黃小紅，馬旭東，黃軼群，許云祿

（1.福建醫(yī)科大學附屬漳州市醫(yī)院藥學部，福建漳州 363000；2.福建醫(yī)科大學藥學院，福建福州 350004）

組蛋白甲基化是由特異的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶及去甲基化酶協(xié)同催化完成，是一個可逆的動態(tài)修飾過程。G9a是常染色質(zhì)主要的 H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶［1］。G9a基因被破壞后常染色質(zhì)區(qū)的H3K9甲基化水平明顯降低［2］，而H3K9甲基化在異染色質(zhì)形成、基因印記、X染色體失活和轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用［3］，近年來研究發(fā)現(xiàn)，G9a的異常表達所致的H3K9甲基化失平衡在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用［4］。

BIX-01294是一種人工合成的選擇性G9a抑制劑，研究表明BIX-01294抑制G9a活性，使組蛋白H3K9二甲基化水平降低，染色質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，抑癌基因的重新表達，誘導腫瘤細胞凋亡及周期阻滯［5］。本研究以急性T淋巴細胞性白血病Molt-4細胞株為模型，研究BIX-01294誘導急性淋巴細胞白血病凋亡及抑制增殖的作用及其機制，為急性淋巴細胞性白血病的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 BIX-01294購自美國Gene公司，以DMSO溶解配制10 mmol·L-1，0.22μm微孔濾膜正壓過濾后-20℃保存。

1.2 材料 胎牛血清購自杭州四季青生物制品公司，Annexin V／PI雙染試劑盒購自美國 BD公司；MTT（濃度為5 g·L-1）及DMSO均購自美國Sigma公司；Bcl-2、Caspase-3、Bax、組 蛋 白 H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3、H3K27me1、H3K27me2、Act-H3、P15、DNMT1、β-actin鼠抗人單克隆抗體購自美國Upstate公司；Goat anti-mouse with HRP conjugate二抗及Western blot化學發(fā)光工作液均購自美國Santa Cruz公司。

1.3 細胞系、細胞培養(yǎng) 人類急性T淋巴細胞性白血病Molt-4細胞株，購自中科院上海細胞庫，用含15%胎牛血清、2 mmol·L-1左旋谷氨酰胺的 RPMI 1640培養(yǎng)液置 37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細胞呈懸浮生長，每2～3 d傳代1次，實驗前經(jīng)臺盼藍拒染法檢測細胞活力。

1.4 繪制生長曲線 取對數(shù)生長期細胞，將其濃度調(diào)整為1.0×108·L-1，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100μl，實驗組分別加入BIX-01294，使終濃度為0、1、2、4、8μmol·L-1，每組設 6個平行孔，37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48、72 h后，加5 g·L-1MTT（Sigma）10μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，離心后小心吸去上清，每孔加100μl DMSO（Sigma），充分震蕩混勻，在酶標儀上用雙波長492 nm和630 nm測吸光度（A值），以0μmol·L-1為對照計算細胞增殖率。細胞增殖率／%＝（A實驗-A空白）／（A對照-A空白）×100%，試驗重復3次。

1.5 流式細胞儀分析細胞凋亡 用含15%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基接種于75 ml培養(yǎng)瓶，每瓶接種2×106細胞，細胞濃度為2×108·L-1，經(jīng)不同濃度的BIX-01294處理24 h后，室溫離心（1 000 r·min-1×5 min）收集細胞。按照BD公司Annexin V和PI雙染試劑盒說明書處理后，立即行流式細胞術檢測。

1．6 W estern blot檢測細胞凋亡、組蛋白調(diào)控相關蛋白 收集經(jīng)藥物處理后的細胞，TBS洗滌后，吸干洗滌液，按1×106細胞／100μl裂解液+1μl酶抑制劑的比例裂解細胞；低溫（4℃）1 200 r·min-1離心10 min，吸取中間清亮層，Bradford法進行蛋白定量。取備用蛋白，以12%SDSPAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)膜，室溫下?lián)u床封閉1 h；加入用TBS（根據(jù)目的蛋白調(diào)整稀釋倍數(shù)）稀釋的一抗，Bcl-2、pro-Caspase-3、Bax、P15、DNMT稀釋倍數(shù)為1∶400；組蛋白 甲 基 化 H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3、H3K27me1、H3K27me2、Act-H3稀釋 倍數(shù) 均 為1∶1 000；4℃孵育過夜，TBS洗滌液洗膜后分別加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000），室溫下孵育1 h；TBS洗膜后加入化學發(fā)光工作液，在X射線膠片 （KODAK）上曝光，以 β-αctin為內(nèi)參，用AlphaDigiDoc圖像分析軟件進行分析比較。

1.7 統(tǒng)計學分析 采用 SPSS 17.0統(tǒng)計處理軟件分析。常規(guī)進行方差齊性檢驗，正態(tài)性檢驗。計量資料實驗數(shù)據(jù)以表示。單變量兩組資料之間的比較采用t檢驗，多組資料之間的比較采用單因素方差分析；方差不齊采用非參數(shù)檢驗。

2 結(jié)果

2．1 BIX-01294抑制急性T淋巴細胞白血病M olt-4細胞增殖 1、2、4、8μmol·L-1BIX-01294處理 24 h后，Molt-4細胞的增殖率分別為（86.06±4.35）%、（65.43±4.21）%、（46.23±3.17）%、（12.56±1.34）%，隨藥物濃度的增加增殖率下降，與對照組比較（99.15±3.23）%有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。經(jīng) 4μmol·L-1BIX-01294作用 0、24、48、72 h后，Molt-4細胞的增殖率分別為（99.06±2.83）%、（46.23±3.17）%、（40.45±3.24）%、（21.06±2.54）%，即隨藥物作用時間的延長增殖率也逐漸下降，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義（見Fig 1）。

2．2 BIX-01294誘導急性T淋巴細胞白血病M olt-4細胞凋亡 0、1、2、4μmol·L-1BIX-01294作用Molt-4細胞24h后，凋亡率分別為（5.54±1.35）%、（10.24±2.26）%、（32.28±3.26）%、（47.52±4.37）%，隨藥物濃度的增加，凋亡率逐漸上升，F(xiàn)＝23.74，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義（Fig 2）。

Fig 1 Proliferation inhibition rates of M olt-4 cells treated w ith various concentrations of BIX-01294*P＜0.05 vs0μmol·L-1

Fig 2 Apoptosis rates of Molt-4 cells treated with various concentrations of BIX-01294

2．3 BIX-01294對Molt-4細胞凋亡相關蛋白的影響

上述不同濃度BIX-01294處理Molt-4細胞24h后，提取總蛋白經(jīng)過Western blot檢測和Alpha Digi Doc圖像分析軟件進行分析比較，凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達下調(diào)，促凋亡蛋白Bax及凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的表達上調(diào)，各組條帶灰度值與β-actin比值與對照組比較，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義（Fig 3）。

2．4 BIX-01294對Molt-4細胞P15、DNMT1表達的影響 BIX-01294處理Molt-4細胞24 h后，P15蛋白呈濃度依賴性表達上調(diào)，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。進一步研究發(fā)現(xiàn)DNMT1表達呈濃度依賴性逐漸減弱，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義（Fig 4）。

Fig 3 Apoptosis-related proteins in M olt-4 cells treated w ith BIX-01294 for 24 hourA：Protein electrophoresis；B：Proteins relative density.*P＜0.05 vs0μmol·L-1.

Fig 4 P15，DMNT1 protein in Molt-4 cells treated with BIX-01294 for 24 hourA：Protein electrophoresis；B：Proteins relative density.*P＜0.05 vs0μmol·L-1.

2．5 BIX-01294可調(diào)控組蛋白甲基化、乙酰化 不同濃度BIX-01294處理Molt-4細胞24h后組蛋白H3K9me1、H3K9me2、H3K27me1、H3K27me2水平表達均下降，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義；而H3K9三甲基化及組蛋白H3乙酰化水平無明顯變化，P＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義（Fig 5）。

Fig 5 Histone-related proteins in Molt-4 cells treated w ith BIX-01294 for 24 hourA：Protein electrophoresis；B：Proteins relative density.*P＜0.05 vs0μmol·L-1.

3 討論

G9a是常染色質(zhì)主要的H3K9甲基轉(zhuǎn)移酶，在常染色質(zhì)區(qū)催化H3K9的單甲基化和二甲基化，體外實驗中 G9a還可以甲基化 H3K27［6］。Kondo等［7］發(fā)現(xiàn)肝癌病人中抑癌基因p16的沉默與DNA甲基化和H3K9甲基化狀態(tài)失常有關，與此相對應，G9a在腫瘤組織中的表達水平也遠遠高于鄰近的非腫瘤組織。G9a敲除可以明顯抑制前列腺癌細胞PC3的生長，并造成其端粒酶活性下降，端粒縮短。也有研究證實G9a敲低抑制了細胞的遷移和侵襲，相反，G9a的異位表達可以促進低侵襲性肺癌細胞株的進展和遷移［8］，RNAi技術敲除G9a基因后，可明顯抑制EVI1陽性的白血細胞克隆增殖，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶位點有望成為治療的靶標［9］。

BIX-01294是一種人工合成的選擇性G9a抑制劑，其抑制G9a活性使組蛋白H3K9甲基化水平降低，染色質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，抑癌基因的重新表達，誘導腫瘤細胞凋亡及周期阻滯［10］。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過不同濃度BIX-01294作用后，Molt-4細胞的增殖率下降，有明顯的濃度及時間依賴性，P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。進一步研究發(fā)現(xiàn)BIX-01294可抑制DNMT1，抑癌蛋白P15重新表達。Dong等［11］研究發(fā)現(xiàn)，G9a可以通過它的錨定重復序列ANK招募DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，促進或維持目的DNA的甲基化狀態(tài)，G9a缺陷的胚胎干細胞DNA甲基化水平明顯下降。研究也證實在染色質(zhì)復制時，DNMT1、G9a與增殖細胞核抗原PCNA形成三元復合體，DNMT1敲減降低DNA甲基化水平、G9a和H3K9me2的富集量也隨之下降［12］。有研究證實抑制H3K9甲基化轉(zhuǎn)移酶活性后，p15基因啟動子區(qū)組蛋白H3K9甲基化水平降低，p15基因可重新表達［13］，這可能與BIX-01294導致腫瘤細胞周期阻滯有關。本研究發(fā)現(xiàn)BIX-01294可誘導Molt-4細胞凋亡，且隨藥物濃度的增加凋亡率增加，呈明顯濃度依賴性，研究還發(fā)現(xiàn)其誘導凋亡是通過對凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達下調(diào)，促凋亡蛋白Bax及凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3表達增高發(fā)揮作用的。

本研究顯示，BIX-01294可下調(diào) Molt-4細胞H3K9me1、H3K9me2、H3K27me1、H3K27me2的甲基化水平，H3K9me3水平變化不明顯。在體內(nèi)H3K9可被一甲基化、二甲基化、三甲基化，BIX-01294可選擇性抑制G9a，體外試驗G9a主要使H3K9一甲基化、二甲基化，長時間孵育才有少量的三甲基化［14］。單、雙和三甲基形式的H3K9為觸發(fā)修飾核小體轉(zhuǎn)移到核膜提供了信號。單甲基和雙甲基核小體并沒有轉(zhuǎn)錄沉默，但卻是三甲基化標記物的必要條件，三甲基化標記物隨后關閉了表達，將結(jié)合物密封在核邊緣［15］?；蚓幋a區(qū) H3K9me3與HP1結(jié)合與基因轉(zhuǎn)錄激活有關。G9a以及它的同源蛋白GLP能夠在體外催化核小體上H3K27的單甲基化和雙甲基化反應是近年來研究的成果，研究發(fā)現(xiàn)G9a缺失的ES細胞系中，H3第27位賴氨酸的單甲基化水平明顯降低，PRC2（polycomb repreesive complex）在其中起重要作用［16］。本研究結(jié)果 BIX-01294未改變H3K9me3組蛋白甲基化，可能是由于體外實驗或作用的時間不夠所致。而組蛋白乙?；话l(fā)生改變，說明G9a是高選擇性的。

本研究證實BIX-01294處理后在Molt-4細胞同時出現(xiàn)DMNT1抑制，沉默的P15蛋白重新表達，H3K9me1、H3K9me2、H3K27me1、H3K27me2甲基化水平明顯降低，也說明了G9a除了是組蛋白H3K9甲基化轉(zhuǎn)移酶外，對H3K27及DNA也有較強的去甲基化作用。BIX-01294可能是潛在的抗白血病藥物。

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