吳 萍，朱雪萍，張旭東，張林杰

（安徽醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室，安徽合肥 230032）

腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）是腫瘤壞死因子超家族的成員，自1995年被發(fā)現(xiàn)以來，由于其特異地殺傷腫瘤細(xì)胞而不損害正常細(xì)胞的特性受到了腫瘤研究領(lǐng)域的廣泛關(guān)注。目前認(rèn)為TRAIL誘導(dǎo)凋亡主要是通過caspase-8介導(dǎo)的外源性途徑（或死亡受體途徑）和caspase-9介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑（或線粒體途徑）。在caspases家族中還有一類炎性 caspases［1］，在人類主要有 caspase-1、caspase-4和caspase-5，而在小鼠主要有caspase-1、capase-11和caspase-12。人的caspase-4與小鼠的caspase-12在序列上有48%的同源性，兩者都定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜上，二者在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡中可能發(fā)揮著重要作用［2］。有研究表明，TRAIL也可以引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［3-4］，此外，caspase-4參與了 TRAIL誘導(dǎo)的凋亡過程［5-6］。本研究擬探索內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在TRAIL誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡中的作用，以及caspase-4在其中的參與情況，以更好地剖析TRAIL誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的過程。

1 材料與方法

1.1 材料 胃癌細(xì)胞SGC-7901和BGC-823購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；RPMI 1640培養(yǎng)基和Opti-MEM低血清培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；重組人可溶性TRAIL購自Immunex公司；衣霉素（tunicamycin，TM）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）購自Sigma-Aldrich公司；caspase-4抑制劑（z-LEVD-fmk）購自BioVision公司；小鼠抗人caspase-4單克隆抗體購自Abcam公司；小鼠抗人caspase-3單克隆抗體及兔抗人GRP78多克隆抗體購自Santa Cruz公司；小鼠抗人β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；人caspase-4 siRNA序列由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成；Lipofectamine 2000 Reagent購自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SGC-7901和BGC-823細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 實(shí)驗(yàn)分4組：（1）對(duì)照組；（2）TRAIL（200μg·L-1）組；（3）z-LEVD-fmk（30μmol·L-1）組；（4）z-LEVD-fmk（30μmol·L-1）+TRAIL（200μg·L-1）組；每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將細(xì)胞按1×105個(gè)／孔接種于24孔板上，次日待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，給予不同處理24 h。分別收集上清液，每孔加入質(zhì)量濃度為0.05 g·L-1的 PI溶液750μl，于37℃條件下避光作用10～20 min，待孔內(nèi)貼壁細(xì)胞完全消化后，也收集至相應(yīng)流式管中，充分混勻，4℃避光過夜，次日上流式細(xì)胞儀（Becton Dickinson FACSVerse）檢測細(xì)胞的凋亡情況，采用FCSExpress 4軟件分析亞二倍體峰（sub-G1）所占的百分比即為細(xì)胞凋亡率。

1.2.3 siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞 從GeneBank中檢索人caspase-4基因序列，根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)3對(duì)siRNA（Tab 1），將隨機(jī)選取序列的siRNA作為陰性對(duì)照（negative control，NC）。轉(zhuǎn)染前 1 d，接種細(xì)胞于6孔板，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，次日細(xì)胞融合達(dá)30%～50%。實(shí)驗(yàn)分5組：（1）未轉(zhuǎn)染組（Control）；（2）轉(zhuǎn)染 NC siRNA組；（3）轉(zhuǎn)染 caspase-4 siRNA_101組；（4）轉(zhuǎn)染 caspase-4 siRNA_102組；（5）轉(zhuǎn)染caspase-4 siRNA_103組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。各轉(zhuǎn)染組均用100μl的Opti-MEM稀釋100 pmol siRNA，柔和混勻，再用100μl的Opti-MEM稀釋7.5μl的Lipofectamine 2000 Reagent，輕輕混勻，室溫放置5 min，將稀釋好的siRNA和Lipofectamine 2000 Reagent混合，室溫放置 20 min，形成 siRNA／Lipofectamine復(fù)合物，最后將 200μl siRNA／Lipofectamine復(fù)合物滴入到孔中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中，4 h后換液。轉(zhuǎn)染48 h后提取細(xì)胞總蛋白，用Western blot驗(yàn)證siRNA沉默效果。另外接種細(xì)胞于24孔板，按上述方法轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后，加入TRAIL（200 μg·L-1）繼續(xù)處理24 h，PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞在轉(zhuǎn)染siRNA caspase-4后的凋亡情況（方法同“1.2.2”）。

Tab 1 Sequences of caspase-4 siRNA

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達(dá)情況 收集細(xì)胞，加入100μl的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4℃14 000×g離心30 min后取上清液，此為細(xì)胞總蛋白。采用BCA法蛋白定量后，取20μg行SDS-PAGE電泳分離蛋白，隨后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用含質(zhì)量濃度為50 g· L-1脫脂奶粉的TBST封閉2 h，然后加入一抗，4℃孵育過夜，次日用TBST洗3次，每次10 min，再加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。電化學(xué)發(fā)光法顯色，采用天能全自動(dòng)凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）照相并分析結(jié)果。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 z-LEVD-fmk能阻止TRAIL誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡 PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，TRAIL單獨(dú)作用時(shí)，兩株胃癌細(xì)胞都快速地發(fā)生凋亡，SGC-7901和BGC-823細(xì)胞在處理24 h的凋亡率分別為（68.77±4.05）%和（31.17±2.41）%。caspase-4的抑制劑 z-LEVD-fmk對(duì)細(xì)胞幾乎無毒性，作用24 h的凋亡率和對(duì)照組相當(dāng)，都在5%以下。而當(dāng)細(xì)胞用 z-LEVD-fmk預(yù)處理1 h，再加入TRAIL繼續(xù)作用24 h時(shí)細(xì)胞凋亡率分別為（1.67±0.65）%和（14.47±1.62）%，和單用 TRAIL相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明z-LEVD-fmk能很大程度上抑制TRAIL誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡（Fig 1）。

Fig 1 Inhibitory effect of caspase-4 inhibitor z-LEVD-fm k on TRAIL-induced apoptosisControl：untreated cells；TRAIL：cells treated with TRAIL（200μg·L-1）for 24 h；z-LEVD-fmk：cells treated with z-LEVD-fmk（30 μmol·L-1）for 24 h；z-LEVD-fmk+TRAIL：cells treated with z-LEVD-fmk（30μmol·L-1）1 h before the addition of TRAIL（200μg·L-1）for a further 24 h.*P＜0.05 vs TRAIL

2．2 siRNA沉默 caspase-4基因能明顯降低caspase-4蛋白的表達(dá)水平 利用3條caspase-4 siRNA分別轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，Western blot驗(yàn)證caspase-4的沉默效果，發(fā)現(xiàn)和未轉(zhuǎn)染組（Control）以及陰性對(duì)照組（NC）相比，3條 caspase-4的 siRNA序列都能降低細(xì)胞中caspase-4的蛋白表達(dá)水平，其中在SGC-7901細(xì)胞中103序列的沉默效果最好，而在BGC-823中101序列的沉默效果最好（Fig 2）。

Fig 2 Knockdown efficiency of caspase-4 siRNACell lysates were collected 48 h posttransfection and aliquots of 20 μg were subjected to Western blot analysis of caspase-4 levels.

2．3 Caspase-4 siRNA對(duì)TRAIL誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的影響 根據(jù)上述轉(zhuǎn)染效果，選擇caspase-4 siRNA_103和101，分別轉(zhuǎn)染SGC-7901和BGC-823細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測其對(duì)TRAIL誘導(dǎo)凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染caspase-4 siRNA可以部分地抑制胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡（Fig 3），和陰性對(duì)照組（NC）相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

Fig 3 Im pact of caspase-4 siRNA on TRAIL-induced apoptosisCellswere transfected with either the negative control（NC）or the caspase-4 siRNA for 24 h before treatmentwith TRAIL（200μg·L-1）for another24 h and then the apoptotic ratewas detected by FCM.*P＜0.05 vs NC

2．4 TRAIL誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng) GRP78蛋白表達(dá)水平的上調(diào)被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生的金標(biāo)準(zhǔn)。Fig 4顯示，正常情況下胃癌細(xì)胞中GRP78的表達(dá)水平很低，TRAIL處理后6 h和16 h有所升高，說明TRAIL能激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生，但其增高的程度遠(yuǎn)不及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激經(jīng)典的誘導(dǎo)劑衣霉素（TM）的作用。

Fig 4 Upregulation of GRP78 by TRAILCells were treated with 200μg·L-1 TRAIL as indicated before measurement of the expression ofGRP78 byWestern blot.The classic ER stress inducer TM（3μmol·L-1）was used as a control.

2．5 TRAIL作用早期caspase-4發(fā)生活化 Western blot檢測在TRAIL處理后不同時(shí)間caspase-4和caspase-3的活化情況，結(jié)果顯示 Pro-caspase-4在TRAIL作用后120 min開始下降，到180 min時(shí)降低明顯，而Cleaved-caspase-4最早出現(xiàn)在TRAIL作用后的 30 min。Caspase-3活化得更早，Cleavedcaspase-3出現(xiàn)在TRAIL作用10 min以后（Fig 5）。

Fig 5 Activation of caspase-3 and caspase-4 after TRAIL treatmentCells were treated with TRAIL at 200μg· L-1 for the indicated time periods beforemeasurement of the expression level of caspase-3 and caspase-4 by Western blot.

3 討論

既往我們對(duì)TRAIL誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的過程進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)除了死亡受體途徑外，線粒體途徑也參與其中［7］。但越來越多的證據(jù)表明，TRAIL誘導(dǎo)的凋亡可能還有其他細(xì)胞器的參與，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)［8］和溶酶體［9］。目前對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡途徑還不十分清楚，一般認(rèn)為主要是通過活化caspase-12、產(chǎn)生活性氧、激活JNK以及轉(zhuǎn)錄因子CHOP所介導(dǎo)［10］。其中caspase-12顯得尤為重要，因?yàn)樵缙谘芯堪l(fā)現(xiàn)caspase-12缺陷的小鼠細(xì)胞對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性的凋亡完全抵抗［11］，然而caspase-12只在嚙齒類動(dòng)物中表達(dá)，人類缺乏有功能的caspase-12［2］。近幾年的研究認(rèn)為，人的caspase-4能替代小鼠caspase-12的功能，二者在序列上相似，且都定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜上。Jiang等［12］發(fā)現(xiàn)，如果把GRP78的抑制作用去掉，caspase-4能明顯地使黑色素瘤細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性的凋亡。此外caspase-4還參與了TRAIL誘導(dǎo)的人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞的凋亡［5-6］。

本研究采用caspase-4特異的抑制劑z-LEVD-fmk在TRAIL作用之前1 h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)z-LEVD-fmk能明顯降低TRAIL誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡，這種作用在SGC-7901細(xì)胞中尤為明顯。此外利用 caspase-4 siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，也使得TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡受到部分抑制。以上兩個(gè)結(jié)果充分說明caspase-4參與了TRAIL的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Western blot檢測到GRP78蛋白表達(dá)水平上調(diào)，但是這種升高的程度有限，遠(yuǎn)低于經(jīng)典的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)劑TM的作用，說明TRAIL激活了較低水平的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。另外TRAIL作用30 min起Cleaved-caspase-4即出現(xiàn)，而Cleaved-caspase-3出現(xiàn)得更早，說明caspase-4比caspase-3活化得晚。有報(bào)道稱TM引起的caspase-4活化不依賴于caspase-8的活化，且在 caspase-9和 caspase-3活化的上游［12］，而 TRAIL誘導(dǎo)的 caspase-4活化發(fā)生在caspase-3的下游［6］，可見在TM和TRAIL誘導(dǎo)的不同程度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡途徑中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有很大的不同，但其中具體的分子機(jī)制仍不清楚。

綜上所述，本研究顯示caspase-4活化對(duì)TRAIL誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡是必需的，此外TRAIL激活caspase-4與中等程度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡途徑的參與將幫助我們更全面地了解TRAIL誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制，找到增加細(xì)胞對(duì)TRAIL敏感性的新靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Martinon F，Tschopp J.Inflammatory caspases and inflammasomes：master switches of inflammation［J］.Cell Death Differ，2007，14（1）：10-22.

［2］ Hitomi J，Katayama T，Eguchi Y，etal.Involvementof caspase-4 in endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis and Abeta-induced cell death［J］.JCell Biol，2004，165（3）：347-56.

［3］ Inoue T，Suzuki-Karasaki Y.Mitochondrial superoxide mediates mitochondrial and endoplasmic reticulum dysfunctions in TRAIL-induced apoptosis in Jurkat cells［J］.Free Radic Biol Med，2013，61C：273-84.

［4］ Murai M，Inoue T，Suzuki-Karasaki M，et al.Diallyl trisulfide sensitizes human melanoma cells to TRAIL-induced cell death by promoting endoplasmic reticulum-mediated apoptosis［J］.Int J Oncol，2012，41（6）：2029-37.

［5］ Yang X，Wang J，Liu C，etal.Cleavage of p53-vimentin complex enhances tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligandmediated apoptosis of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts［J］.Am JPathol，2005，167（3）：705-19.

［6］ Mao ZG，Jiang CC，Yang F，et al.TRAIL-induced apoptosis of human melanoma cells involvesactivation of caspase-4［J］.Apoptosis，2010，15（10）：1211-22.

［7］ 吳 萍，陳 思，程文晉，等.線粒體凋亡途徑參與TRAIL誘導(dǎo)胃腺癌細(xì)胞凋亡［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，42（6）：599-603.

［7］ Wu P，Chen S，Cheng W J，et al.The mitochondrial apoptotic pathway is involved in TRAIL-induced apoptosis of gastric adenocarcinoma［J］.Acta UnivMed Anhui，2007，42（6）：599-603.

［8］ Boyce M，Yuan J.Cellular response to endoplasmic reticulum stress：amatter of life or death［J］.Cell Death Differ，2006，13（3）：363-73.

［9］ Werneburg NW，GuicciardiM E，Bronk SF，etal.Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand activates a lysosomal pathway of apoptosis that is regulated by Bcl-2 proteins［J］.JBiol Chem，2007，282（39）：28960-70.

［10］葉艷清，李國平，蒲澤錦，等.腺苷通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2010，26（5）：596-601.

［10］Ye Y Q，LiG P，Pu Z J，etal.The research ofadenosine induced HepG2 cells apoptosis through endoplasmic reticulum stress pathway［J］.Chin Pharmacol Bull，2010，26（5）：596-601.

［11］Nakagawa T，Zhu H，Morishima N，et al.Caspase-12 mediates endoplasmic-reticulum-specific apoptosis and cytotoxicity by amyloid-beta［J］.Nature，2000，403（6765）：98-103.

［12］Jiang CC，Chen LH，Gillespie S，etal.Inhibition ofMEK sensitizes human melanoma cells to endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis［J］.Cancer Res，2007，67（20）：9750-61.