張銘慧，尹永強，康 毅，婁建石

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院藥劑科，天津 300052；2.天津醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室，天津 300070）

心律失常是臨床上常見且對患者生活質(zhì)量和生命安全影響極大的心血管疾病。對于大多數(shù)心律失?；颊撸瑹o論是預(yù)防還是治療，藥物都是主要的手段，但是很多抗心律失常藥物在治療心律失常的同時，又有誘發(fā)新的心律失常等不良反應(yīng)的危險，因此，我們必須以新的思路和途徑去尋找和發(fā)現(xiàn)療效高和毒副反應(yīng)小的抗心律失常藥。?；撬徭V（taurine magnesium coordination compound，TMCC）是我室采用高pH法，將含有受體原子的?；撬岷玩V離子螯合成了一種新的配合物，此配合物對多種原因引起的心律失常都具有防治效果，其對氯化鈣、烏頭堿、哇巴因、氯化銫、電刺激、腎上腺素等誘導(dǎo)的心律失常與觸發(fā)活動有確切的防治效果［1-2］。細胞水平的研究也表明該配合物不僅對正常心肌細胞鈉、鉀、鈣離子通道均有影響［3-4］，而且能恢復(fù)烏頭堿和哇巴因誘發(fā)的鈉電流及鈣電流異常［5-7］，也能對抗缺氧／復(fù)氧損傷引起的內(nèi)向整流鉀電流及瞬時外向鉀電流的異常［8-9］，提示其可能具有廣泛的抗心律失常作用。缺血缺氧一段時間，心肌在重新恢復(fù)血液供應(yīng)后，心肌不一定都會恢復(fù)其正常功能和結(jié)構(gòu)，反而出現(xiàn)心肌細胞損傷加重的表現(xiàn)，即心肌缺血／再灌注損傷。心肌缺血／再灌注時，大量鈣離子進入細胞內(nèi)，導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣超負荷，引發(fā)觸發(fā)性心律失常，但目前尚未見TMCC對缺氧復(fù)氧所致異常鈣電流作用的報道，因此，本實驗在大鼠心肌細胞缺氧／復(fù)氧損傷模型中觀察了TMCC對鈣離子通道的作用，以進一步探討其抗心律失常作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1 .1 實驗動物 健康成年Wistar大鼠，♂♀不拘，體質(zhì)量250～300 g，合格證號SCXK（京）2007-0001，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。

1.1 .2 藥品和試劑 HEPES、EGTA、Na2-ATP、Mg-ATP、膠原酶Ⅱ等購自Sigma公司。TMCC由天津醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室合成，溶于蒸餾水配成58 g·L-1母液，每次實驗時，把母液溶于細胞外液中，配成實驗所需濃度。

1.1 .3 主要儀器 膜片鉗儀，MuhiClamp 700B，USA；數(shù) -模轉(zhuǎn)換器，DigiData 1440A，USA；倒置顯微鏡，IX51，Japan；三維操縱儀，MP-225，USA；微電極拉制儀，P-97，USA；恒流泵，Peri-Star，臺灣；酸度計，PB-10，German；石英雙重純水蒸餾器，江蘇省金壇市正基儀器有限公司。

1.1.4 液體的制備 臺氏液（mmol·L-1）NaCl 136，KCl 5.4，MgCl21.0，NaH2PO40.33，HEPES 10，glucose 10，CaC121.8，用NaOH調(diào) pH至7.4。無鈣臺氏液除沒有CaC12外，其余成分與臺氏液相同。細胞保存液（KB液，mmol·L-1）：L-谷氨酸 70；牛磺酸 15，KCl 30，KH2PO410，MgCl20.5，EGTA 0.5，HEPES 10，glucose 10，用KOH調(diào)pH至7.35。鈣外液（mmol·L-1）：Tris-Cl 136，CsCl 5.4，MgCl21，CaCl22，HEPES 10，glucose 10，用 Tris-OH調(diào) pH至7.4。鈣內(nèi)液 （mmol· L-1）：CsOH 110，aspartate 110，CsCl 20，MgCl21，EGTA 10，HEPES 10，Mg-ATP 5，用CsOH調(diào)pH至7.2。以上液體在使用前均需充以純氧20 min以上。模擬鈣缺氧外液（mmol·L-1）：Tris-Cl 136，CsCl5.4，MgCl21，CaCl22，HEPES 10，用Tris-OH調(diào)pH至6.8，并充以100%N220min以上。

1.2 方法

1.2.1 單個大鼠心肌細胞的分離 25%的烏拉坦將麻醉大鼠，仰臥位固定于鼠臺上，迅速從劍突下剪開胸腔暴露心臟，從主動脈根部離斷取出心臟置于4℃臺氏液中，去除脂肪及結(jié)締組織。將主動脈逆行插管連接于Langendorff灌流裝置上。首先以無鈣臺氏液連續(xù)灌流5 min，待洗盡殘血，心臟停止跳動后改用50 ml含15 mg膠原酶Ⅱ的無鈣臺氏液進行循環(huán)灌流。隨著灌流的進行，流出液變得黏稠，心肌的顏色逐漸變淺、透亮，心臟體積逐漸變大、松軟。此時將心臟自左心室分段取心室肌組織，置于裝有KB液的試管中，用吸管輕輕吹打，使之分散成單個細胞，置4℃冰箱穩(wěn)定2 h待用。所有液體均以純氧飽和，整個灌流系統(tǒng)溫度保持在37℃。

1.2.2 L-型鈣電流（ICa，L）的記錄 應(yīng)用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄單細胞離子電流。所用微電極用兩步拉制法制成，微電極充灌電極液后電阻在2～4 MΩ之間。電流信號經(jīng)MultiClamp700B膜片鉗放大器、DigiData 1440A數(shù)-模轉(zhuǎn)換器及Pclampex 10.0采集、貯存及分析。將細胞懸液置于1 ml浴槽中，待細胞自然貼壁后，用細胞外液進行灌流，流速1ml·min-1。選用靜止、大小相近、紋理清晰的桿狀細胞進行實驗。待高阻封接形成后，進行電極電容補償，負壓或高電壓脈沖破膜，補償膜電容、串聯(lián)電阻及漏電流，形成全細胞記錄方式，平衡5min，待電極內(nèi)液與細胞內(nèi)液交換充分后，進行膜電流記錄。膜電流的大小以電流密度，即單位膜電容的膜電流表示。

1.2.3 實驗分組和造模 實驗分為正常對照組、缺氧／復(fù)氧模型組（H／R）、100μmol·L-1TMCC+H／R組、200μmol·L-1TMCC+H／R組、400μmol·L-1TMCC+H／R組、24.24μmol·L-1amiodarone+H／R組。將分離的細胞置于槽中，待貼壁后，先用記錄鈣通道電流的正常細胞外液進行灌流（流速1 ml·min-1），封接形成全細胞記錄模式后，平衡5 min，待電極內(nèi)液與細胞內(nèi)液交換充分后，進行膜電流記錄，此為正常細胞鈣電流；然后用記錄鈣通道電流的模擬缺氧細胞外液沖洗替換原浴槽中的正常外液，15 min后再以正常復(fù)氧外液沖洗替換掉模擬缺氧外液，5 min后記錄即為缺氧／復(fù)氧組鈣電流；TMCC組和胺碘酮組分別在正常有氧鈣外液中加入不同濃度TMCC和胺碘酮。記錄ICa，L時細胞外液中用Tris-Cl代替NaCl，細胞內(nèi)外液中均用CsCl代替KCl以排除鈉電流和鉀電流的影響。形成全細胞構(gòu)型后，在電壓鉗模式下記錄電流。將鉗制電位固定于-40 mV，指令電壓從-40 mV以10 mV為步階逐步階躍至+60 mV，脈沖持續(xù)時間150 ms，可記錄到大鼠心室肌細胞的ICa，L電流，見Fig 1。

Fig 1 Changes of I Ca，L currents after TMCC and am iodarone adm inistration during hypoxia-reoxygenation in rat ventricular cardiomyocytesA：Control；B：H／R；C：100μmol·L-1 TMCC+H／R；D：200 μmol·L-1 TMCC+H／R；E：400μmol·L-1 TMCC+H／R；F：24.24μmol·L-1 amiodarone+H／R.

1.3 數(shù)據(jù)處理 實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，單因素方差分析給藥組與對照組間的差異顯著性。

2 結(jié)果

2．1 TMCC、胺碘酮對大鼠心肌細胞缺氧／復(fù)氧損傷模型鈣離子通道電流的影響 形成全細胞構(gòu)型后，在電壓鉗模式下記錄電流。鉗制電位固定于-40 mV，指令電壓從-40 mV以10 mV為步階逐步階躍至+60 mV。各濃度TMCC及胺碘酮作用后鈣電流峰值變化見Fig 2A。結(jié)果表明，與正常對照組相比，缺氧／復(fù)氧使鈣電流明顯增大（n＝6，P＜0.01），TMCC（200、400μmol·L-1）能部分恢復(fù)缺氧／復(fù)氧損傷引起的鈣電流增大（n＝6，P＜0.01），且呈濃度依賴性。胺碘酮也使增大的鈣電流減小，其作用與400μmol·L-1TMCC相當。以峰電流對膜電位作圖得到電流-電壓（I-V）曲線，可以看出缺氧／復(fù)氧使鈣電流增大，I-V曲線下移。TMCC（100，200、400μmol·L-1）和胺碘酮能部分恢復(fù)缺氧／復(fù)氧損傷引起的鈣電流增大，使I-V曲線上移。曲線無平行移動，基本不改變曲線的形狀。TMCC（100、200、400μmol·L-1）及胺碘酮對缺氧／復(fù)氧損傷模型ICa，L電流-電壓曲線的影響見Fig 2B。

Fig 2 Effects of TMCC and am iodarone on I Ca，L in rat ventricular m yocardiocytes during hypoxia-reoxygenationA：I Ca，L peak；B：I-V curve.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control；ΔΔP＜0.01 vs H／R group.

2．2 TMCC、胺碘酮對大鼠心肌細胞缺氧／復(fù)氧損傷模型鈣離子通道穩(wěn)態(tài)激活動力學(xué)的影響 將ICa，L電流-電壓（I-V）曲線的結(jié)果轉(zhuǎn)化為膜電導(dǎo)（G），對條件刺激電壓作圖，然后采用Boltzman方程G／Gmax＝1／［1+exp（V-V1／2）／K］進行擬合，得到 ICa，L穩(wěn)態(tài)激活曲線。式中Gmax為最大膜電導(dǎo)，V1／2為半數(shù)激活電壓，K為斜率參數(shù)。各濃度TMCC及胺碘酮作用后鈣通道半數(shù)激活電位及K值變化見Fig 3A。結(jié)果表明：與正常對照組相比，缺氧／復(fù)氧使半數(shù)激活電壓明顯升高，激活曲線左移，激活加快。TMCC（200、400μmol·L-1）和胺碘酮（24.24μmol·L-1）可使增大的半數(shù)激活電位降低，恢復(fù)左移的激活曲線，使激活減慢。TMCC（100、200、400μmol·L-1）及胺碘酮對缺氧／復(fù)氧損傷模型ICa，L穩(wěn)態(tài)激活曲線的影響見Fig 3B。

Fig 3 Effects of TMCC and am iodarone on I Ca，L steady-state activation kinetics in rat ventricular m yocardiocytes during hypoxiareoxygenationA：Half activation potential and K；B：Steady-state activation curve.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 vs H／R group.

2．3 TMCC、胺碘酮對大鼠心肌細胞缺氧／復(fù)氧損傷模型鈣離子通道穩(wěn)態(tài)失活動力學(xué)的影響 采用雙脈沖刺激法測定ICa，L的失活曲線。鉗制電壓-40 mV施予1000 ms，階躍10mV，-40～20 mV系列條件脈沖刺激，在每一條件脈沖后緊跟一固定去極化至0 mV，150 ms的測試脈沖。以電流的相對值（I／Imax）對條件脈沖電壓作圖，得出 ICa，L的失活曲線。依 Boltzman方程 I／Imax＝1／［1+exp（V-V1／2）／K］進行擬合。式中Imax為最大膜電流，V1／2為半數(shù)失活電壓，K為斜率參數(shù)。各濃度TMCC及胺碘酮作用后鈣通道半數(shù)失活電位及K值變化見Fig 4A。結(jié)果表明：與正常對照組相比，缺氧／復(fù)氧使半數(shù)失活電壓明顯減小，失活曲線右移，失活減慢。TMCC（200、400μmol·L-1）和胺碘酮（24.24μmol·L-1）可使減小的半數(shù)失活電位增大，恢復(fù)右移的失活曲線，使失活加快。TMCC 100、200、400μmol·L-1及胺碘酮對缺氧／復(fù)氧損傷模型ICa，L穩(wěn)態(tài)失活曲線的影響見Fig 4B。

Fig 4 Effects of TMCC and am iodarone on I Ca，L steady-state inactivation kinetics in rat ventricular myocardiocytes during hypoxiareoxygenation）A：Half inactivation potential and K；B：Steady-state inactivation curve.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control；ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01 vs H／R group.

3 討論

心臟鈣通道功能直接影響到心肌電興奮的傳導(dǎo)及收縮功能，它往往是抗心律失常及抗心力衰竭藥物的作用對象。以往有報道表明，缺血10 min后再灌注時，缺血心室肌細胞膜上離子通道電生理學(xué)特性的改變與單純心肌缺血時相似［10］，易誘發(fā)折返性心律失常［11］；缺血30 min后再灌注時，細胞內(nèi)鈉離子增多，激活鈉-鈣交換電流，引起細胞內(nèi)鈣超載，從而誘發(fā)觸發(fā)電活動，使心臟易發(fā)生觸發(fā)機制介導(dǎo)的心律失常［12］。也有文獻報道［13］，模擬缺血液灌流10、20 min，使鈣電流峰值增大，繼以正常電極外液灌流10、20 min后，鈣電流將會進一步增大。本實驗選用缺氧15 min后復(fù)氧，結(jié)果顯示，缺氧使鈣電流增加，復(fù)氧使其進一步增大，恢復(fù)再灌注后ICa，L的進一步增大不僅在組織學(xué)上加重心肌損傷，在電生理上也易產(chǎn)生后除極電位，從而使再灌注觸發(fā)活性發(fā)生率上升，形成再灌注心律失常。

Satoh等［14-15］研究發(fā)現(xiàn)，在鈣超載時牛磺酸對兔的竇房結(jié)細胞自發(fā)性活動能明顯抑制，但若不連續(xù)給予?；撬釀t容易引發(fā)細胞內(nèi)鈣超載，另外，在低鈣和鈣超載情況下，?；撬岫伎赡艹尸F(xiàn)心肌保護作用。鎂離子也可通過影響通道的動力學(xué)［16］對L-型鈣通道起拮抗作用，它是一個廣譜抗心律失常藥。牛磺酸鎂配合物作為一種可行的新型治療藥物，其抗心律失常作用優(yōu)于?；撬崤c鎂劑單獨和聯(lián)合應(yīng)用。本實驗室前期研究證明其對大鼠正常心室肌細胞ICa，L有雙向的調(diào)節(jié)作用，即低濃度時呈現(xiàn)一定的抑制作用，而高濃度則呈現(xiàn)促進作用。本實驗中，TMCC對缺氧／復(fù)氧損傷引起的鈣電流增大不但沒有加劇，反而有濃度依賴性的恢復(fù)，提示TMCC不但不會引起鈣超載的加重，反而會對抗缺氧／復(fù)氧損傷引起的鈣內(nèi)流增加，因此推斷TMCC可能具有一定的對抗心肌缺血／再灌注損傷的作用，這一現(xiàn)象也提示TMCC的作用可能與鈣通道的狀態(tài)有關(guān)，即在鈣通道過度抑制時表現(xiàn)為促進作用，而在鈣通道過度興奮時表現(xiàn)為抑制作用，它能夠使失衡的鈣離子通道狀態(tài)恢復(fù)或接近原有的平衡狀態(tài)，有利于在治療心律失常的同時減少致心律失常的風險，滿足最佳靶點學(xué)說對抗心律失常藥物的要求。

L-型鈣通道在缺血／再灌注誘發(fā)的細胞內(nèi)鈣超載早期形成中起主要作用，一旦細胞內(nèi)鈣負荷持續(xù)增加，就會破壞膜的正常通透功能，導(dǎo)致Na+／Ca2+交換激增，引起由Na+／Ca2+交換主導(dǎo)鈣超載的進一步發(fā)生，而TMCC對其是否起作用尚需在以后的實驗中進一步驗證。

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