王麗鴛，成 浩*，賀 巍，韋 康，張成才

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所國家茶樹改良中心，浙江 杭州 310008；2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河南 鄭州 450002）

不同產(chǎn)區(qū)龍井茶相似性及線性判別

王麗鴛1，成 浩1*，賀 巍2，韋 康1，張成才1

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所國家茶樹改良中心，浙江 杭州 310008；2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河南 鄭州 450002）

對(duì)來自西湖龍井一級(jí)保護(hù)區(qū)、西湖龍井二級(jí)保護(hù)區(qū)、錢塘產(chǎn)區(qū)、越州產(chǎn)區(qū)4個(gè)產(chǎn)區(qū)的527份龍井茶樣品進(jìn)行了高效液相色譜測(cè)定和主成分分析及線性判別，結(jié)果表明：不同產(chǎn)區(qū)的龍井茶在兒茶素等酚性物質(zhì)及咖啡堿含量上沒有顯著性差異；通過主成分分析，提煉出5個(gè)主成分，其中第一主成分構(gòu)成中影響較大的因子有EGCG、EGC、C、CAF和EC，第二主成分構(gòu)成中影響最大的因子為ECG；在第一第二主成分得分值平面中，樣品點(diǎn)基本按照品種聚合成群，說明原料品種不同是影響龍井茶的內(nèi)含成分的主要因素之一；歐氏距離與判別分析結(jié)果顯示，二級(jí)保護(hù)區(qū)的西湖龍井茶與一級(jí)保護(hù)區(qū)西湖龍井茶之間的差異最大，越州龍井與一級(jí)保護(hù)區(qū)西湖龍井茶產(chǎn)品間差異較小。

龍井茶；相似性；高效液相色譜；線性判別

西湖龍井茶是中國的歷史名茶，歷史上其產(chǎn)區(qū)只包括杭州市西湖周邊不到50 km2的區(qū)域。從20世紀(jì)90年代開始，在杭州及周邊地區(qū)開始出現(xiàn)了仿西湖龍井茶的扁形茶產(chǎn)品。2001年，浙江省公布了《龍井茶原產(chǎn)地域保護(hù)管理辦法》，將浙江省內(nèi)的龍井茶原產(chǎn)地域范圍劃分為西湖產(chǎn)區(qū)、錢塘產(chǎn)區(qū)和越州產(chǎn)區(qū)三大區(qū)塊。同時(shí)，杭州市頒布的《杭州市西湖龍井茶基地保護(hù)條例》又將原西湖區(qū)西湖鄉(xiāng)內(nèi)的龍井茶基地規(guī)定為西湖龍井茶基地的一級(jí)保護(hù)區(qū)，屬西湖區(qū)的其余龍井茶基地為二級(jí)保護(hù)區(qū)。2005年7月15日，西湖龍井茶獲得了地理標(biāo)志保護(hù)。由于采用的加工工藝十分相似，從外形、滋味、香氣等方面很難對(duì)不同地區(qū)龍井茶進(jìn)行區(qū)分。目前，龍井茶，尤其是西湖龍井茶，受假冒偽劣產(chǎn)品的影響比較嚴(yán)重。因此，需要對(duì)不同產(chǎn)地龍井茶的化學(xué)組成差異進(jìn)行分析，并建立龍井茶產(chǎn)地判別的方法。

在茶學(xué)研究上，早期的研究基本集中在對(duì)茶葉生化成分的定性和定量同時(shí)測(cè)定[1～4]。此后，開始有了對(duì)不同區(qū)域來源茶葉的成分組成進(jìn)行分析辨別的努力[5～6]。相對(duì)來說，近紅外技術(shù)在茶葉成分的定性、定量預(yù)測(cè)，茶葉產(chǎn)品種類的辨別，茶葉產(chǎn)地的區(qū)分方面應(yīng)用的比較多[7～18]。高效液相色譜（High-performance liquid chromatography，HPLC）是另一個(gè)對(duì)茶葉進(jìn)行產(chǎn)區(qū)鑒別的分析方法?；贖PCL的化學(xué)定量分析，在食品產(chǎn)地鑒別的方面很有發(fā)展前景[19]。研究表明，利用HPLC化學(xué)成分檢測(cè)數(shù)據(jù)，可以對(duì)茶葉產(chǎn)區(qū)、原料品種等進(jìn)行鑒別[20～24,5～6]。

本文采集了不同產(chǎn)區(qū)的大量龍井茶樣本，采用代謝組學(xué)的原理，對(duì)以兒茶素為主的酚性成分含量進(jìn)行了液相色譜測(cè)定，然后對(duì)不同產(chǎn)區(qū)龍井茶的組分差異及相似性進(jìn)行模式識(shí)別分析，并嘗試用線性判別方法對(duì)不同產(chǎn)區(qū)產(chǎn)品進(jìn)行區(qū)分。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料和標(biāo)準(zhǔn)品

試驗(yàn)樣本為2009年春季收集的不同產(chǎn)區(qū)的84個(gè)取樣點(diǎn)的龍井茶樣品，共527個(gè)。按照GB/T18650-2008的規(guī)定，其中西湖龍井一級(jí)保護(hù)區(qū)茶樣（XHLJ1）174份，來自一級(jí)保護(hù)區(qū)內(nèi)龍井村、梅家塢等10個(gè)自然村的27個(gè)取樣點(diǎn)；西湖龍井二級(jí)保護(hù)區(qū)茶樣（XHLJ2）56份，來自二級(jí)保護(hù)區(qū)的10個(gè)取樣點(diǎn)；錢塘龍井茶樣（QTLJ）137份，來自錢塘產(chǎn)區(qū)5個(gè)縣的20個(gè)取樣點(diǎn)；越州龍井茶樣（YZLJ）160份，來自越州龍井產(chǎn)區(qū)6個(gè)縣的27個(gè)取樣點(diǎn)。為減少樣品采摘期對(duì)龍井茶產(chǎn)地判別的干擾，從同一采樣點(diǎn)，收集采摘前期、中期、晚期的相同原料品種的龍井茶樣各1個(gè)，其中一個(gè)來自春茶開采后約第5天，一個(gè)來自開采后約第15天，另一個(gè)為第25天。樣本的原料品種為無性系品種龍井43（LJ43）和有性群體種（POPN）。

兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和咖啡堿（Caffeine, CAF）等標(biāo)準(zhǔn)品購于Sigma公司。

1.2 樣品測(cè)定

稱取3.000 g（粉碎）干茶樣，用50%甲醇室溫提取15 min后過濾。殘?jiān)礈?次，合并濾液，定容到100 mL。液相色譜分析采用安捷倫1100 HPLC系統(tǒng)，4 μm Phenomenex RP-MAX C12反相柱，型號(hào)規(guī)格為250 mm×4.6 mm，柱溫40℃；A相為1%甲酸；B相為乙腈；梯度從4%B到25%B，流速1 mL/min，洗脫60 min，檢測(cè)波長280 nm[25]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

咖啡堿、C、EGC、EC、EGCG、GCG和ECG等組分通過與標(biāo)準(zhǔn)品的比較確認(rèn)。其他未得到辨認(rèn)的酚性化合物和生物堿，通過比較保留時(shí)間和相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行匹配。去除掉一些不夠穩(wěn)定的小峰后，共保留26個(gè)HPLC峰用于分析。數(shù)理統(tǒng)計(jì)、主成分分析和線性判別分析采用 SPSS軟件進(jìn)行；在線性判別分析中，對(duì)每類樣本采取隨機(jī)取二留一的方法劃分訓(xùn)練集和驗(yàn)證集。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)區(qū)龍井茶HPLC化學(xué)圖譜相似度分析

西湖龍井一級(jí)保護(hù)區(qū)（XHLJ1）、西湖龍井二級(jí)保護(hù)區(qū)（XHLJ2）、錢塘產(chǎn)區(qū)（QTLJ）和越州產(chǎn)區(qū)（YZLJ）4個(gè)產(chǎn)區(qū)樣品的26個(gè)面積較大的HPLC共有峰的峰面積平均值和標(biāo)準(zhǔn)差見表1。SPSS的ONE-WAY ANOVA檢驗(yàn)表明，在α = 0.05水平下，不同產(chǎn)區(qū)龍井茶兒茶素等酚性化合物與生物堿HPLC含量在同一水平，沒有顯著性差異。

表1 4個(gè)產(chǎn)區(qū)龍井茶的兒茶素等酚性化合物與生物堿的HPLC平均峰面積

4個(gè)產(chǎn)區(qū)龍井茶HPLC組份的歐氏距離見表2。從表2可以發(fā)現(xiàn)，XHLJ1和XHLJ2之間的歐氏距離最大，QTLJ和YZLJ之間的歐氏距離最小。4個(gè)產(chǎn)區(qū)龍井茶HPLC組份的歐氏距離和地理距離不一致，XHLJ 1和XHLJ 2之間的地理距離最近的，而歐氏距離卻最大。

表2 4個(gè)產(chǎn)區(qū)龍井茶的HPLC化學(xué)組成的歐氏距離

2.2 龍井茶的主成分分析

對(duì)龍井茶的HPLC化學(xué)組分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，共提取出5個(gè)主成分（表3），累計(jì)貢獻(xiàn)率為94.2%，其中前兩個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率分別為48%和23%（表3）。從表3可以發(fā)現(xiàn)，第一主成分（PC 1）的構(gòu)成中，對(duì)主成分得分值影響較大的因子按系數(shù)大小降序?yàn)镋GCG、EGC、P11、C、CAF和EC，體現(xiàn)了幾種主要兒茶素單體成分的影響力；在第二主成分（PC 2）的主要構(gòu)成中，影響大小依次為ECG、P20、CAF、P3和P16，主要包含的是一些洗脫時(shí)間較長的組分。以各樣本第一、第二主成分得分值分別作為X坐標(biāo)和Y坐標(biāo)作圖（圖1），發(fā)現(xiàn)龍井茶按照品種的不同聚成兩個(gè)集團(tuán)，龍井43品種樣本（LJ43）主要位于左上方，而群體種樣本（POPN）主要位于右下方（圖1A），說明原料品種是影響龍井茶內(nèi)含成分關(guān)鍵性因素之一。但是，按照各樣本的第一、第二主成分得分值，未能將不同產(chǎn)地龍井茶分開（圖1B）。

表3 主成分的成分矩陣及貢獻(xiàn)率

表3續(xù)

圖1 龍井茶的第一、第二主成分得分值分布

2.3 不同產(chǎn)區(qū)龍井茶的線性判別

線性判別分析首先將分析樣本分為訓(xùn)練集和驗(yàn)證集兩部分，先用訓(xùn)練集樣本建立判別模型，然后將訓(xùn)練集中的樣本每次輪流抽走一個(gè)后重新建模，來判定建立的判別模型的穩(wěn)定性，最后用驗(yàn)證集樣本來驗(yàn)證判別模型的適用性和正確率。對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性判別分析，得到3個(gè)判別函數(shù)，其函數(shù)系數(shù)矩陣見表4。判別分析的結(jié)果表明（表5），117個(gè)西湖龍井一級(jí)保護(hù)區(qū)（XHLJ1）訓(xùn)練集的建模樣本中，106個(gè)分類正確，10個(gè)被劃分為越州龍井，1個(gè)被誤判為錢塘龍井；交叉驗(yàn)證的數(shù)據(jù)基本一致；而57個(gè)驗(yàn)證集樣本，49個(gè)判定為XHLJ 1，8個(gè)判定為YZLJ。在西湖龍井二級(jí)保護(hù)區(qū)（XHLJ 2）的訓(xùn)練集及其交叉驗(yàn)證中，均有三分之一左右的樣本被認(rèn)定成錢塘龍井（QTLJ），驗(yàn)證集中更有近一半的樣本被認(rèn)定成QTLJ。至于QTLJ，無論是訓(xùn)練集還是其交叉驗(yàn)證，或者是外部驗(yàn)證，都有20% ～ 30%的樣本被分類成其他幾種類別。而YZLJ是判別正確率最高的一類，無論哪種情況，只有少量的樣本被判定到XHLJ 1或QTLJ中。

表4 典型判別式函數(shù)系數(shù)

以各樣本的判別函數(shù)值作圖，在前兩個(gè)判別函數(shù)值FUN 1和FUN 2的投射平面（圖2A）上，XHLJ 1位于左上，YZLJ位于左下，而XHLJ 2和QTLJ重疊在右邊；在FUN 1和FUN 3組成的投射平面上（圖2B）可以看到，XHLJ 1集中于最左邊的小塊區(qū)域內(nèi)，YZLJ則更靠右一點(diǎn)，而XHLJ 2在右側(cè)集中于上部，而QTLJ較零落地分布在右下部。

圖2 4個(gè)產(chǎn)區(qū)龍井茶的判別分析

表5 判別分析結(jié)果

3 討論

由于不同加工工藝、原料嫩度對(duì)茶的品質(zhì)成分有很大影響，因此不同種類茶的HPLC圖譜有較大的差異性,往往比較容易進(jìn)行區(qū)分。而不同產(chǎn)區(qū)龍井茶及以龍井茶加工工藝制成的其他扁形茶，因其原料嫩度要求一致、加工工藝相同，其化學(xué)組成及 HPLC圖譜的相似度很高, 更難對(duì)同一茶類進(jìn)行產(chǎn)區(qū)判別。本研究也發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)區(qū)龍井茶在兒茶素、咖啡堿等化學(xué)成分的含量上沒有顯著性區(qū)別，而且HPLC圖譜的相似度高。

進(jìn)一步的主成分分析結(jié)果表明，茶葉中最重要的幾類兒茶素單體是構(gòu)成第一、第二主成分的主要因子。根據(jù)前兩個(gè)組分得分值，相同原料品種的龍井茶樣本聚在一起。這一結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證的就是這樣一個(gè)事實(shí)：由于遺傳基礎(chǔ)的不同，不同茶樹品種所具有的特有的生化成分比例，可以影響成品茶的品質(zhì)風(fēng)味。因此，為了得到穩(wěn)定的產(chǎn)品品質(zhì)和特色，除加工工藝外，鮮葉原料也應(yīng)該采用固定的茶樹品種或固定的品種搭配比例。這也說明，原料品種會(huì)對(duì)茶葉產(chǎn)區(qū)判別帶來較大的干擾。

此外，從不同產(chǎn)區(qū)龍井茶的歐氏距離結(jié)果可看到，地理距離最近的二級(jí)保護(hù)區(qū)的西湖龍井茶與一級(jí)保護(hù)區(qū)的西湖龍井茶之間的歐氏距離最大；而且在判別分析中，一級(jí)保護(hù)區(qū)與二級(jí)保護(hù)區(qū)的西湖龍井茶之間沒有誤判。這一結(jié)果說明，在被研究的幾類茶產(chǎn)品中，二級(jí)保護(hù)區(qū)的西湖龍井茶與一級(jí)保護(hù)區(qū)西湖龍井茶差異最大。相反，地理距離較遠(yuǎn)的越州龍井與西湖龍井一級(jí)保護(hù)區(qū)間的歐氏距離反而最為接近，兩者間的互相誤判也相對(duì)較多。對(duì)這一結(jié)果的解釋，僅僅考慮地域分布是不夠的，可能需要從歷史傳統(tǒng)和加工技術(shù)細(xì)節(jié)等各方面來加以分析。西湖龍井二級(jí)保護(hù)區(qū)歷史上幾乎都是生產(chǎn)旗槍茶的，20世紀(jì)90年代以后才開始轉(zhuǎn)產(chǎn)龍井茶，直到本世紀(jì)初才正式劃入西湖龍井產(chǎn)區(qū)。旗槍茶與西湖龍井茶外形比較相像，都屬于扁形茶，但旗槍更為細(xì)長一些，加工工藝上，都有“青鍋”和“煇鍋”兩個(gè)工序，但旗槍以前還有“挺鍋”工序。這兩類茶產(chǎn)品雖然挺類似，但風(fēng)格特征上仍然存在差異。這些工藝上的風(fēng)格和習(xí)慣，在轉(zhuǎn)產(chǎn)龍井茶并劃入龍井產(chǎn)區(qū)后，不可避免的還會(huì)有一定程度的留存和影響，因此可能是造成這兩個(gè)產(chǎn)區(qū)產(chǎn)品之間存在一定差異的原因之一。而越州產(chǎn)品的龍井茶生產(chǎn)主要來自于上世紀(jì)90年代對(duì)西湖龍井歷史產(chǎn)區(qū)的學(xué)習(xí)和模仿，沒有歷史工藝的干擾和影響，因此可能在與西湖龍井一級(jí)保護(hù)區(qū)產(chǎn)品的區(qū)分上更為困難一些。

本文采用代謝組學(xué)原理和模式識(shí)別技術(shù)研究了龍井茶4個(gè)不同產(chǎn)區(qū)產(chǎn)品間的相似性和加以鑒別的可行性，雖然這一方法還不能正式用于茶產(chǎn)品產(chǎn)地的鑒別，但是在對(duì)于茶學(xué)研究中新思維和新技術(shù)手段的引進(jìn)，對(duì)于現(xiàn)在越來越多的茶葉地理標(biāo)志產(chǎn)品認(rèn)定科學(xué)依據(jù)的探索，都有良好的推動(dòng)作用。

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Similarity and Linear Analysis of Longjing Tea from Different Production Areas

WANG Li-yuan1，CHENG Hao1*，HE Wei2，WEI Kang1，ZHANG Cheng-cai1
（1. National Center for Tea Improvement, Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China; 2. College of Horticulture, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China）

In present study, totally 527 Longjing tea samples were collected from four production areas and analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC), combined with principal component analysis(PCA) and linear discriminant analysis(LDA). The result showed that 5 PCs could be extracted and the most important factors in the first PC composition were EGCG, EGC, C, CAF and EC. Meanwhile, the most important factor in the second PC was ECG. And in the score plot of the first two PCs, samples grouped according to the varieties of their fresh leaf material. On the other hand, the result of discriminant and Euclidean distance analysis suggested that the tea samples of Xihu Longjing secondary protection zone had the least similarity to those of primary protection zone. And compared to other two groups, the difference between Yuezhou Longjing and Xihu Longjing primary protection zone was the least.

Longjing tea; similarity; high performance liquid chromatography; linear discriminant analysis

S571.1

A

1001-3776（2014）02-0018-06

2013-08-30；

2014-01-16

浙江省重大科技專項(xiàng)（優(yōu)先主題）農(nóng)業(yè)項(xiàng)目（2008C12070）

王麗鴛（1978－），女，浙江金華人，副研究員，博士，從事茶樹生物工程與遣傳育種研究；*通訊作者。