叢恬鈔，張銘慧，何海燕，尹永強，吳 紅，康 毅，婁建石

（天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學教研室，天津 300070）

心律失常（cardiac arrhythmia）是心血管系統(tǒng)疾病中最為常見也最為嚴重的病癥之一。據(jù)統(tǒng)計，中國每年約60萬人死于心源性猝死，其中90%以上由室性心動過速、心室或心房顫動所致［1］。美國每年約39萬人死于惡性心律失常［2］。心律失常不但會加重既有的心臟疾病，還可誘發(fā)心源性猝死，嚴重威脅人類健康。隨著研究的深入，越來越多的心律失常被證實與心臟離子通道異常有關［3］，而在心肌細胞離子通道中，鈉通道作為Ⅰ類抗心律失常藥物的作用靶點，可影響動作電位形態(tài)，與早期后除極密切相關，其異常將會導致心律失常的發(fā)生［4］。盡管我們對于心肌鈉通道的臨床、基因以及生理特征進行了廣泛的探索，但經(jīng)典的非選擇性鈉通道阻滯劑在臨床上應用有限，以鈉通道為靶點的治療手段一直進展緩慢［5］。因此，揭示心律失常發(fā)生的深層機制，探索安全有效的治療藥物是該領域的重點與難點。

?；撬徭V配合物（taurine-magnesium coordination compound，TMCC）是本研究室合成的配合物，既往的實驗研究證實，其對多種因素誘發(fā)的實驗性心律失常與觸發(fā)活動有確切的防治效果［9］。細胞水平上的研究［10-15］亦證明，該配合物對正常狀態(tài)下與藥物誘發(fā)的異常鈉、鉀、鈣電流均有作用，提示該配合物或具有廣泛的抗心律失常作用，但其作用機制尚有待進一步闡明。本實驗通過建立細胞水平上缺氧／復氧致心律失常模型，觀察TMCC對鈉離子通道電流的作用，旨在進一步探索其抗心律失常的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康成年Wistar大鼠，♂，體質(zhì)量220～250 g，合格證號：SCXK（軍）2007-0001。

1.1.2 藥品與試劑 HEPES、EGTA、Mg-ATP、Na2ATP、膠原酶Ⅱ等購自Sigma公司。TMCC由天津醫(yī)科大學化學教研室合成。

1.1.3 儀器 膜片鉗儀，MultiClamp 700B，USA；數(shù)-模轉換器，DigiData1440A，USA；倒置顯微鏡，IX51，Japan；三維操縱儀，MP-225，USA；微電極拉制儀，P-97，USA；恒流泵，Peri-Star，臺灣；酸度計，PHS-3C，上海精密科學儀器有限公司；Millipore純水系統(tǒng)，USA。

1.1.4 液體的制備 無鈣臺氏液（mmol·L-1）：NaCl 136，KCl 5.4，MgCl21.0，NaH2PO40.33，HEPES 10，Glucose 10，用 NaOH調(diào) pH至7.4。細胞保存液（KB液，mmol·L-1）：L-谷氨酸 70，?；撬?15，KCl 30，KH2PO410，MgCl20.5，HEPES 10，EGTA 0.5，Glucose 10，用KOH調(diào)pH至7.4。記錄鈉通道電流（INa）的正常細胞外液（mmol·L-1）：氯化膽堿 120，NaCl 25，CsOH 4，CaCl20.1，CoCl22，MgCl21，HEPES 10，Glucose 10，用 CsOH調(diào) pH至7.35。記錄鈉通道電流的電極內(nèi)液（mmol·L-1）：CsOH 140，NaCl10，EGTA 5，HEPES 5，Na2ATP 5，用CsOH調(diào)pH至7.3。以上液體使用前通以純氧20 min。記錄鈉通道電流的模擬缺氧細胞外液（mmol·L-1）：去除 Glucose，其他成分同正常外液，用CsOH結合鹽酸調(diào)pH至6.8，并通以100%氮氣20 min以上。

1.2 方法

1.2.1 單個大鼠心肌細胞的分離 用25%烏拉坦將大鼠麻醉，仰臥位固定于鼠臺上，迅速剪開胸腔暴露心臟，從主動脈根部離斷取出心臟，放入4℃無鈣臺氏液中，去除脂肪及結締組織。將主動脈逆行插管連接于Langendorff灌流裝置上（恒溫37℃），以無鈣臺氏液8 ml·min-1連續(xù)灌流5 min，洗去心臟殘血后，改用50 m l含10 mg膠原酶Ⅱ與15 mg牛血清白蛋白的無鈣臺氏液進行循環(huán)灌流。隨著灌流的進行，流出液體逐漸變得粘稠，心肌的顏色逐漸變淺、透明，心臟體積逐漸膨大、松軟。此時將心臟自左心室分段剪去心肌組織，置于裝有KB液的試管中，用吸管輕輕吹打使之分散成單個細胞，分裝，置于4℃冰箱中穩(wěn)定2 h待用。

1.2.2 鈉通道電流INa的記錄 應用全細胞膜片鉗技術記錄單細胞離子電流。所用微電極用兩步拉制儀拉制而成，微電極充電極液后，電阻在2～4 MΩ之間。電流信號經(jīng)MultiClamp 700B膜片鉗放大器、DigiData1440A數(shù)-模轉換器及Pclamp10.1采集、儲存及分析。將細胞懸液置于倒置顯微鏡工作平臺容積為1 ml的浴槽中，待細胞貼壁后，用鈉外液進行灌流，流速1 ml·min-1。選用大小相近、紋理清晰的桿狀細胞進行實驗。待高阻封接后，進行電極電容補償。負壓或高壓脈沖破膜，進行膜電容、串聯(lián)電阻及漏電流補償，平衡5 min，待電極內(nèi)鈉內(nèi)液與細胞內(nèi)液充分交換后，進行膜電流記錄。膜電流的大小以電流密度及單位膜電容的膜電流表示。

1.2.3 實驗分組與造模 實驗分為正常對照組、缺氧／復氧模型組（H／R組）、H／R+100μmol·L-1TMCC組、H／R+200μmol·L-1TMCC組、H／R+400μmol·L-1TMCC組、H／R+24.24μmol·L-1胺碘酮組。將分離的細胞置于浴槽中，待貼壁后，先用記錄鈉電流（INa）的細胞外液進行灌流，封接形成全細胞記錄模式后，平衡5 min，待電極內(nèi)液與細胞內(nèi)液充分交換后，進行膜電流記錄，定義為正常細胞INa。然后用缺氧外液沖洗替換浴槽中的正常外液，15 min后再以正常有氧外液沖洗替換缺氧外液，5 min后記錄為缺氧／復氧組INa。H／R+TMCC組及H／R+胺碘酮組則分別在有氧外液中加入不同濃度的TMCC或胺碘酮進行記錄。形成全細胞構型后，在電壓鉗模式下記錄電流。將鉗制電位固定于-120 mV，指令電壓從-120 mV以10 mV為步階逐步躍至+30 mV，脈沖持續(xù)時間100 ms，可記錄到大鼠心室肌細胞的INa電流。細胞外液中加入2 mmol·L-1的CoCl2以阻斷鈣電流，細胞內(nèi)液中用Cs+代替K+，以去除鉀電流的影響。

1.2.4 穩(wěn)態(tài)激活曲線 以不同電壓水平的INa峰值與相應的膜電位作圖，繪制INa電流I-V曲線，將I-V曲線的結果轉化為膜電導（G），對條件刺激電壓作圖，然后采用 Boltzman方程 G／Gmax＝1／｛1+exp［（V-V1／2）／K］｝進行擬合，得到 INa穩(wěn)態(tài)激活曲線。式中Gmax為最大膜電導，V1／2為半數(shù)激活電壓，K為斜率參數(shù)。

1.2.5 穩(wěn)態(tài)失活曲線 采用雙脈沖刺激法測定穩(wěn)態(tài)失活曲線。保持電位-80 mV施予50 ms，步階10 mV，-150 mV～+30 mV系列條件脈沖刺激，每一條件脈沖后緊跟一固定去極化至-30 mV，25 ms的測試脈沖。以電流的相對值（I／Imax）對條件脈沖電壓作圖，得出INa的失活曲線。用Boltzman方程I／Imax＝1／｛1+exp［（V-V1／2）／K］｝進行擬合，得出半數(shù)失活電壓V1／2和失活曲線斜率K，式中I和Imax分別為不同測試脈沖電壓下電流大小和最大電流。

1.2.6 統(tǒng)計學分析 在Clampfit10.0軟件中將記錄的原始數(shù)據(jù)進行處理分析，結果以表示。運用SPSS 17.0軟件進行單因素方差分析，組間差異用LSD檢驗。

2 結果

2．1 TMCC，胺碘酮對大鼠心肌細胞缺氧／復氧損傷模型INa峰值的影響 形成全細胞構型后，在電壓鉗模式下記錄電流（Fig 2a-2f）。缺氧／復氧、各濃度TMCC及胺碘酮作用后，鈉電流峰值的變化見Fig 1。以去極化的電位為橫坐標，相應的最大電流密度為縱坐標繪制鈉電流的I-V曲線（Fig 2g）。結果表明，缺氧／復氧使 INa峰值從（56.89±2.07）pA／pF減小至（35.05±1.52）pA／pF（n＝6，P＜0.01），I-V曲線上移，模型制備成功。200、400μmol·L-1TMCC可使 INa峰值部分恢復（n＝6，P＜0.01），I-V曲線下移，INa電流恢復，其作用呈濃度依賴性，且強于24.24μmol·L-1胺碘酮。

Fig 1 Effects of TMCC and am iodarone on peak I Na in rat ventricular m yocytes subjected to hypoxia／reoxygenation**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs H／R group.

2．2 TMCC，胺碘酮對大鼠心肌細胞缺氧／復氧損傷模型INa穩(wěn)態(tài)激活曲線的影響 與正常對照組相比，缺氧／復氧使半數(shù)激活電壓 V1／2減?。‵ig 3a，n＝6，P＜0.05），激活曲線（Fig 3c）右移，激活減慢。各濃度TMCC組及胺碘酮組與模型組相比，V1／2和激活曲線斜率K值差異均無顯著性，給藥組間差異也無顯著性。

2．3 TMCC，胺碘酮對大鼠心肌細胞缺氧／復氧損傷模型INa穩(wěn)態(tài)失活曲線的影響 與正常組相比，缺氧／復氧模型組使半數(shù)失活電壓 V1／2增大（Fig 3b，n＝6，P＜0.05），失活曲線（Fig 3d）左移，失活加快。200、400μmol·L-1TMCC和 24.24μmol·L-1胺碘酮可使增大的半數(shù)失活電位降低（Fig 3b），對抗缺氧／復氧所致的失活提前，使左移的曲線部分恢復。

3 討論

鈉通道在生理學的發(fā)展史中占據(jù)著特殊重要的地位。1952年，Hodgkin和Huxley在烏賊神經(jīng)軸突闡明了鈉通道的基本特性，由此引發(fā)現(xiàn)代離子通道病理論［16］。在心肌細胞中，鈉通道主要存在于細胞膜上，是心肌細胞興奮時第一個被激活的離子通道，是快速反應的基礎，也是其他通道開放或離子流動的前提。在哺乳動物心肌細胞中，鈉通道的密度最大，大密度鈉通道的存在對動作電位的快速去激化（即0相）有重要意義，保證了心肌細胞的正常電活動。心肌細胞的鈉通道由核心α亞基與輔助性β1、β2亞基共同構成。Nav1.5是形成電壓門控的心肌鈉通道α亞基孔隙的膜內(nèi)在蛋白，是人類心臟主要的鈉離子通道類型，由SCN5A基因編碼。鈉通道數(shù)量上的減少、SCN5A基因的突變引起的分子結構異常及失活不完全與多種心律失常疾病相關，包括長QT綜合征、Brugada綜合征、病竇綜合征以及進行性心臟傳導阻礙和心房阻滯［16］?？梢?，對鈉離子通道研究的意義重大。目前，已有學者將SCN5A導入HEK細胞（人胚胎腎細胞），得到純Nav1.5離子流（INa）的各項參數(shù)［18］，而隨著研究的深入，Nav1.5的結構與功能也越來越清晰［19］，以便更深層次的探索。

缺血／再灌注損傷可以刺激心室結構與功能重塑，引起心肌細胞各種離子通道和離子交換體的激活，導致心肌細胞離子和能量失衡［21］，從而影響正常心肌細胞的功能。本實驗采用缺氧液和復氧液灌注，制備缺氧／復氧模型，旨在模擬缺血／再灌注這一過程。實驗選用缺氧15 min后復氧，結果顯示缺氧時鈉電流減少，復氧后鈉電流進一步降低。有研究表明［22-25］，隨著模擬缺氧液灌流時間延長（灌流10 min與20 min），INa減少，通道激活和失活時間延長，隨再灌注激活時間恢復較快，但INa失活時間并不立即恢復。這與本實驗研究結果一致。

Fig 2 Effects of TMCC and am iodarone on I Na in rat ventricular m yocytes subjected to hypoxia／reoxygenationa：Control；b：H／R；c：H／R+100μmol·L-1；d：H／R+200μmol·L-1；e：H／R+400μmol·L-1；f：H／R+24.24μmol·L-1 Amiodarone；g：I-V curve.

Fig 3 Effects of TMCC（100，200，400μmol·L-1），am iodarone（24．24μmol·L-1）on I Na steady-state activation and inactivation in rat ventricular m yocardiocytes subjected to hypoxia／reoxygenationA：V1／2 and K act of steady-state activation；B：V1／2 and K inact of steady-state inactivation；C：steady-state activation curve；D：steady-state inactivation curve.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs H／R group.

本實驗結果表明，缺氧／復氧使INa峰值減小，IV曲線上移，TMCC（200、400μmol·L-1）能濃度依賴性地恢復由缺氧／復氧損傷引起的INa減小，使I-V曲線下移，且無平行移動，基本不改變曲線形狀，仍保持原有的電壓依賴性關系，提示TMCC在不同膜電位水平對INa的作用是一致的。INa的動力學研究結果顯示，缺氧／復氧使激活曲線右移，激活減慢；使失活曲線左移，失活加快。TMCC（200、400μmol·L-1）和胺碘酮（24.24μmol·L-1）對激活的影響差異無顯著性，但可恢復左移的失活曲線，使鈉通道的穩(wěn)態(tài)失活過程減慢。由此可推斷，TMCC對抗缺氧／復氧鈉抑制的作用或與減慢失活有關。此前有研究發(fā)現(xiàn)TMCC對正常細胞的鈉通道有阻滯作用［10］，然而在缺氧／復氧模型中，TMCC并未加劇損傷對鈉通道的抑制，反而在一定程度上恢復了鈉電流，提示TMCC對鈉通道的作用可能與鈉通道的狀態(tài)有關，即在鈉通道正常開放時呈抑制作用，而鈉通道過度抑制時則表現(xiàn)為興奮作用，使失衡的鈉通道恢復或接近原有的平衡狀態(tài)。

胺碘酮是目前被認為療效較好的廣譜抗心律失常藥物，但其復雜的毒副作用在一定程度上限制了其應用［26］。本實驗中，胺碘酮與TMCC作用一致，可對抗缺氧／復氧引起的鈉電流減少，作用與200 μmol·L-1的TMCC相當。然而本室前期的實驗發(fā)現(xiàn)，胺碘酮會加重哇巴因對鈉通道的抑制，而TMCC則可以恢復過度抑制的鈉通道［15］。根據(jù)“最佳靶點學說”，一個好的抗心律失常藥物應對至少3種以上的心律失常靶點有效，且對單一通道的作用不過強，以減少致心律失常效應。TMCC對心肌鈉、鉀、鈣離子通道均有一定的作用，能夠使病理條件下的細胞重獲平衡，利于心律失常的治療且降低致心律失常的風險，符合“最佳靶點學說”的要求。

在心肌細胞中，除了主要的快速INa，還存在其他較弱的鈉離子流成分，即Na+晚電流（INaL）。近年來研究顯示，在某些病理情況下，由于鈉通道快速開放后更加不能失活，即引起INaL的增強、心肌復極儲備能力下降，易引發(fā)早后除極（EAD），導致心律失常。此外，INaL的增強還可通過鈉-鈣交換，使Ca2+內(nèi)流持續(xù)增多，易導致鈣超載，使心臟功能受損。由于INaL對心律失常的發(fā)生以及藥物抗心律失常作用都有重要意義，抑制INaL已成為心律失常治療的新方向，因而也愈加受到重視［27］。但是，TMCC對這種晚鈉通道是否有影響及其機制還亟待探索。

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