許 巖，馬 娜，鄧樹泳，王金全，馮鑒強，孟金蘭

（1.南方醫(yī)科大學中西醫(yī)結合醫(yī)院外三科，廣東廣州 510315；2.廣東藥學院基礎學院生理學系，廣東廣州 510006；3.中山大學中山醫(yī)學院生理學教研室，廣東廣州 510080）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD）又稱為震顫性麻痹，是神經(jīng)退行性疾病之一，在老年人群中多發(fā)。其特征性病理改變?yōu)楹谫|多巴胺（DA）能神經(jīng)元進行性變性和死亡，其病因目前仍在不斷探索中。

研究已證實，硫化氫（hydrogen sulfide，H2S）代謝異常參與阿爾采末病（AD）［1］、Down′s綜合癥［2］、中風［3］等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展。新近研究表明，在6-羥基多巴胺制備的PD模型鼠中檢測到黑質內源性H2S明顯減少，標記DA能神經(jīng)元的酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）陽性細胞數(shù)量及 TH蛋白表達明顯下降［4］。提示，內源性H2S的生成障礙也參與了 PD的發(fā)生。1995年Awata等［5］證實了胱硫醚-β-合酶（cystathionine-β-synthase，CBS）是腦內源性H2S生成的主要酶。那么，在PD發(fā)生發(fā)展過程中內源性CBS／H2S系統(tǒng)動態(tài)變化如何尚未明瞭。

研究證實，魚藤酮（rotenone）是線粒體呼吸鏈復合物I的抑制劑具有DA能神經(jīng)元毒性［6］，是PD發(fā)生及發(fā)展中一種肯定的環(huán)境危險因素。研究人員發(fā)現(xiàn)，將大鼠長期、慢性暴露于魚藤酮時，會產(chǎn)生類似于人類PD行為學和病理學的改變［7］。目前，體外應用魚藤酮復制PD細胞模型也得到了廣泛應用，在該模型中動態(tài)研究PD進展過程中內源性CBS／H2S系統(tǒng)的變化尚未見報道。

因此，本研究擬以魚藤酮誘導PC12細胞（來源于大鼠嗜鉻細胞瘤細胞株，從形態(tài)結構及功能方面均具有神經(jīng)元的特征）作為PD細胞模型，動態(tài)追蹤研究魚藤酮誘導PD細胞模型中CBS蛋白表達及活性、內源性H2S的生成、細胞毒性與氧化應激的變化，以闡明PD進展過程中內源性CBS／H2S系統(tǒng)的動態(tài)變化，為探索PD發(fā)病機制提供新穎的實驗資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 魚藤酮購自Sigma-Aldrich公司（St Louis，MO，USA）；細胞計數(shù)試劑盒-8（Cell Counter Kit-8，CCK-8）由 Dojindo公司提供（Kyushu，Japan）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco BRL公司（Calsbad，CA，USA）；GSH試劑盒購自 Beyotime Biotech（Shanghai，China）公司；β-actin、BCA蛋白定量試劑盒購自 Kangchen Biotech（Shanghai，China）公司；CBS抗體購自Cell Signaling公司 。

1.2 細胞培養(yǎng) PC12細胞培養(yǎng)于10%的胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。細胞以0.25%的胰蛋白酶消化，每2～3 d傳代1次。在細胞對數(shù)生長期進行藥物處理。

1.3 實驗分組 ① 空白對照組（control），在細胞培養(yǎng)體系中不加入任何藥物；②魚藤酮組，在細胞培養(yǎng)體系中加入1.5μmo l·L-1魚藤酮分別處理PC12細胞 6、12、24、48 h觀察相關指標變化。

1.4 細胞存活率的檢測 取對數(shù)生長期細胞，以1×104／孔接種于96孔板，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜后，各組細胞分別與CCK-8（每孔100μl加10μl CCK-8）孵育4 h，隨后在酶聯(lián)免疫檢測儀測定每孔的吸收值（450 nm波長），按公式：存活率／%＝（實驗組OD-空白對照組OD）／（正常對照組OD-空白對照組OD）×100%，求出實驗組的存活率，重復3次，進行統(tǒng)計分析。

1．5 細胞內GSH含量檢測 按照碧云天生物技術研究所提供的谷胱甘肽檢測試劑盒說明書進行。PC12細胞接種與35 mm培養(yǎng)皿內，當細胞生長至80%融合時給予不同條件的培養(yǎng)基。處理結束后，用0.5%TritonX-100溶液裂解細胞。細胞裂解液經(jīng)BCA法進行蛋白定量后，檢測GSH的含量。GSH可與 5，5′-聯(lián)硫-2，2′-雙硝基苯甲酸（DTNB）反應生成黃色的5-巰基-2-硝基苯甲酸（TNB）。因而，黃色溶液的深淺可以間接反映GSH含量的高低。黃色溶液的強度可用酶標儀記錄412 nm波長處的吸光度以進行定量分析。

1．6 內源性胱硫醚-β-合酶（CBS）活性檢測 將細胞裂解產(chǎn)物經(jīng)蛋白定量后，加入預先配制好的反應體系［100 mmol·L-1磷酸鉀緩沖液（pH＝7.4）、10 mmol·L-1左旋 -半胱氨酸、2 mmol·L-15′-磷酸吡哆醛］中。使其占反應體系的10%，移至反應瓶，吸取1%醋酸鋅0.5 ml吸收液加入中央室。轉移錐形瓶至37℃水浴搖床中，搖蕩反應90 min后，在反應體系中加入50%三氯醋酸0.5 ml終止反應后繼續(xù)在37℃水浴反應60 min。將中央室的內容物轉移后加入7.2 mol·L-1含鹽酸對苯二胺的鹽酸溶液0.5 ml，加入1.2 mol·L-1含三氯化鐵的鹽酸溶液0.4 ml，于20 min后測670 nm波長處的吸光度值。

1．7 內源性H2S含量的檢測 取310μl經(jīng)蛋白定量后的細胞裂解液加入2%（W／V）醋酸鋅30μl；20%（W／V）三氯醋酸60μl；然后再加入 20 mmol·L-1二甲基對苯二胺硫酸鹽（7.2 mol·L-1HCl）40 μl和 30 mmol·L-1（1.2 mol·L-1HCl）FeCl340 μl，迅速合上EP管振蕩數(shù)下后，轉移至37℃生化培養(yǎng)箱靜置10min；高速離心12 000 r·min-110 min；分光光度計檢測670 nm處吸光度。

1．8 W estern blot法檢測蛋白的表達 PC12細胞接種于直徑為35 mm的培養(yǎng)皿內，各處理因素結束后，收集細胞并用細胞裂解液在冰上將細胞裂解，10 000×g、4℃離心15 min，上清液即為所提取的蛋白。將提取的蛋白樣品用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量?？偟鞍捉?jīng)SDS-PAGE分離后，轉移至PVDF上。用5%的脫脂奶粉（TBS-T配置）室溫封閉1 h，而后與CBS一抗（1∶1 000）共孵育，4℃輕搖過夜。TBST洗3次，加入相應的二抗，室溫孵育1 h。為了觀察蛋白的量，用β-actin作為總蛋白的內參照。PVDF膜經(jīng)TBS-T漂洗3次，每次5 min，免疫信號用增強型化學發(fā)光法（ECL）曝光到X光膠片上。將X光膠片掃描后，用ImageJ 1.41o軟件（NIH，Bethesda，MD，USA）進行定量分析。

1.9 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用表示，組間比較用one-way ANOVA方法。

2 結果

2．1 魚藤酮對PC12細胞內源性CBS表達的影響

Western blot法檢測內源性H2S合成酶CBS的表達，結果如Fig 1顯示，應用1.5μmol·L-1魚藤酮處理PC12細胞不同時間（6～48 h），與對照組相比，魚藤酮處理6和12 h組，CBS的表達明顯升高，其中6 h組CBS表達達高峰；而隨損傷時間延長，處理24 h組CBS的表達反而明顯降低，48 h組CBS的表達降至更低水平。表明魚藤酮輕度損傷可上調CBS的表達，而重度損傷則抑制CBS的表達。

Fig 1 Effect of rotenone on CBS expression in PC12 cellsPC12 cellswere treated with rotenone for different time（6，12，24 and 48h）.Western blot analysis was used to detect CBS expression.A：shows the changes in levelsof CBSexpression in the indicated groups.B：shows the data of denstiometric analysis for the changes in CBS expression.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.

2．2 魚藤酮對PC12細胞內源性CBS活性的影響

檢測 CBS活性顯示（Fig 2），PC12細胞經(jīng)1.5 μmol·L-1魚藤酮處理不同時間（6～48 h），CBS的活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。魚藤酮處理6 h組CBS的活性達到高峰；但隨處理時間延長，24 h處理組CBS活性明顯降低，48 h處理組CBS活性降至更低。這些結果表明，魚藤酮輕度損傷可刺激CBS活性升高，而重度損傷則抑制CBS的活性。

2．3 魚藤酮對PC12細胞H2S生成的影響 PC12細胞經(jīng)1.5μmol·L-1魚藤酮處理不同時間，6 h組和12 h組H2S含量均增加；但隨處理時間延長，細胞內H2S含量出現(xiàn)明顯降低，與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（Fig 3）。結果表明，魚藤酮輕度損傷誘導H2S生成增加，而重度損傷則抑制PC12細胞H2S的生成。

Fig 2 Effect of rotenone on CBS activity in PC12 cellsPC12 cells were treated with rotenone for different time（6，12，24 and 48h）.CBSactivity wasmeasured in reaction flask.**P＜0.01 vs control group.

Fig 3 Effect of rotenone on H2 S production in PC12 cellPC12 cellswere treated with rotenone for different time（6，12，24 and 48h）.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.

2．4 魚藤酮對PC12細胞存活率的影響 應用1.5 μmol·L-1魚藤酮作用不同時間（6～48 h），隨著作用時間延長，PC12存活率逐漸降低，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（Fig 4）。表明魚藤酮可時間依賴性的誘導PC12細胞毒性損傷。

2．5 魚藤酮對PC12細胞內GSH的影響 通過檢測PC12細胞內GSH含量顯示（Fig 5），1.5μmol·L-1魚藤酮處理PC12細胞不同時間（6～48 h），可使胞內GSH的含量時間依賴性地降低。此結果提示，魚藤酮誘導了氧化應激反應導致PC12細胞損傷。

Fig 4 Effect of rotenone on viability of PC12 cellsPC12 cellswere treated with 1.5μmol·L-1 rotenone for different time（6，12，24 and 48h）.Cell viability wasmeasured by CCK-8 assay.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.

Fig 5 Effect of rotenone on GSH level in PC12 cellsPC12 cells were treated with rotenone for different time（6，12，24 and 48h）.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.

3 討論

H2S作為一種信號傳導分子，在神經(jīng)系統(tǒng)中扮演著十分重要的角色，越來越多的研究提示，生理濃度的H2S對神經(jīng)細胞具有保護作用，而當其濃度過高或過低時，則與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生密切相關。近年來研究發(fā)現(xiàn)內源性 H2S在 AD［8］、腦卒中［9］及缺血／再灌注腦損傷［10］等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程中起著重要作用。

PD是一種神經(jīng)退行性病變，其主要癥狀包括運動遲緩、肌張力增高、靜止性震顫以及步態(tài)和姿勢不穩(wěn)，但病因至今未明。Hu等［4］研究發(fā)現(xiàn)在用6-OHDA誘導的帕金森樣大鼠中，其黑質和紋狀體內H2S水平明顯下降。而NaHS全身用藥能明顯的延緩運動功能障礙以及酪氨酸羥化酶陽性神經(jīng)元丟失的進程。提示，內源性H2S含量減少參與了PD的發(fā)病過程，外源性H2S具有抗6-OHDA毒性損傷的神經(jīng)保護作用。然而該研究尚缺乏對PD進展過程中內源性H2S相關指標的動態(tài)檢測。

內源性H2S在哺乳動物體內的產(chǎn)生有3條途徑，其中兩條是5′-磷酸吡哆醛的酶依賴途徑，即：胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-4β-synthase，CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase，CSE）途徑［11］。CBS和CSE的表達是組織特異性的。1995年Awata等［5］的實驗證實了腦內源性H2S的酶學產(chǎn)生機制，發(fā)現(xiàn)在腦內只有CBS的轉錄表達，而沒有CSE。此后Abe等［12］進一步用Northern印跡法分析證實了CBS在腦內的轉錄表達（海馬、小腦、大腦皮層、脊髓腦內段），但沒有發(fā)現(xiàn)CSEmRNA。同時證實CBS在海馬高度表達，CBS抑制劑可降低腦內H2S的產(chǎn)生，而CBS激活劑可增加H2S的產(chǎn)生［13］，進一步確定 CBS是腦中產(chǎn)生 H2S的主要酶［11，14］。那么，在PD進展過程中腦內源性H2S生成酶CBS的動態(tài)變化如何？尚未見報道。

為了明確內源性CBS／H2S系統(tǒng)在PD進展過程中的變化，本實驗在魚藤酮體外誘導PD細胞模型中，動態(tài)觀察了內源性 CBS／H2S系統(tǒng)在魚藤酮對PC12細胞損傷中的變化。本實驗觀察到，魚藤酮時間依賴性的抑制PC12細胞存活率的同時，細胞內CBS的表達及活性出現(xiàn)先升高后降低的動態(tài)變化，內源性H2S含量的檢測結果也呈現(xiàn)出先增加后減少的動態(tài)變化。尹蔚蘭等［15］應用甲醛損傷PC12細胞則發(fā)現(xiàn)，甲醛劑量依賴性的抑制CBSmRNA的表達及活性，減少內源性H2S的生成。結果的不一致可能與誘導損傷的因素不同有關。本實驗也觀察到，隨著魚藤酮細胞毒性作用的加重，PC12細胞內谷胱甘肽（glutathione，GSH）的含量也逐漸降低，而氧化損傷正是PD發(fā)生的重要病理機制之一。

已證實H2S可以抑制次氯酸［16］和過氧化亞硝酸鹽［17］等誘導的氧化應激損傷，發(fā)揮神經(jīng)細胞的保護作用。結合本實驗結果推測，在輕度損傷時，內源性CBS適應性表達和活性升高，使內源性H2S的生成增加，以對抗魚藤酮誘導的氧化應激細胞損傷作用；而在嚴重損傷的情況下，魚藤酮抑制了CBS的表達及活性，導致內源性H2S生成明顯減少，增加了PC12細胞對魚藤酮刺激的敏感性，最終導致細胞損傷。但關于CBS／H2S系統(tǒng)與魚藤酮誘導細胞損傷間的具體關系有待實驗進一步證明。本文為深入闡明PD的發(fā)病機制提供了有意義的實驗依據(jù)。

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