李 敏，孫 玲，李紅玲，孫黔云

（1.貴州省人民醫(yī)院呼吸疾病研究所，貴州貴陽 550002；2.中國人民解放軍第44醫(yī)院醫(yī)務(wù)處，貴州 貴陽 550009；3.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室，貴州貴陽 550002）

高血脂是引發(fā)心血管事件的潛在危險因素［1］，其中氧化修飾的低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）是造成血管內(nèi)皮損傷和動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的重要原因［2－3］。調(diào)血脂已成為防治相關(guān)心血管病變的有效策略。他汀類藥物是目前治療高脂血癥的主流藥物［1］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物除了具有降血脂作用外，尚有改善內(nèi)皮功能、抗炎、抗氧化、穩(wěn)定斑塊等諸多作用［4］。其非降脂作用成為研究的熱點。為進一步認(rèn)識ATV保護血管內(nèi)皮的潛在應(yīng)用價值，本工作開展了ATV對ox-LDL激活和損傷人微血管內(nèi)皮細胞的抑制作用及可能機制的研究。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑 人微血管內(nèi)皮細胞株HMEC由本實驗室傳代培養(yǎng)；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國 Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）為天津灝洋生物科技有限公司產(chǎn)品；阿托伐他汀鈣（atorvastatin calcium，ATV）和四氮唑鹽［3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenylte-trazolium bromide，MTT］購自美國Sigma公司；High ox-LDL購自廣州奕源生物科技有限公司；兔抗人 NF-κB p65 Ser536磷酸化位點檢測單克隆抗體及兔抗人β-actin單克隆抗體購自美國CST公司；pGL4.32［luc2P／NF-κB-RE／Hygro］質(zhì)粒、pRL-TK質(zhì)粒、雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；PVDF膜為美國Millipore公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒和Lipofecter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑為江蘇碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；DH5α購自北京天根生化科技有限公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性檢測試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；人ICAM-1 ELISA試劑盒為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要儀器設(shè)備 Forma 3111 CO2培養(yǎng)箱和Revco超低溫冰箱（美國Thermo公司）；Nikon TS100倒置相差顯微鏡（日本Nikon公司）；Spectra MAX-190連續(xù)波長酶標(biāo)儀（美國 Molecular Devices公司）；GloMax化學(xué)發(fā)光檢測儀（美國Promega公司）；Elix純水系統(tǒng)和Milli Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；5810R冷凍離心機（德國Eppendorf公司）。

1.3 方法

1.3.1 HMEC培養(yǎng) 人微血管內(nèi)皮細胞株HMEC由本實驗室傳代培養(yǎng)，用含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3.2 Ox-LDL損傷濃度的確定 將HMEC以1×104cells·well－1接種于96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后棄上清，損傷組加入200μl含不同濃度ox-LDL的無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，正常對照組加入200 μl無血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 g·L－1MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入溶解液50μl，12 h后在570 nm處測定OD值。根據(jù)OD值計算細胞活力。細胞活力／%＝（實驗組OD值／正常細胞組OD值）×100%。根據(jù)細胞活力抑制情況選擇合適濃度的ox-LDL進行后續(xù)實驗。

1.3.3 ATV影響 ox-LDL致細胞活力、LDH和ICAM-1變化的測定 實驗設(shè)置正常對照組、損傷組和干預(yù)組。HMEC以1×104cells·well－1種于96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后棄上清，干預(yù)組分別加入100μl含不同濃度 ATV（0.2、1、5、10μmol·L－1）的無血清培養(yǎng)基，正常對照組和損傷組加入無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，損傷組和干預(yù)組加入ox-LDL，各孔培養(yǎng)體系總體積為200μl，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，細胞活力按前述方法測定，上清液中LDH和ICAM-1測定按試劑盒操作說明書進行。

1.3.4 NF-κB p65磷酸化的 Western blot檢測

1.3.4.1 蛋白提取 將HMEC以2.5×108cells·L－1接種于培養(yǎng)瓶，24 h后棄上清，干預(yù)組加入含5 μmol·L－1ATV的無血清培養(yǎng)基，正常對照組和損傷組加入無血清培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱24 h后，損傷組和干預(yù)組加入ox-LDL，30 min后棄上清，在冰上用細胞刮子刮下細胞，4℃條件下2 000 r· min－1離心5 min，棄上清，加入含PMSF的蛋白抽提液，渦旋5 s，冰浴15 min后再渦旋5 s，于4℃條件下 12 000×g· min－1離心 5 min，取上清，于－80℃凍存?zhèn)溆谩５鞍锥坎捎肂CA法。

1.3.4.2 Western blot 將上述蛋白樣品與電泳上樣緩沖液混勻，煮沸5 min。經(jīng)2 000 r· min－1離心5 min后，將變性蛋白樣品經(jīng)10%SDS-PAGE電泳，取電泳凝膠進行膜轉(zhuǎn)移電泳，將蛋白條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜。轉(zhuǎn)好的PVDF膜用含5%BSA的TBS封閉液室溫封閉1 h，分別用兔抗人的磷酸化NF-κB p65（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）單克隆抗體孵育過夜，次日洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶1 000）室溫孵育1 h，洗滌后經(jīng) DAB顯色并拍攝記錄，采用Image J對目標(biāo)條帶和內(nèi)參條帶進行灰度分析。

1.3.5 NF-κB核轉(zhuǎn)錄活性檢測

1.3.5.1 質(zhì)粒制備 將1μl重組質(zhì)粒（1 ng）加入到100μl感受態(tài)DH5α懸液中，混勻后置于冰浴中30 min，再經(jīng)42℃水浴90 s，轉(zhuǎn)入冰水中3 min，加入LB培養(yǎng)基900μl后置于37℃振蕩培養(yǎng)45 min，取菌液100μl均勻涂布于篩選平板上，置37℃培養(yǎng)過夜，挑取白色菌落進行擴增，按試劑盒說明書抽提質(zhì)粒。

1.3.5.2 雙螢光素報告基因檢測 HMEC以1×104cells·well－1種于 96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)至80%～90%融合時，棄上清，按Lipofecter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。具體如下：將適量NF-κB表達質(zhì)粒和內(nèi)參質(zhì)粒以及脂質(zhì)體試劑與無血清RPMI 1640培養(yǎng)基混勻，（20-25）℃孵育15 min。然后每孔加入該轉(zhuǎn)染混合液50μl（含100 ng NF-κB表達質(zhì)粒、5 ng內(nèi)參質(zhì)粒和2μl脂質(zhì)體試劑），轉(zhuǎn)染6 h后去除上清，各組參照“1.3.3”進行相應(yīng)處理，其中ATV濃度為5μmol·L－1，然后，按雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒操作說明書進行螢光強度的檢測。將各組中螢火蟲螢光素酶測定值R1除以內(nèi)參海腎螢光素酶的測定值R2，獲得相對螢光強度R1／R2，再將各組的R1／R2值除以正常對照組的R1／R2值，得到各組的相對核轉(zhuǎn)錄活性。1.3.6 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)以ˉx±s表示。采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析，組間多重比較采用LSD法。

2 結(jié)果

2．1 ATV對ox-LDL抑制HMEC活力的影響Ox-LDL能明顯抑制HMEC的生長（Fig 1A）。根據(jù)不同濃度ox-LDL的抑制情況，選擇50 g·L－1ox-LDL作為后續(xù)實驗中損傷HMEC的濃度。ATV的干預(yù)實驗表明，濃度為5和10μmol·L－1的ATV能有效減輕ox-LDL對HMEC活力的抑制（Fig 1B）。

2．2 ATV對ox-LDL致HMEC釋放LDH的影響Ox-LDL導(dǎo)致內(nèi)皮細胞釋放LDH明顯增加，而不同濃度的ATV均能明顯減少LDH的釋放（Fig 2）。

2．3 ATV對ox-LDL致HMEC表達ICAM-1的影響 Ox-LDL導(dǎo)致微血管內(nèi)皮細胞表達ICAM-1明顯增加，而ATV能明顯抑制ICAM-1的表達（Fig 3）。

2．4 ATV對ox-LDL致NF-κB p65磷酸化的影響Western blot檢測分析表明，HMEC暴露于ox-LDL后，其胞質(zhì)內(nèi)NF-κB p65的磷酸化明顯上調(diào)，而ATV能有效抑制這種磷酸化（Fig 4）。

2．5 ATV對ox-LDL致NF-κB核轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)的影響 Ox-LDL導(dǎo)致HMEC中NF-κB的核轉(zhuǎn)錄活性明顯增強，而ATV能明顯下調(diào)ox-LDL所致的NF-κB核內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性增強（Fig 5）。

Fig 1 Effect of ATV on cell viability of endothelial cells after exposure to ox-LDLA：Inhibition of cell viability by various concentrationsofox-LDL（n＝3）；B：Partial recovery of cell viability after pre-treated with ATV（n＝4）.**P＜0.01 vs normal group；＃＃P＜0.01 vs ox-LDL group

Fig 2 Effect of ATV on LDH release afterexposure of endothelial cells to ox-LDL（n＝4）**P＜0.01 vs normal group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs ox-LDL group

Fig 3 Effect of ATV on expression of ICAM-1 after exposure of endothelial cells to ox-LDL（n＝4）**P＜0.01 vs normal group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs ox-LDL group

Fig 4 Effect of ATV on phosphorylation of NF-κB p65 after exposure of endothelial cells to ox-LDL（n＝3）A：Western blot analysis of phosphorylation of NF-κB p65.Lane1：Normal group；Lane 2：Ox-LDL group；Lane 3：ATV＋ox-LDL group；B：Quantitative analysisofwestern blot.*P＜0.05 vs normalgroup；＃＃P＜0.01 vs ox-LDL group

3 討論

血管內(nèi)皮不僅構(gòu)成了血管平滑肌組織與血液間的物理性屏障，而且具有諸多重要生理調(diào)節(jié)功能。Ox-LDL損傷內(nèi)皮細胞，造成血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)與功能的病理性改變，在AS的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色。本研究采用體外培養(yǎng)的人微血管內(nèi)皮細胞，觀察到ox-LDL能導(dǎo)致微血管內(nèi)皮細胞活化和損傷，而ATV對這種活化和損傷有明確的抑制作用。

Fig 5 Effect of ATV on transcriptional activity of NF-κB after exposure of endothelial cells to ox-LDL（n＝4）**P＜0.01 vs normal group；＃＃P＜0.01 vs ox-LDL group

炎癥在AS發(fā)生發(fā)展中扮演了重要的角色［5－6］。NF-κB是多種類型組織細胞內(nèi)調(diào)控細胞因子、炎癥因子、黏附分子等靶基因轉(zhuǎn)錄的核轉(zhuǎn)錄因子，與炎癥、免疫、氧化應(yīng)激、細胞增殖及凋亡等生理和病理過程密切相關(guān)。我們之前的研究表明，人微血管內(nèi)皮細胞HMEC在激活的補體旁路刺激下其NF-κB通路活化［7］，活化的 HMEC細胞明顯上調(diào)表達ICAM-1、E-selectin等黏附分子和重要的趨化因子MCP、IL-8［8］。這類黏附分子和趨化因子是介導(dǎo)、趨化中性粒細胞與內(nèi)皮細胞黏附及跨膜遷移的重要分子，在炎癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。而補體系統(tǒng)及其對內(nèi)皮細胞的活化在AS的發(fā)生和病理進程中具有重要作用［9－10］。同時，被修飾的 LDL、凋亡和壞死的細胞均可激活補體旁路，在AS的炎癥發(fā)展中發(fā)揮重要作用［11－12］。在本研究中，ox-LDL誘導(dǎo)了微血管內(nèi)皮細胞NF-κB通路的磷酸化并進而上調(diào)其核轉(zhuǎn)錄活性，黏附分子ICAM-1的表達明顯上調(diào)。表明ox-LDL可以直接導(dǎo)致基于微血管內(nèi)皮細胞活化應(yīng)答的炎癥發(fā)生。結(jié)果還表明，ox-LDL能明顯抑制HMEC細胞活力和導(dǎo)致LDH的明顯釋放。上述結(jié)果提示，ox-LDL能誘導(dǎo)微血管內(nèi)皮細胞活化和損傷，從而直接和間接導(dǎo)致微血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)與功能的變化，引發(fā)后續(xù)的炎癥和損傷病變，進而損害微血管的重要生理功能。

本研究表明，作為臨床廣泛使用的降脂藥，ATV能明確抑制NF-κB的磷酸化和核內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性，表明ATV可通過抑制NF-κB信號通路活化，下調(diào)炎癥相關(guān)細胞因子和介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達，從而抑制或減輕炎癥。ATV明確抑制ox-LDL造成的微血管內(nèi)皮細胞活化和損傷，提示了ATV防治相關(guān)病征中微血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)與功能損傷的潛在臨床應(yīng)用價值，有助于拓展ATV的臨床應(yīng)用。

參考文獻：

［1］ Nelson R H.Hyperlipidemia as a risk factor for cardiovascular disease［J］.Prim Care，2013，40（1）：195－211.

［2］ Mitra S，Deshmukh A，Sachdeva R，et al.Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy［J］.Am JMed Sci，2011，342（2）：135－42.

［3］ Verhoye E，Langlois M R，Asklepios investigators.Circulating oxidized low-density lipoprotein：a biomarker of atherosclerosis and cardiovascular risk［J］？Clin Chem Lab Med，2009，47（2）：128－37.

［4］ Chan W W，Wong G T，Irwin M G.Perioperative statin therapy［J］.Expert Opin Pharmacother，2013，14（7）：831－42.

［5］ Libby P.Inflammation in atherosclerosis［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2012，32（9）：2045－51.

［6］ Tabas I，Glass CK.Anti-inflammatory therapy in chronic disease：challenges and opportunities［J］.Science，2013，339（6116）：166－72.

［7］ 孫黔云，李 敏，葉巧玲，李紅玲.補體旁路激活導(dǎo)致內(nèi)皮細胞活化和損傷［J］.中國藥理學(xué)通報，2012，28（7）：925－9.

［7］ Sun Q Y，Li M，Ye Q L，LiH L.Endothelial cell activation and injury induced by complementalternative pathway［J］.Chin Pharma Bull，2012，28（7）：925－9.

［8］ 李紅玲，孫黔云，李 敏，石京山.補體旁路激活產(chǎn)物刺激內(nèi)皮細胞NF-κB、p38MAPK、JAK2通路活化及抑制劑的干預(yù)研究［J］.中國細胞生物學(xué)學(xué)報，2013，35（6）：836－41.

［8］ Li H L，Sun Q Y，Li M，Shi J S.Activation of NF-κB、p38MAPK，and JAK2 in endothelial cells induced by activated complement alternative pathway and intervention by inhibitors［J］.Chin JCell Biol，2013，35（6）：836－41.

［9］ Fischetti F，Tedesco F.Cross-talk between the complement system and endothelial cells in physiologic conditions and in vascular diseases［J］.Autoimmunity，2006，39（5）：417－28.

［10］Shishido SN，Varahan S，Yuan K，etal.Humoral innate immune response and disease［J］.Clin Immunol，2012，144（2）：142－58.

［11］Széplaki G，Varga L，F(xiàn)üst G，Prohászka Z.Role of complement in the pathomechanism of atherosclerotic vascular diseases［J］.Mol Immunol，2009，46（14）：2784－93.

［12］OksjokiR，Kovanen PT，Meri S，Pentikainen M O.Function and regulation of the complement system in cardiovascular diseases［J］.Front Biosci，2007，12：4696－708.