白和mRNA的變化水平。結(jié)果顯示Bim蛋白（Fig 3A）和mRNA的水平均明顯降低（Fig 3B），說明GV112-Puromycin Bim慢病毒顆粒感染BGC-823細(xì)胞，能有效干擾BGC-823細(xì)胞內(nèi)Bim的表達(dá)。

Fig 3 The effect of infecting w ith GV112-purom ycin Bim lentivirus particles on the expression of Bim in BGC-823 cellsA：The expression level of Bim protein in BGC-823 cells after infecting with GV112-Puromycin Bim lentivirus particles；B：The expression level of Bim mRNA in BGC-823 cells after infectingwith GV112-Puromycin Bim lentivirus particles.

2．4 過表達(dá)SHIP2可明顯降低紫杉醇誘導(dǎo)BGC-823·Bim-shRNA細(xì)胞的凋亡率 在BGC-823·Bim-shRNA和BGC-823·Control-shRNA（實(shí)驗(yàn)方法“1.2.2”中篩選的穩(wěn)定細(xì)胞株）中，分別轉(zhuǎn)染pCMV6-SHIP2 24 h后，加入 0.3μmol·L－1紫杉醇誘導(dǎo)48 h，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示：紫杉醇誘導(dǎo)BGC-823·Control-shRNA細(xì)胞48 h后凋亡率為（50.8±0.9）%，而在 BGC-823·Bim-shRNA中凋亡率明顯下降，僅為（27.6±1.6）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（Fig 4），提示過表達(dá) SHIP2分子增強(qiáng)BGC-823對(duì)紫杉醇的敏感性是通過上調(diào)Bim蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

3 討論

Fig 4 Paclitaxel induces apoptosis in BGC-823·control-shRNA and BGC-823·Bim-shRNA cells after transfection of pCMV6-SHIP2 plasm id**P＜0.01 vs BGC-823.control-shRNA：pCMV6-SHIP2＋Paclitaxel.

Bim是Bcl-2（B-cell leukemia-2）家族的促凋亡分子，廣泛表達(dá)于正常細(xì)胞，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及治療均有著密切的關(guān)系。紫杉醇作為臨床常用的腫瘤化療藥物之一，無論單用或聯(lián)合應(yīng)用對(duì)于胃癌晚期的治療都顯示出較好的療效。通過特異地結(jié)合到小管的β位上，導(dǎo)致微管聚合成團(tuán)塊和束狀并使其穩(wěn)定，抑制微管網(wǎng)的正常重組而達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的作用［9］。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，在紫杉醇誘導(dǎo)的胃腺癌相對(duì)敏感細(xì)胞系SGC-7901凋亡中Bim蛋白表達(dá)水平呈增高趨勢，但是在對(duì)紫杉醇相對(duì)不敏感細(xì)胞系BGC-823中Bim的表達(dá)并沒有變化；Bim表達(dá)的上調(diào)與否是決定胃腺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇誘導(dǎo)其凋亡敏感性的分子機(jī)制之一，Bim的表達(dá)水平與紫杉醇誘導(dǎo)相對(duì)敏感細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞凋亡成正相關(guān)［4－5］。本研究在既往研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討能否通過上調(diào)Bim蛋白的表達(dá)以增強(qiáng)相對(duì)不敏感細(xì)胞BGC-823對(duì)紫杉醇的敏感性。

PI3K／Akt信號(hào)通路已被證實(shí)是多種腫瘤細(xì)胞生存和增殖中重要的信號(hào)通路之一。在腫瘤細(xì)胞逃避抗癌藥物的殺傷過程中，PI3K／Akt信號(hào)通路可能起了極其重要的作用，因此PI3K／Akt信號(hào)通路有望成為惡性腫瘤治療的新靶點(diǎn)。有研究表明抑制PI3K／Akt信號(hào)通路能提高胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性［10］?；罨腁kt可以通過磷酸化轉(zhuǎn)錄因子FoxO3，進(jìn)而發(fā)揮抗凋亡作用，而Bim在轉(zhuǎn)錄水平可以被FoxO3因子調(diào)控，活化的FoxO3結(jié)合于Bim基因的啟動(dòng)子區(qū)域從而促進(jìn)Bim的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［11］。研究已經(jīng)證實(shí)SHIP2能水解PI（3，4，5）P3第5位磷酸形成 PI（3，4）P2，從而阻斷 Akt及其下游效應(yīng)分子的有效活化［12］。已證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子FoxO3是Akt的下游靶分子之一，Akt活性的降低可通過 Akt／FoxO3／Bim通路上調(diào) Bim的表達(dá)［8］。

本研究通過轉(zhuǎn)染 SHIP2 cDNA，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)SHIP2可下調(diào)Akt的活性，并上調(diào)Bim的表達(dá)。在BGC-823中轉(zhuǎn)染pCMV6-SHIP2質(zhì)粒后加入紫杉醇誘導(dǎo)48 h，細(xì)胞凋亡率明顯上升。而在BGC-823·Bim-shRNA中，轉(zhuǎn)染pCMV6-SHIP2質(zhì)粒后加入紫杉醇誘導(dǎo)48 h，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率明顯降低，抑制了過表達(dá)SHIP2的BGC-823細(xì)胞對(duì)紫杉醇的增敏作用。說明過表達(dá)SHIP2能增強(qiáng)BGC-823對(duì)紫杉醇的敏感性，而這種作用是通過上調(diào)Bim蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

本研究在一定程度上證實(shí)了可通過相關(guān)外源性分子負(fù)向調(diào)控PI3K／Akt信號(hào)通路以上調(diào)Bim蛋白的表達(dá)，從而增強(qiáng)相對(duì)不敏感胃癌細(xì)胞株對(duì)紫杉醇的敏感性，這為如何提高胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性提供了新的思路。

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