范瑩娟，張連茹，劉 洋，許建華

（1.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，2.福建省天然藥物藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350004；3.廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 廈門 361005）

Hsp90作為新型抗癌治療靶位受到人們關(guān)注，因Hsp90客戶蛋白在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控和凋亡路徑中起重要作用，即Hsp90通過其受體多環(huán)節(jié)、多途徑影響癌細(xì)胞生長(zhǎng)和（或）存活［1］。通過干擾Hsp90的功能可調(diào)控多種腫瘤信號(hào)通路或細(xì)胞代謝途徑，從而抑制腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移等過程達(dá)到抗癌效果［2］。Hsp90具有ATP酶的活性，對(duì)其伴侶功能的發(fā)揮起著重要的作用［1］。Hsp90構(gòu)象可發(fā)生改變，其ATP／ADP結(jié)合部位起著構(gòu)象轉(zhuǎn)換區(qū)的作用。因此，通過抑制Hsp90的ATPase活性，從而可以影響Hsp90的功能。

姜黃素是從中藥材姜黃中提取的酚類化合物，姜黃素因其具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎、降血脂等作用而毒性又很低受到重視，其直接抗癌活性尤為突出；姜黃素有著重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［3］。然而，姜黃素水溶性差，其水溶液易水解，不穩(wěn)定，體內(nèi)吸收差、代謝快且其代謝產(chǎn)物失去活性、消除快，生物利用度低。因此限制了其在臨床應(yīng)用方面的發(fā)展［4］。姜黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)是其發(fā)揮生物學(xué)作用的基礎(chǔ)，以姜黃素為先導(dǎo)物對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，合成大量姜黃素衍生物及其類似物，以全面研究姜黃素的構(gòu)效關(guān)系，并希望可以改善姜黃素的生物學(xué)活性，提高姜黃素生物利用度。本實(shí)驗(yàn)室通過化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾合成了姜黃素衍生物 C085［4-（4-羥基-3-甲氧基苯亞甲基）姜黃素］，化學(xué)結(jié)構(gòu)如Fig 1所示。

Fig 1 Structure of C085

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用熒光光譜法，研究C085與Hsp90及其不同片段的相互作用，并且檢測(cè)了C085對(duì)Hsp90 ATPase活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 由廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物藥物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 儀器與試劑 酶標(biāo)儀（Varioskan Flash，美國Thermo Scientific公司）；J2-21低溫高速離心機(jī)（J2-HSCentrifuge，美國Beckman公司）；電子分析天平（BN1385，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；全溫型多振幅軌道搖床（ZHWY-200H，上海智城分析儀器制造有限公司）；立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50KBS，上海申安醫(yī)療器械廠）；姜黃素衍生物C085由本實(shí)驗(yàn)室合成，經(jīng)HPLC及薄層層析分析鑒定，純度為95%以上。ATP（Sigma公司），二甲基亞砜（DMSO，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；硫酸卡那霉素，IPTG，鉬酸銨四水，孔雀石綠，聚乙烯醇，咪唑等試劑購于上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Hsp90的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 Hsp90融合蛋白全長(zhǎng)，NHsp90，MHsp90和CHsp90的誘導(dǎo)、表達(dá)及純化參見文獻(xiàn)［5-6］。

1.2.2 熒光滴定 反應(yīng)體系為5μmol·L-1Hsp90或其不同片段的PBS稀釋液2 ml，置于熒光分光光度計(jì)中，滴加的方式，增加體系中抑制劑的含量，充分混勻后，并置于293K、303K、310K的環(huán)境下，激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，記錄290～510 nm的熒光光譜。抑制劑的溶度變化為 0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50μmol·L-1；同時(shí)記錄△λ＝15 nm和△λ＝60 nm的同步熒光光譜，測(cè)定時(shí)熒光激發(fā)和發(fā)射狹縫均為 5 nm；重復(fù)測(cè)定 3次［7］。

1.2.3 Hsp90 ATPase活性抑制劑IC50確定 以已知的Hsp90抑制劑GA為陽性對(duì)照，2% （體積比）DMSO為陰性對(duì)照，空白對(duì)照為反應(yīng)體系不加Hsp90。反應(yīng)體系：不同濃度GA和C085溶于2%DMSO（體積比）中；Hsp90終濃度為 0.4μmol·L-1，ATP終濃度為 1 mmol·L-1，以上試劑均溶于Assay Buffer，反應(yīng)體系為100μl。37℃，反應(yīng)3 h，每組數(shù)據(jù)3次平行，加入80μl SolutionA［0.812 g·L-1的孔雀綠、23.2 g·L-1的聚乙烯醇、57.2 g·L-1的鉬酸銨（含6mol·L-1HCl）和超純水以體積比為2∶1∶1∶2比例混合］，震蕩反應(yīng)后用酶標(biāo)儀檢測(cè)620 nm處的吸光度（OD620）值［5］。根據(jù)吸光度值計(jì)算各抑制劑的IC50值。

其中OD620是3組平行實(shí)驗(yàn)測(cè)定的OD620平均值；由軟件計(jì)算出各抑制劑的IC50。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism軟件和Origin8.5軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，結(jié)果采用表示。

2 結(jié)果

2．1 C085與Hsp90的相互作用

2.1.1 C085對(duì)Hsp90內(nèi)源熒光的淬滅作用 采用熒光光譜法分析C085對(duì)Hsp90內(nèi)源熒光的淬滅作用，Hsp90的最大熒光發(fā)射峰在337 nm。隨著C085的加入，Hsp90的內(nèi)源性熒光強(qiáng)度發(fā)生有規(guī)律的減弱，意味著二者間可能發(fā)生相互作用。Hsp90的濃度為5μmol·L-1，Hsp90與藥物的濃度比例從1∶1變化到1∶10。結(jié)果如Fig 2所示。

Fig 2 Quenching effect of C085 on Hsp90 endogenous fluorescent

假設(shè)Hsp90與C085以1∶1（摩爾比）的方式結(jié)合，則Hsp90熒光峰所在位置（337 nm）處熒光強(qiáng)度的改變值ΔF與游離的C085濃度［Q］有如下關(guān)系：ΔF＝F0-F＝△Fmax［Q］／KD+［Q］；式中△Fmax為理想狀態(tài)下，Hsp90被C085飽和后在337 nm處的熒光強(qiáng)度最大改變值，F(xiàn)0和F分別是不存在和存在C085時(shí)Hsp90溶液的熒光強(qiáng)度，［Q］是體系中C085的總濃度代替游離濃度，KD為解離常數(shù)。由Origin8.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性擬合，結(jié)果如Fig 3。相關(guān)參數(shù)見Tab 1。

結(jié)果可知，C085與Hsp90間具有較強(qiáng)的相互作用。

Fig 3 337nm，the change trend of Hsp90 fluorescence intensity w ith C085 concentration

Tab 1 Dissociation constant K D value of C085

2.1.2 C085對(duì)Hsp90的淬滅常數(shù) 熒光淬滅通常分為動(dòng)態(tài)淬滅和靜態(tài)淬滅，可以運(yùn)用Stern-Volmer方程：F0／F＝1+KSV［Q］進(jìn)行判斷，式中 F0，F(xiàn)，［Q］如“2.1.1”表述，KSV是 Stern-Volmer淬滅常數(shù)，由下式定義：Ksv＝Kq·τ0，Kq是雙分子淬滅過程速率常數(shù)。τ0是生物大分子內(nèi)源性熒光壽命值，為10-8s。由Origin8.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合結(jié)果如Fig 4，相關(guān)參數(shù)見Tab 2。

Fig 4 Stern-Volmer plot for binding of C085 w ith Hsp90

各類淬滅劑對(duì)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù) Kq為 2.0×1010L·mol-1·s-1，而 C085對(duì)Hsp90的Kq數(shù)量級(jí)在1013，說明C085對(duì) Hsp90的猝滅過程是由于形成復(fù)合物引起的靜態(tài)猝滅。

Tab 2 Stern-Volmer quenching constant KSV value and bimolecular quenching constant K q value of C085

2.1.3 C085與Hsp90結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù) 靜態(tài)淬滅過程符合Lineweaver-Burk雙倒數(shù)方程：lg F0-F／F＝lg KA+n lg［Q］，式中 F0，F(xiàn)，［Q］如“2.1.1”表述，KA是結(jié)合常數(shù)，n是結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。數(shù)據(jù)用Origin8.5軟件進(jìn)行分析。結(jié)果如Fig 5，相關(guān)參數(shù)見Tab 3。

由C085與Hsp90的結(jié)合常數(shù)KA和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n，可知C085與Hsp90之間具有較強(qiáng)的結(jié)合作用。

Fig 5 Lineweaver-Burk plot for binding of C085 with Hsp90

Tab 3 Binding constant K A value andbinding numbers n value of C085

2.1.4 C085與Hsp90作用力類型的確定 藥物小分子與蛋白質(zhì)等生物大分子之間的相互作用力包括氫鍵、范德華力、靜電作用力、疏水作用力等。藥物不同，與蛋白質(zhì)作用力類型也不同，主要作用力可以通過體系的焓變與熵變來判斷。當(dāng)溫度變化不大時(shí)，反應(yīng)的焓變與可以看作一個(gè)常數(shù)，有公式：ln KD1／KD2＝ΔHθ（1／T1-1／T2）／R；其中 R是熱力學(xué)氣體常數(shù)，取值為8.314 J·是熱力學(xué)溫度；KD是不同溫度下對(duì)應(yīng)的解離常數(shù)；ΔGθ是吉布斯自由能。根據(jù)兩個(gè)溫度下的熱力學(xué)常數(shù)值可以計(jì)算出C085與Hsp90相互作用的熱力學(xué)函數(shù)值，結(jié)果見Fig 6，相關(guān)參數(shù)見Tab 4。

根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)焓變?chǔ)θ和熵變 ΔSθ的相對(duì)大小，可以判斷藥物與蛋白質(zhì)之間的主要作用力的類型［8］。據(jù) Ross等提出的理論，當(dāng) ΔHθ＜0，ΔSθ＞0時(shí)生物大分子與生物小分子的結(jié)合性質(zhì)表現(xiàn)為靜電作用力，由結(jié)果可知，該體系中C085與Hsp90之間的主要作用力是靜電作用力。為了進(jìn)一步確定兩者的作用力類型，運(yùn)用同步熒光法研究C085對(duì)Hsp90構(gòu)象的影響。

2.1.5 C085對(duì)Hsp90構(gòu)象的影響 蛋白質(zhì)的熒光主要來自酪氨酸、色氨酸殘基，因此常用于同步熒光的研究。當(dāng)Δλ＝15 nm時(shí)，表現(xiàn)的是Hsp90中酪氨酸殘基的同步熒光的光譜特性；當(dāng)Δλ＝60 nm時(shí)，表現(xiàn)的是Hsp90中色氨酸殘基的同步熒光的光譜特性。結(jié)果如Fig 7。

Tab 4 Dissociation constant KD values and thermodynam ic parameters of C085 at different tem peratures

Fig 6 293K，303K，310K，quenching effect of C085 on Hsp90 endogenous fluorescent

蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基和色氨酸殘基的最大發(fā)射波長(zhǎng)與其所處環(huán)境的極性有關(guān)，因此，根據(jù)最大發(fā)射波長(zhǎng)的改變可以判斷蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。由圖可知，隨著C085的加入，Hsp90中酪氨酸殘基、色氨酸殘基的同步熒光最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)基本不變，說明酪氨酸殘基和色氨酸殘基周圍微環(huán)境沒有發(fā)生明顯改變，且未明顯降低其所處的微環(huán)境疏水性，沒有明顯改變肽鏈伸展程度。這表明隨著C085濃度的增加并沒有使Hsp90中的酪氨酸、色氨酸殘基的構(gòu)象發(fā)生變化。這也就進(jìn)一步確定了C085與Hsp90之間的主要作用力為靜電作用力。

2.1.6 C085與Hsp90蛋白不同片段的相互作用為確定C085與Hsp90的結(jié)合區(qū)域，通過熒光滴定實(shí)驗(yàn)分析 C085與3個(gè)功能域（NHsp90、MHsp90、CHsp90）的結(jié)合情況，通過Origin8.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，結(jié)果如Fig 8，相關(guān)參數(shù)見Tab 5。

Tab 5 Dissociation constant K D values of C085

結(jié)果表明，相同實(shí)驗(yàn)條件下，C085與Hsp90的C端片段結(jié)合能力最強(qiáng)。

Fig 7 Synchronous fluorescence spectra of C085 with Hsp90

Fig 8 Quenching effect of C085 on NHsp90，MHsp90，CHsp90 endogenous fluorescent

2．2 Hsp90 ATPase活性抑制劑C085的IC50孔雀綠·磷鉬酸銨無機(jī)磷檢測(cè)法檢測(cè)C085對(duì)Hsp90作用的量效關(guān)系，IC50值為6.04μmol·L-1，如 Fig 9所示。

Fig 9 Inhibitory rate of Hsp90 ATPase activity under different concentrations of C085

3 討論

熒光淬滅指導(dǎo)致特定熒光物質(zhì)分子的熒光強(qiáng)度降低和壽命減少的現(xiàn)象。在能量轉(zhuǎn)移、配合物形成等過程中會(huì)發(fā)生熒光猝滅。因此，利用熒光光譜分析法可以求取解離常數(shù)，判定小分子有機(jī)化合物與蛋白質(zhì)底物的親和力大小，并可以進(jìn)一步研究二者相互作用的機(jī)制。我們的研究結(jié)果表明，C085與Hsp90存在相互作用，分析其與Hsp90相互作用的機(jī)制；熱力學(xué)常數(shù)和同步熒光表明，穩(wěn)定 C085-Hsp90靜態(tài)復(fù)合物的主要作用力為靜電作用力。為進(jìn)一步了解其在細(xì)胞內(nèi)的作用機(jī)制以及藥物開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

Hsp90單體分成3個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域：N-末端結(jié)構(gòu)、中間域（M）、C-末端結(jié)構(gòu)。N端是 ATP／ADP的結(jié)合位點(diǎn)；M端主要是與客戶蛋白或輔分子伴侶等底物多肽相結(jié)合，并且Hsp90 ATPase活性的產(chǎn)生依賴于與中間區(qū)域的接觸；C端是Hsp90自身二聚化位點(diǎn)，鈣調(diào)蛋白結(jié)合位點(diǎn)和靶蛋白結(jié)合位點(diǎn)［9］。運(yùn)用熒光滴定的方法，研究C085與Hsp90、N-Hsp90，M-Hsp90和C-Hsp90之間的結(jié)合作用，通過解離常數(shù)，我們推斷C085為Hsp90抑制劑且與C端片段結(jié)合能力更強(qiáng)。

Hsp90具有分子伴侶的功能，該功能的發(fā)揮受Hsp90與輔伴侶相互作用和Hsp90與ATP結(jié)合／水解所調(diào)節(jié)［10-12］。Hsp90的N端和C端都能與輔伴侶或ATP相互作用，從而調(diào)節(jié)其伴侶的功能［13-14］。在Hsp90的分子伴侶循環(huán)中，Hsp90通過結(jié)合和水解ATP而調(diào)節(jié)自身構(gòu)象和功能。C085抑制Hsp90-ATPase活性，抑制其對(duì)ATP的水解作用。

Hsp90作為抗癌藥物的分子靶點(diǎn)越來越受到人們的關(guān)注。大量的研究表明，抗癌藥可以以Hsp90的多個(gè)位點(diǎn)作為進(jìn)攻的靶點(diǎn)，而且對(duì)Hsp90功能的抑制的形式也可以是多樣的。因此，以Hp90為靶點(diǎn)，尋找高效低毒的抗腫瘤藥物，為腫瘤的治療帶來新的思路。對(duì)于Hsp90抑制劑干擾復(fù)雜的癌癥過程機(jī)制的研究，已經(jīng)成為癌癥靶向性治療的希望。我們的研究結(jié)果表明，C085可能是Hsp90抑制劑候選藥物，與Hsp90之間具有較強(qiáng)的親和力，抑制Hsp90-ATPase活性，從而抑制Hsp90的功能，達(dá)到抗腫瘤的作用。

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