于瀟冰，王 琴，楊克凡，范麗霞，張在軍，王玉強，陶 亮

（1.中山大學中山醫(yī)學院藥理學教研室，廣東廣州 510080；2.暨南大學藥學院新藥研究所，廣東 廣州 510632）

阿爾采末?。ˋlzheimer′s disease，AD）是一種以老年斑（SPs）、神經(jīng)元纖維纏結（NFTs）以及腦淀粉樣血管病變（CAA）為特征性病理改變的神經(jīng)退行性疾病，其典型臨床表現(xiàn)為漸進性且不可逆轉的記憶丟失、認知障礙等精神癥狀［1］。SPs與CAA均由聚集態(tài)Aβ蛋白在胞外沉積所形成，而NFTs則由神經(jīng)元胞內(nèi)過度磷酸化的微管結合蛋白tau聚合形成［2－3］。AD發(fā)生時，β淀粉樣蛋白在細胞外異常沉積并引發(fā)一系列的細胞級聯(lián)反應，包括神經(jīng)元興奮性毒性、鈣穩(wěn)態(tài)的破壞、自由基產(chǎn)生、神經(jīng)炎癥、tau蛋白高度磷酸化等，直接或間接地作用在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞，從而最終導致神經(jīng)元功能異?；驍?shù)量減少，引發(fā)一系列精神癥狀［4－5］。這一“β淀粉樣蛋白級聯(lián)假說”是目前公認的AD病理機制之一。在Aβ蛋白引起的級聯(lián)反應的下游，tau蛋白的代謝異常是引起神經(jīng)元功能退化乃至凋亡的一個重要原因［6］。因此，抑制Aβ級聯(lián)反應中的關鍵環(huán)節(jié)已成為AD藥物開發(fā)中的重點。AD的病理表現(xiàn)（包括SPs、NFTs、CAA）提示，該神經(jīng)退行性病變可能與蛋白質的異常折疊和聚集有關，而作為參與細胞中蛋白質折疊的主要因子，熱休克蛋白家族（HSPs）在AD發(fā)生、發(fā)展中的作用逐漸受到人們的重視，不少研究者提出將熱休克蛋白作為AD治療的潛在靶點。研究發(fā)現(xiàn)，某些氯肟衍生物能選擇性增強病理狀態(tài)的熱休克蛋白活性，而對正常熱休克蛋白無影響。TCO-2是由暨南大學藥學院將中藥川穹嗪（TMP）連接到小分子氯肟衍生物arimoclomol上得到的一種新型氯肟衍生物（化學結構見Fig 1）。我們的前期試驗表明，TCO-2在應激細胞模型中，能清除泛素化蛋白（ubiqitination）的聚集，逆轉神經(jīng)細胞損傷，活性優(yōu)于arimoclomol，表明該化合物有可能成為治療AD的新型藥物。本研究在東莨菪堿致記憶獲得性障礙小鼠模型和側腦室注射Aβ1－42所致記憶障礙大鼠模型中，研究了TCO-2和arimoclomol對癡呆動物空間學習記憶障礙的改善作用，并對其機制進行了初步探討。

1 材料與方法

Fig 1 Chem ical structures of chloro-oxime derivatives

1.1 試劑與儀器 Aβ1－42購自 Sigma公司；氫溴酸東莨菪堿購自Sigma公司；arimoclomol及TCO-2由暨南大學藥學院提供；多奈哌齊由國內(nèi)某知名藥企提供；β淀粉樣蛋白1－42（Aβ1－42）ELISA試劑盒購自深圳菲優(yōu)生物有限公司；乙酰膽堿酯酶試劑盒購自南京建成生物工程研究所；phpspho-tau（Ser202）抗體購自武漢博士德公司；phpspho-tau（Ser396）抗體購自美國Abcam公司；HRP標記的山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗、ECL-plus化學發(fā)光劑、DC蛋白定量試劑盒購自美國Bio-Rad公司。Morris水迷宮測試系統(tǒng)購自淮北正華生物儀器設備有限公司；大鼠腦立體定位儀（NARISHIGE SN-3型）購自日本成茂公司；酶標儀購自美國Biotek公司；微量進樣器（規(guī)格5μl）購自上海高鴿工貿(mào)有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購自美國GE公司。

1.2 動物與分組 健康♂成年昆明小鼠40只，體質量（20±2）g；健康♂成年 SD大鼠40只，體質量（200±20）g，均由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供，SPF級，許可證號SCXK（粵）2011－0015。兩種動物均隨機分為正常組、模型組、陽性藥對照組（多奈哌齊）、arimoclomol組和TCO-2組，每組8只。多奈哌齊組采取灌胃給藥方式，其余各組采用腹腔注射給藥。多奈哌齊、arimoclomol、TCO-2均用生理鹽水溶解。給藥劑量分別為：多奈哌齊3 mg·kg－1、arimoclomol 10 mg·kg－1、TCO-2 10 mg·kg－1，正常組與模型組腹腔注射給予相應劑量的藥物溶劑（生理鹽水），給藥容量為 1 ml·（100 g）－1體重，每日 1次，共給藥8 d。

1.3 造模藥物的配制 氫溴酸東莨菪堿由無菌生理鹽水配制，儲存液濃度為0.2 g·L－1，現(xiàn)用現(xiàn)配。Aβ1－42由無菌生理鹽水配制，儲存濃度為2 mg·L－1，37℃恒溫箱孵育4 d，－20℃冰箱保存，切忌反復凍融。

1.4 癡呆動物模型的建立 東莨菪堿癡呆模型的建立：于給藥d 5開始進行學習記憶訓練，實驗共進行5 d，東莨菪堿模型組、待測藥組和多奈哌齊對照組分別在訓練前20 min腹腔注射東莨菪堿（2 mg·kg－1）造成記憶障礙模型，對照組小鼠注射相應劑量生理鹽水。側腦室注射Aβ1－42癡呆模型的建立：大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉（4 ml·kg－1），將麻醉的大鼠固定于大鼠腦立體定位儀上，定位參照George Paxinos和CharlesWatson合著的第5版大鼠腦立體定位圖譜，定位方法：前囟向后1.08 mm、中線旁開2.50 mm、硬腦膜下3.70 mm，采用微量進樣器每只大鼠注射5μl配制好的 Aβ1－42，注射應緩慢，注射完留針10 min以保證其充分彌散，后緩慢撤針，縫合消毒。

1．5 M orris水迷宮實驗 實驗方法參照文獻［7］，并作適當修改。時間共進行5 d，前4 d為定位航行實驗，連續(xù)4 d觀察和記錄實驗動物尋找并爬上平臺所需的時間，檢測小鼠學習獲得能力。d 5進行空間搜索實驗，撤去平臺，記錄動物第1次經(jīng)過原平臺位置的時間（潛伏期）、穿越原平臺位置的次數(shù)，檢測動物空間記憶能力。以潛伏期和穿越平臺次數(shù)作為評價指標，檢測藥物對癡呆模型小鼠學習記憶的改善作用。

1.6 乙酰膽堿酯酶活性的測定 Morris水迷宮測試結束后，腹腔注射10%水合氯醛4 ml·kg－1將動物麻醉，并以冰冷生理鹽水快速進行心臟灌流，直至肝臟及虹膜顏色變白。迅速將動物斷頭、取出大腦、分離海馬。按所取出海馬的重量加9倍重量的生理鹽水，制備腦組織勻漿，1 000×g離心20 min，取上清液置于－20℃冰箱保存。根據(jù)南京建成生物工程研究所提供的乙酰膽堿酯酶活性測試盒的說明書，測定乙酰膽堿酯酶活性，用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。

1．7 側腦室注射癡呆模型大鼠海馬組織Aβ1－42蛋白含量測定 按上述方法取出海馬，并按所取出海馬的重量加9倍重量的蛋白裂解液制備腦組織勻漿，1 000×g離心20 min，取上清液置于－20℃冰箱保存。根據(jù)深圳菲優(yōu)生物有限公司提供的Aβ1－42ELISA試劑盒的說明書測定海馬組織Aβ1－42的蛋白含量。

1．8 側腦室注射癡呆模型大鼠海馬組織磷酸化tau蛋白的免疫印跡 將“1.7”中海馬組織勻漿經(jīng)1 000×g離心20 min，取上清液以DC蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。將含20μg蛋白的樣品90℃水浴5 min變性，經(jīng)SDS-PAGE電泳（8%分離膠）分離后，電轉印至硝酸纖維素膜上。脫脂奶粉封閉，分別加入 phpspho-tau（Ser202）一抗（1∶400），phpsphotau（Ser396）一抗（1∶2 000），4℃孵育過夜。TBST洗膜后加入HRP標記的二抗（1∶1 000），室溫孵育30 min，洗膜后用增強型化學發(fā)光底物（ECL）顯影，曝光。使用Bio Imaging system（Gene Genius）對膠片進行灰度掃描分析。以β-actin為內(nèi)參對照，蛋白表達強度以 phpspho-tau（Ser202）、phpspho-tau（Ser396）蛋白表達灰度值與β-actin灰度值比值表示。

1.9 數(shù)據(jù)的分析與統(tǒng)計 采用Sigma Plot10.0統(tǒng)計軟件對結果進行分析，所有數(shù)值均采用表示，水迷宮試驗中的逃避潛伏期和游泳距離均采用重復測量的方差分析；組間比較采用單因素方差分析和t檢驗。

2 結果

2.1 定位航行實驗 定位航行實驗結果見Tab 1、2。各組實驗動物找到平臺時間（潛伏期）均隨著訓練進行而逐漸縮短。與對照組相比，模型組從d 3開始潛伏期明顯延長（P＜0.05）。而給予陽性藥物Donepezil以及實驗藥物 Arimoclomol、TCO-2后，由東莨菪堿以及Aβ1－42造成的空間學習記憶障礙均得到改善，各實驗組動物的潛伏期明顯縮短，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

Tab 1 Escape latency of Kunm ing m ice treated by scopolam ine

Tab 1 Escape latency of Kunm ing m ice treated by scopolam ine

*P＜0.05 vs modelgroup

Group Day1 Day2 Day3 Day4 Control 75.18±17.63 61.37±16.20 32.64±10.57*25.80±9.22*Model 73.96±22.19 63.72±16.21 55.98±12.72 54.33±13.08 Donepezil 67.91±26.54 55.96±19.31 33.65±9.85* 28.82±8.88*Arimoclomol 80.51±12.27 59.48±15.05 34.11±13.82*27.20±10.88*TCO-2 75.24±17.38 61.89±15.20 36.41±15.78*28.59±12.25*

Tab 2 Escape latency of SD rats treated by Aβ1－4

*P＜0．05 vs modelgroup

Group Day1 Day2 Day3 Day4 Control 83.96±8.80 65.93±17.47 46.00±21.21*35.26±20.01*Model 83.63±12.30 80.55±11.16 79.42±13.38 71.93±20.58 Donepezil 79.23±11.87 64.83±20.91 54.40±23.15*46.41±21.25*Arimoclomol 81.42±8.14 61.76±22.83 48.59±21.25*37.99±16.78*TCO-2 79.11±11.11 63.71±23.37 44.36±20.86*33.47±16.95*

2.2 空間搜索實驗 空間搜索實驗結果見Tab 3、4。各組動物之間的游泳速度差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），排除了動物體力差異對空間學習記憶能力的影響。與對照組相比，模型組動物到達平臺位置時間（潛伏期）明顯延長，穿越平臺次數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。而各給藥組動物潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增加，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在東莨菪堿模型小鼠試驗中，各給藥組與對照組相比，穿越平臺次數(shù)仍然較少，差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 乙酰膽堿酯酶活性測定 Tab 5、6顯示，注射東莨菪堿及Aβ1－42模型動物海馬組織勻漿中AChE活性與對照組相比明顯升高（P＜0.05）；而給予Donepezil、Arimoclomol和 TCO-2后，模型動物海馬組織AChE活性明顯降低，與模型組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

Tab 3 Results of spatial probe test on Kunm ingm ice treated by scopolam ine

Tab 3 Results of spatial probe test on Kunm ingm ice treated by scopolam ine

*P＜0．05 vs model group；＃P＜0．05 vs control group

Group Swimming speed Latency Crossing of the former platform Control 10.53±1.17 8.54±5.81* 6.75±1.26*Model 10.35±1.04 66.42±22.48 0.75±0.96＃Donepezil 11.87±0.60 19.76±8.62* 2.10±0.42*＃Arimoclomol 12.69±2.87 13.95±5.36* 2.25±0.26*＃TCO2 10.76±1.19 16.10±9.92* 2.25±0.50*＃

Tab 4 Results of spatial probe test on SD rats treated by Aβ1－42

Tab 4 Results of spatial probe test on SD rats treated by Aβ1－42

*P＜0．05 vs model group

Group Swimming speed Latency Crossing of the former platform Control 31.91±12.59 22.87±20.05*3.00±1.51*Model 27.75±14.02 69.38±22.14 1.00±1.20 Donepezil 27.34±6.68 40.92±28.80*2.63±2.00*Arimoclomol 35.07±11.79 26.55±16.54*2.7±1.60*TCO-2 34.80±10.08 22.06±16.21*4.38±2.39*

Tab 5 Acetyl cholinesterase activity of Kunm ing m ice treated by scopolam ine

Tab 5 Acetyl cholinesterase activity of Kunm ing m ice treated by scopolam ine

*P＜0．05 vs model group

Group Acetyl cholinesterase activity／kU·g－1Pro Control 0.63±0.15*Model 1.41±0.31 Donepezil 0.72±0.14*Arimoclomol 0.88±0.19*TCO-2 0.77±0.09*

Tab 6 Acetyl cholinesterase activity of SD rats treated by Aβ1－42

Tab 6 Acetyl cholinesterase activity of SD rats treated by Aβ1－42

*P＜0．05 vs model group

Group Acetyl cholinesterase activity／kU·g－1Pro Control 0.51±0.15*Model 1.02±0.19 Donepezil 0.62±0.15*Arimoclomol 0.69±0.16*TCO-2 0.65±0.14*

2．4 側腦室注射 Aβ1－42模型動物海馬組織 Aβ1－42蛋白含量測定 Tab 7結果顯示，經(jīng)側腦室注射凝聚態(tài) Aβ1－42后，海馬組織勻漿中 Aβ1－42含量明顯增加，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；給予試驗藥物arimoclomol以及TCO-2之后，海馬組織中Aβ1－42含量降低，與模型組和Donepezil組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；給予 Donepezil后，海馬組織Aβ1－42含量與模型組相比，差異無顯著性（P＞0.05），而與對照組相比，差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

Tab 7 Concentration of Aβ1－42 in hippocampus ofSD rats treated by Aβ1－42

Tab 7 Concentration of Aβ1－42 in hippocampus ofSD rats treated by Aβ1－42

*P＜0．05 vs model group；＃P＜0．05 vs donepezil group

Group Concentration of Aβ1－42 in hippocampus／ng·L－1 Control 26.41±5.87*＃Model 81.35±24.91 Donepezil 62.05±22.01 Arimoclomol 32.23±8.51*＃TCO-2 32.72±4.56*＃

2．5 側腦室注射Aβ1－42模型動物海馬組織中磷酸化tau蛋白含量測定 Fig 2、3免疫印跡結果顯示，與對照組相比，經(jīng)側腦室注射凝聚態(tài) Aβ1－42后，ptau（包括Ser202、Ser396）表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；給予 arimoclomol后，p-tau（包括Ser202、Ser396）表達下降，與模型組相比差異有顯著性（P＜0.05），但p-tau（Ser202）表達與Donepezil組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；給予TCO-2后，p-tau（Ser202）表達明顯降低（P＜0.05），而 ptau（Ser396）的表達并無明顯變化（P＞0.05）；注射Donepezil對p-tau的表達沒有影響。

Fig 2 Expression of p-tau（Ser396）in hippocam pus of SD rats treated by Aβ1－42（n＝3）*P＜0．05 vs model group；＃P＜0．05 vs donepezil group

3 討論

Fig 3 Expression of p-tau（Ser202）in hippocam pus of SD rats treated by Aβ1－42（n＝3）*P＜0．05 vs model group；＃P＜0．05 vs donepezil group

神經(jīng)退行性疾病，如AD、帕金森綜合癥、脊髓側索硬化綜合癥，又被稱為“蛋白質錯誤折疊疾病”，其典型病理改變?yōu)樯窠?jīng)系統(tǒng)中大量沉積的錯誤折疊的蛋白質。大量研究表明，HSPs對神經(jīng)退行性疾病模型具有一定的神經(jīng)保護作用，例如，過表達HSP70可以對抗Aβ介導的神經(jīng)元毒性，近年來有研究表明［8－10］，HSP70的這一神經(jīng)保護機制可能與其對Aβ低聚物形成的抑制和Aβ蛋白胞吞降解途徑的激活有關。也有證據(jù)顯示，CHIP-HSC70復合體通過介導泛素與磷酸化tau蛋白的結合，從而達到清除可溶性磷酸化tau蛋白的作用［11］。因此，調(diào)節(jié)熱休克蛋白表達的化合物有望成為治療AD的新藥。近年研究發(fā)現(xiàn)［12］，某些氯肟（chloro-oxime）衍生物能選擇性擴大病理狀態(tài)HSP70活性，并對正常狀態(tài)無明顯影響，具有較好的臨床療效和安全性，有望成為臨床治療AD的藥物。有研究表明［13］，氯肟衍生物bimoclomol可恢復受損組織對乙酰膽堿的敏感性，這一現(xiàn)象與組織中大量HSP70的累積有關。而Gupta等［14］的研究表明，溫度與化學物質誘發(fā)的HSP70表達明顯升高都伴隨著腦內(nèi)乙酰膽堿酯酶（AChE）活性的明顯抑制。我們的研究發(fā)現(xiàn)，氯肟衍生物可以明顯抑制海馬組織中AChE活性，這與以上研究結果相符。AD患者腦組織中神經(jīng)遞質乙酰膽堿的數(shù)量減少，東莨菪堿為M膽堿受體阻斷劑，是乙酰膽堿的競爭性非選擇性拮抗劑，能模擬乙酰膽堿分泌不足造成可逆的記憶障礙，常作為抗老年性癡呆藥物研究的初篩模型［15－16］。Aβ蛋白具有神經(jīng)毒性作用，可導致腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)功能降低，促進tau蛋白異常磷酸化等。研究表明，側腦室內(nèi)單次或持續(xù)性注射Aβ蛋白能夠引起學習記憶損害及認知功能障礙，并且能夠多方面模擬AD病理特征，是一種較理想的抗癡呆藥物研究模型［17］。

本實驗采用了上述兩種模型，觀察了氯肟衍生物對癡呆動物學習記憶能力的影響。行為學結果顯示，氯肟衍生物（包括小分子氯肟衍生物arimoclomol以及新型合成氯肟衍生物TCO-2）可改善癡呆模型動物的學習記憶障礙，明顯縮短尋找平臺潛伏期，增加穿越平臺次數(shù)，顯示出對AD模型有一定的防治作用。AD膽堿能假說認為，中樞膽堿能系統(tǒng)與學習記憶有密切關系，乙酰膽堿（ACh）由膽堿乙酰轉移酶（ChAT）合成，AChE分解，中樞ACh含量下降以及AChE活性升高是AD的主要病理生化改變。而β淀粉樣蛋白級聯(lián)假說認為，β淀粉樣肽（Aβ）才是AD發(fā)病的多種早期病理改變的促發(fā)因素。為了探討氯肟衍生物改善癡呆動物學習記憶能力的機制，本實驗根據(jù)兩種癡呆模型建立的原理，分別對東莨菪堿模型小鼠海馬組織進行AChE測定，以及對側腦室注射Aβ1-42模型大鼠的海馬組織進行AChE測定、Aβ1－42含量測定和磷酸化tau蛋白含量測定。結果顯示，氯肟衍生物可以抑制腦內(nèi)AChE活性，并且降低腦內(nèi)Aβ1－42含量，還可以不同程度地降低腦內(nèi)磷酸化tau蛋白表達。我們的試驗結果顯示，兩種模型動物學習記憶的改善情況與AChE活性結果呈負相關；并且在側腦室注射Aβ1－42所致的癡呆模型中，癡呆動物記憶改善的情況也與Aβ1－42含量以及磷酸化tau蛋白的表達量呈負相關。以上結果與AD的兩種病理假說相符，而本試驗的結果也提示氯肟衍生物可能具有多方面的藥理作用，其增強癡呆動物的學習記憶能力的機制可能與抑制AChE合成，減少ACh分解，從而提高腦內(nèi)ACh水平有關；并且該化合物也可能通過抑制模型大鼠腦組織Aβ1－42含量，降低tau蛋白磷酸化，穩(wěn)定微管蛋白，從而改善大腦功能，促進學習記憶能力。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，自主合成的新型氯肟衍生物TCO-2與arimoclomol對不同位點磷酸化的tau蛋白表達的影響存在差異。Western blot結果顯示，TCO-2可以明顯降低 p-tau（Ser202）的表達，而對 p-tau（Ser396）表達無影響；arimoclomol對 p-tau（Ser202）以及 p-tau（Ser396）的表達均有抑制作用。據(jù) Wang等［18］研究發(fā)現(xiàn)，在體外實驗中，細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶5（cdk-5）可明顯提高 tau蛋白 Ser199、Ser202、Thr205、Thr212、Thr231、Ser404位點的磷酸化，但不影響Ser396位點磷酸化。故本實驗的結果提示，新型氯肟衍生物TCO-2可能與特異性地抑制cdk-5激酶信號通路，從而下調(diào)磷酸化tau蛋白的表達有關。盡管在本研究中，動物行為學結果、AChE活性以及Aβ1－42含量在 arimoclomol與 TCO-2兩種化合物干預下差異并沒有統(tǒng)計學意義，但是不同磷酸化tau蛋白表達的差異提示，這兩種化合物可能通過誘導不同分子伴侶蛋白（包括sHSP、HSP70、HSP90等），從而抑制了不同影響tau蛋白磷酸化的激酶，但其更深層次的作用機制有待進一步研究。

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