韓俊華，陳大歡，黃繼翔

(1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018;2.德州昂立達(dá)生物技術(shù)有限公司，山東德州253000)

近年來，為了最大程度的減少病蟲害和農(nóng)產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)損失，大量使用化學(xué)農(nóng)藥對(duì)農(nóng)作物進(jìn)行保護(hù)，由此引起的病菌抗藥性、食品中農(nóng)藥殘留超標(biāo)、環(huán)境污染等問題日益嚴(yán)重。因此，消除與控制化學(xué)農(nóng)藥污染，開發(fā)利用與環(huán)境和諧的生物防治方法，進(jìn)而保證食品安全和生態(tài)健康，已成為熱點(diǎn)問題［1］。

葡萄白腐病多發(fā)于高溫多雨季節(jié)，是引起葡萄爛果的主要病害之一，尤其是一些歐亞種品種，常引起大量果穗腐爛，對(duì)后期產(chǎn)量和果實(shí)的儲(chǔ)藏銷售影響較大。一般年份造成的損失在10%左右，嚴(yán)重年份高達(dá)60%以上［2－3］。多粘類芽孢桿菌對(duì)植物具有非致病性，且細(xì)胞壁不含內(nèi)毒素，對(duì)人畜無害在產(chǎn)品開發(fā)中活菌數(shù)量高、性能穩(wěn)定，是一種理想的生防菌［4］，在工業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中具有重要的應(yīng)用前景。美國(guó)環(huán)境保護(hù)署2002年將它列為可商業(yè)應(yīng)用的微生物之一，我國(guó)農(nóng)業(yè)部也將其列為免做安全鑒定的一級(jí)菌種。

多粘性芽孢桿菌HT16是從蝗蟲體內(nèi)分離到的一株能有效抑制真菌病害的生防菌。前期研究表明，HT16抑菌譜廣泛，對(duì)番茄灰霉病菌、黃瓜枯萎病菌、葡萄白腐病、青霉等抑菌性明顯，其發(fā)酵上清液經(jīng)分離純化后確定抗菌活性物質(zhì)分子量在4500u左右，且對(duì)酸堿、紫外線和高溫表現(xiàn)出很好的穩(wěn)定性［5］。因此，HT16菌株及其發(fā)酵液在植物病害防治和采后防腐保鮮中具有很好的研究?jī)r(jià)值及開發(fā)前景。為了提高抗菌蛋白的產(chǎn)量和節(jié)約實(shí)際應(yīng)用中的生產(chǎn)成本，本試驗(yàn)擬采用響應(yīng)曲面法以葡萄白腐病菌作為指示菌對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以確定其產(chǎn)生抗菌蛋白的最佳經(jīng)濟(jì)型培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 供試生防菌株為多粘類芽孢桿菌(paenibacillus polymaxa)HT16菌株，由本實(shí)驗(yàn)室保存，指示菌為葡萄白腐病菌(Coniothyrium diplodiella)由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植保系提供。

葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、硫酸鎂、硫酸銨、磷酸氫二鉀 均為分析純?cè)噭旖蚴杏来蠡瘜W(xué)試劑有限責(zé)任公司;牛肉膏、蛋白胨、酵母膏 均為生化試劑，北京奧特星生物技術(shù)有限公司;黃豆餅粉和茯苓粉購(gòu)于市場(chǎng);YT－CJ－1N超凈工作臺(tái) 海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SPX－100B－Z生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SYQ－DSX－280B不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器 山東新華醫(yī)療器械廠;pH211酸度計(jì)(Microprocessor pH Meter)HANNA instruments;3－18K高速冷凍離心機(jī) SIGMA。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基(種子培養(yǎng)基):葡萄糖2%、土豆20%、1000mL 蒸餾水，pH6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基:20%土豆、0.2%(NH4)2SO4、2.0%葡萄糖、0.05%K2HPO4、0.05%MgSO4·7H2O、pH6.5。

1.3 單因子試驗(yàn)

1.3.1 氮源單因子試驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基 分別以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%的酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、黃豆餅粉為氮源，代替(NH4)2SO4添加到發(fā)酵培養(yǎng)基［6］。

1.3.2 碳源單因子試驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基 分別以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0%的麥芽糖、可溶性淀粉、乳糖、茯苓、蔗糖為碳源，代替葡萄糖添加到發(fā)酵培養(yǎng)基［7］。

1.4 發(fā)酵條件

將50mL培養(yǎng)基裝入250mL的三角瓶，121℃滅菌20min，將24h種齡的HT16種子培養(yǎng)基以體積分?jǐn)?shù)為10%接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基，置于30℃，186r/min的搖床內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，48h后對(duì)發(fā)酵上清液活性進(jìn)行測(cè)定。

1.5 抗真菌活性的測(cè)定方法

采用杯碟法［8］進(jìn)行抗真菌活性的測(cè)定，以無指示菌生長(zhǎng)的區(qū)域的直徑表示抗菌蛋白的產(chǎn)量。將150μL孢子懸液(105cfu/mL)均勻涂布于20mL PDA培養(yǎng)基上，并放置牛津杯，添加150μL/杯的發(fā)酵上清液(8000r/min，4℃下離心 10min)，再添加 20μL/杯的氯霉素抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，將上述平板置于28℃，186r/min條件下培養(yǎng)48h，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑(采用十字交叉法測(cè)量)。

1.6 試驗(yàn)方法

1.6.1 Plackett－Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過單因子試驗(yàn)確定p.polymaxa HT16培養(yǎng)基的最適碳氮源，并根據(jù)芽孢桿菌生長(zhǎng)特點(diǎn)添加一定的無機(jī)鹽［9］。以Plackett－Burman設(shè)計(jì)法對(duì)試驗(yàn)的6個(gè)因素進(jìn)行考察(見表1)，以抑菌圈直徑為響應(yīng)值作顯著性分析。

表1 Plackett－Burman試驗(yàn)分析因素與水平Table 1 The factors and levels and of Plackett－Burman exprimental

1.6.2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)Plackett－Burman得到的擬合函數(shù)，回歸系數(shù)t的符號(hào)和大小來設(shè)計(jì)主要因素的最陡上升路徑，如果t值為負(fù)則該因素水平應(yīng)為遞減，反之遞增。通過響應(yīng)值的大小變化找出峰值，從而找到最大響應(yīng)區(qū)域［10］。

1.6.3 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì) 結(jié)合上述試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)Box－Behnken設(shè)計(jì)原理，以3個(gè)主要因素作為自變量(見表2)，以發(fā)酵液活性(即抑菌圈直徑)為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)分析因子，5個(gè)中心點(diǎn)。利用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design－Expert 7.1.3進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析［11］。

表2 Box－Behnken試驗(yàn)因素與水平表Table 2 Experimental factors and levels for the Box－Behnken experimental design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因子試驗(yàn)

2.1.1 氮源單因子試驗(yàn) 分別以酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、黃豆餅粉、(NH4)2SO4為初始氮源，結(jié)果表明5種氮源都能促進(jìn)該菌的生長(zhǎng)并產(chǎn)生活性物質(zhì)。其中以酵母膏為氮源的培養(yǎng)基抑菌圈直徑最大，但從成本角度來看，若進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，(NH4)2SO4和黃豆餅粉為更經(jīng)濟(jì)的氮源，并且兩種氮源協(xié)同作用優(yōu)于單一碳源效果。

2.1.2 碳源單因子試驗(yàn) 以(NH4)2SO4作為氮源，分別以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的麥芽糖、可溶性淀粉、乳糖、茯苓、蔗糖、葡萄糖為碳源，進(jìn)行單因子試驗(yàn)。培養(yǎng)過程中各種培養(yǎng)基都有抗菌活性，但抑菌效果有所差別，結(jié)果如圖2所示?？梢娬崽菍?duì)抗菌蛋白的產(chǎn)生影響最大，所以本試驗(yàn)確定蔗糖作為培養(yǎng)基碳源。

圖1 不同氮源對(duì)p.polymaxa HT16菌株產(chǎn)抗菌蛋白的影響Fig.1 The effects of different nitrogen source on HT16 strain produced antimicrobial protein

圖2 不同碳源對(duì)p.polymaxa HT16菌株產(chǎn)抗菌蛋白的影響Fig.2 The effects of different carbon source on HT16 strain produced antimicrobial protein

2.2 Plackett－Burman試驗(yàn)對(duì)主要因素的篩選

通過單因子試驗(yàn)，上述原發(fā)酵培養(yǎng)基(即20%土豆、0.2%(NH4)2SO4、2.0% 葡萄糖、0.05%K2HPO4、0.05%MgSO4·7H2O、pH6.5)所得抑菌圈直徑為12.07mm，芽孢數(shù)為1.8×108個(gè)/mL，并得到最初的發(fā)酵培養(yǎng)基為土豆、(NH4)2SO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、黃豆餅粉六個(gè)培養(yǎng)基組分，對(duì)其進(jìn)行考察，每個(gè)組分取高水平(+1)和低水平(－1)兩個(gè)水平，測(cè)量發(fā)酵液抑菌圈直徑大小，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析見表3。

由表4可知，培養(yǎng)基組分對(duì)活性物質(zhì)產(chǎn)量的影響顯著性的排序?yàn)?土豆 ＞(NH4)2SO4＞蔗糖 ＞MgSO4·7H2O＞黃豆餅粉 ＞K2HPO4。結(jié)果顯示，土豆、(NH4)2SO4、蔗糖為關(guān)鍵因素，其中土豆、(NH4)2SO4的t值為正，即對(duì)產(chǎn)抗菌蛋白的影響為正效應(yīng)，蔗糖t值為負(fù)，呈負(fù)效應(yīng)，且R2=0.97607，所以該模型擬合度較好。

表3 Placket－Burman設(shè)計(jì)與結(jié)果表Table 3 The Placket－Burman exprimental design and results

表4 各因素影響的主效應(yīng)分析Table 4 The main Analysis of of various factors

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Experimental design and results of steepest ascent path

2.4 Box－Behnken試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基成分

結(jié)合Plackett－Burman設(shè)計(jì)法篩選出的3個(gè)主要影響組分，根據(jù)它們的效應(yīng)大小設(shè)計(jì)步長(zhǎng)和變化方向，尋找產(chǎn)生最大活性值時(shí)的響應(yīng)區(qū)域，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5。由結(jié)果可見，最大活性值在3號(hào)附近。

根據(jù)最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，以試驗(yàn)號(hào)3的組分為響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn)。采用Box－Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定主要因素的最優(yōu)水平，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。

利用Design Expert 7.1.3軟件對(duì)表6進(jìn)行多元回歸分析，得到二次回歸方程，即:

D=－13.68071+1.848X1+37.50950X2+3.08669X3－0.42750X1X2+0.03X1X3－3.9375X2X3－0.028240－23.395－0.82258。此模型的方差分析，見表7。

表6 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及對(duì)應(yīng)結(jié)果Table 6 Results of response surface experiments

由表7可知，模型p＜0.0001，說明二次回歸模型是顯著的，失擬項(xiàng)p值為0.4552，說明該模型失擬項(xiàng)不顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.9905，表明了響應(yīng)模型可以解釋99.05%的總體變異情況，只有0.95%的變異無法用模型來解釋，回歸模型有高度的相關(guān)性，可以應(yīng)用于p.polymaxa HT16發(fā)酵培養(yǎng)基活性的理論預(yù)測(cè)。

表7 回歸方程的方差分析Table 7 Analysis results of regression and variance

通過軟件分析得到3種重要影響因子之間的響應(yīng)面分析模型圖(圖3)。考察任意兩個(gè)因子與響應(yīng)面D值之間的關(guān)系可通過三維圖形立體直觀地表現(xiàn)出來。

圖3 三個(gè)因素對(duì)抗菌蛋白產(chǎn)量影響的響應(yīng)曲面圖Fig.3 Response surface plot of the antifungal protein production by three main factors

由圖3可知，3個(gè)響應(yīng)面均為開口向下的凸形曲面，說明響應(yīng)值(抑菌圈直徑)在試驗(yàn)變化范圍內(nèi)存在極高值。比較圖3中的曲面圖可知，培養(yǎng)基中土豆?jié)舛?X1)對(duì)抗菌蛋白的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡。比較圖3中的等高線圖，土豆(X1)與硫酸銨(X2)質(zhì)量濃度對(duì)HT16菌株抗菌蛋白產(chǎn)量的交互影響作用最為顯著，表現(xiàn)為等高線最密集，與方差分析結(jié)果一致。對(duì)回歸方程求極值得到p.polymaxa HT16最佳發(fā)酵培養(yǎng)基3個(gè)因素的含量分別為:土豆30.49%、0.4%(NH4)2SO4、蔗糖1.48%，預(yù)測(cè)最大值為24.248mm。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，根據(jù)模型得到發(fā)酵培養(yǎng)基各組分的最適比例化整(即土豆30%、0.4%(NH4)2SO4、蔗糖1.5%)進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，共進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果顯示，抑菌圈直徑分別為24.56、24.20和23.94mm，其平均值為24.23mm與預(yù)測(cè)值24.248mm相近，且試驗(yàn)芽孢數(shù)為4.5×108個(gè)/mL，比原培養(yǎng)基的1.8×108個(gè)/mL提高了2.5倍。

3 結(jié)論

本研究采用Plackett－Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響菌株p.polymaxa HT16代謝產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的6個(gè)組分進(jìn)行了評(píng)價(jià)和分析，篩選出土豆、蔗糖、(NH4)2SO4為影響產(chǎn)量的主要因素。通過最陡爬坡試驗(yàn)確定最佳變化步長(zhǎng)，得到最大相應(yīng)區(qū)域。根據(jù)Box－Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，確定了培養(yǎng)基的最優(yōu)組分:土豆30%，1.5%蔗糖，0.4%(NH4)2SO4，0.05%K2HPO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.1% 黃豆餅粉(中溫)，pH6.5。發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑由原來的12.07mm提高到24.23mm，增加了1倍，且芽孢數(shù)提高了2.5倍，進(jìn)一步提高了p.polymaxa HT16菌株的抑菌活性。

［1］薛德乾.近年來葡萄白腐病重發(fā)原因及其防治對(duì)策［J］.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，21(8):114－115.

［2］劉長(zhǎng)遠(yuǎn)，趙奎華，王克，等.我國(guó)葡萄白腐病菌分類地位的重新確定研究［J］.植物病理學(xué)報(bào)，1999，29(2):174－176.

［3］芮廣虎，胡雪芹，殷坤，等.響應(yīng)面法優(yōu)化短短芽孢桿菌FM4B 的發(fā)酵培養(yǎng)基［J］.食品科學(xué)，2012，33(15):257－261.

［4］趙爽，劉偉成，裘季燕，等.多粘類芽孢桿菌抗菌物質(zhì)和防病機(jī)制之研究進(jìn)展［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2008，24(7):347－350.

［5］Zhou WW，Huang JX，Niu TG.Isolation of an antifungal Paenibacillus strain HT16 from locusts and purification of its medium－ dependent antagonistic component［J］.Journal of Applied Microbiology，2008，105:912－919.

［6］楊梅，張峰，蘇新華.蘇云金芽孢桿菌LLB19發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］.福建師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，25(2):76－81.

［7］張麗霞.枯草芽孢桿菌B908發(fā)酵工藝優(yōu)化研究［D］.呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［8］劉靜，王軍，姚建銘，等.枯草芽孢桿菌JA抗菌物特性的研究及抗菌肽的分離純化［J］.微生物學(xué)報(bào)，2004，44(4):511－514.

［9］王智文.多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymxa)Cp－S316抗真菌活性物質(zhì)的發(fā)酵、分離純化與性質(zhì)研究［D］.泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［10］曹小紅，蔡萍，李凡，等.利用響應(yīng)面法優(yōu)化Bacillus natto TK21產(chǎn)脂肽發(fā)酵培養(yǎng)基［J］.中國(guó)生物工程雜志，2007，27(4):59－65.

［11］王鴻磊，王紅艷，劉鵬麗，等.響應(yīng)面法優(yōu)化膠凍樣芽孢桿菌發(fā)酵條件的研究［J］.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28(8):63－67.