黃達(dá)明，張 雪，管國(guó)強(qiáng)，宋慶春，李 倩

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013)

發(fā)酵豆粕是指利用有益微生物發(fā)酵豆粕，同時(shí)產(chǎn)生微生物蛋白質(zhì)，豐富并平衡豆粕中的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)水平，最終改善豆粕的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，提高飼料品質(zhì)［1］。發(fā)酵豆粕已成為豆粕開發(fā)生產(chǎn)的熱點(diǎn)。朱平軍［2］等對(duì)黑曲霉發(fā)酵豆粕酸溶蛋白含量的影響條件進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后酸溶性蛋白含量為13.62%。Teng Da［3］等對(duì)米曲霉和枯草芽孢桿菌對(duì)豆粕的生物改性進(jìn)行了研究。

多菌種聯(lián)合發(fā)酵豆粕是利用微生物之間互補(bǔ)的關(guān)系，把幾種微生物有機(jī)結(jié)合在一起，能產(chǎn)生優(yōu)于單菌發(fā)酵的效果［4］。響應(yīng)面法是數(shù)學(xué)方法和統(tǒng)計(jì)方法結(jié)合的工程優(yōu)化方法，主要用于對(duì)生物產(chǎn)量受多個(gè)因素影響的問題進(jìn)行建模和分析，其最終目的是優(yōu)化該響應(yīng)值，從而快速有效地確定最佳條件。近年來(lái)，響應(yīng)面法在化工、生物、食品等領(lǐng)域也都得到了廣泛應(yīng)用［5］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆粕，馬鈴薯 均為市購(gòu);米曲霉，枯草芽孢桿菌和釀酒酵母 保存于本實(shí)驗(yàn)室;硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸、三氯乙酸、氫氧化鈉 均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

YC－L型冷凍恒溫振蕩器 鎮(zhèn)江格瑞生物工程有限公司;FA1004系列電子天平 上海上平儀器有限公司;YM50Z壓力蒸汽滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司;80－2型離心沉淀機(jī) 江蘇金壇市中大儀器廠;UDK149型全自動(dòng)凱氏定氮儀 意大利VELP公司;SHP－100型智能生化培養(yǎng)箱 上海三法科學(xué)儀器有限公司;DHG－9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海三法科學(xué)儀器有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

米曲霉保存采用PDA培養(yǎng)基。

枯草芽孢桿菌保存及液體種子培養(yǎng)基采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

釀酒酵母保存及液體種子培養(yǎng)基采用YPD培養(yǎng)基。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基:取豆粕20g，按料水比2∶1加入一定量的水，121℃滅菌30min，取出后晃動(dòng)使其不貼壁。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 種子液的制備 將米曲霉接入斜面，28℃培養(yǎng)72h，斜面長(zhǎng)滿孢子后加入無(wú)菌水將孢子洗下，制成孢子懸液(109個(gè)/mL)。從枯草芽孢桿菌和釀酒酵母斜面分別挑取兩環(huán)菌種到液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)24h達(dá)到生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，做種子液備用［6］。

其工作原理是：通過(guò)旋轉(zhuǎn)盤根壓蓋來(lái)擠壓銅壓套，銅壓套壓緊盤根，盤根在密封函內(nèi)彈簧的作用下被縱向擠壓發(fā)生橫向膨脹，從而密封柱塞與密封函的環(huán)形空間，防止高壓水刺漏及空氣進(jìn)入工作腔。

1.3.2 對(duì)峙試驗(yàn) 在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，觀察米曲霉，枯草芽孢桿菌和釀酒酵母在相同培養(yǎng)條件下是否能較好的共存，以便應(yīng)用于發(fā)酵豆粕［7］。

1.3.3 酸溶性蛋白含量的測(cè)定 根據(jù)GB/T22492－2008大豆肽粉中的方法提取發(fā)酵豆粕中的酸溶性蛋白［8］:準(zhǔn)確稱取樣品1g于100mL燒杯中，加入15%三氯乙酸溶液50mL，混合均勻，靜置5min;以中速定性濾紙過(guò)濾，棄去少許初始濾液，將濾液轉(zhuǎn)移至離心管，4000r/min下離心10min。取離心后的上清液用凱氏定氮儀測(cè)定酸溶性蛋白的含量。

1.3.4 單因素試驗(yàn) 發(fā)酵培養(yǎng)基初始含水量為50%，接種量為10%，接種比例1∶1∶1，培養(yǎng)溫度為28℃，以酸溶性蛋白含量為指標(biāo)，分別研究接種順序(同時(shí)接種，24h接入或者48h接入具體見表2)、枯草芽孢桿菌∶釀酒酵母∶米曲霉接種比例(2∶2∶1，2∶1∶1，1∶1∶1，1∶2∶1，1∶1∶2，1∶2∶2)、接種量(8%，10%，12% ，14%，16%)、含水量(40%，50%，60%，70%，80%)、發(fā)酵溫度(26，28，30，32，34℃)和發(fā)酵時(shí)間(48，60，72，84，96h)六個(gè)因素對(duì)豆粕發(fā)酵的影響效果。

1.3.5 響應(yīng)面設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)所篩選的最佳接種量，含水量和發(fā)酵溫度，應(yīng)用三因素三水平的Box－Behnken 設(shè)計(jì)［9］，以酸溶性蛋白含量為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法進(jìn)行分析，試驗(yàn)因素及水平見表1。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用Design Expert7.0.0分析軟件進(jìn)行方差分析。為了驗(yàn)證所得結(jié)果的可靠性，結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)條件，在優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，經(jīng)過(guò)3次平行試驗(yàn)，取平均值。

表1 Box－Behnken試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Factors and levels of Box－Behnken experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)峙試驗(yàn)

微生物本身代謝會(huì)產(chǎn)生不同種類的細(xì)菌素，在不同微生物或同一微生物的不同菌株之間可能產(chǎn)生相互拮抗相互兼容或相互促進(jìn)生長(zhǎng)的作用［7］。這些物質(zhì)構(gòu)成復(fù)雜，作用機(jī)理尚不清楚，但通過(guò)混合培養(yǎng)試驗(yàn)?zāi)芮逦仫@示不同菌株之間的作用。本試驗(yàn)通過(guò)米曲霉，枯草芽孢桿菌和釀酒酵母的對(duì)峙生長(zhǎng)試驗(yàn)，結(jié)果顯示枯草芽孢桿菌，米曲霉和釀酒酵母能共同生長(zhǎng)，相互之間不存在拮抗性。

圖1 菌株的對(duì)峙試驗(yàn)Fig.1 Confrontation test of strains

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 接種順序的確定 由表2可以看出，不同的接種順序?qū)λ崛苄缘鞍椎暮坑泻艽蟮挠绊憽Ｔ囼?yàn)1是三株菌同時(shí)接種，酸溶性蛋白的含量只有10.03%;若先接種枯草芽孢桿菌24h后再接種釀酒酵母和米曲霉，酸溶性蛋白含量最高可達(dá)19%。因此最佳接種順序?yàn)橄冉臃N枯草芽孢桿菌，24h后接種釀酒酵母和米曲霉。

表2 不同接種順序?qū)λ崛苄缘鞍缀康挠绊慣able 2 Influence of different inoculation order on the acid soluble protein content

2.2.2 發(fā)酵時(shí)間的確定 發(fā)酵時(shí)間的長(zhǎng)短直接影響發(fā)酵豆粕的品質(zhì)［10］。發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵豆粕酸溶性蛋白含量的影響如圖2所示。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵豆粕中酸溶性蛋白的含量不斷增加，在72h時(shí)達(dá)到最高，之后出現(xiàn)下降平穩(wěn)趨勢(shì)?？紤]到工業(yè)化生產(chǎn)易染菌，嚴(yán)格控制發(fā)酵周期，保證發(fā)酵豆粕品質(zhì)，選擇72h為最佳。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸溶性蛋白的影響Fig.2 Influence of fermentation time on the acid soluble protein

2.2.3 接種比例和接種量的確定 不同的接種比例和接種量交互影響發(fā)酵豆粕中酸溶性蛋白的含量，選取枯草芽孢桿菌∶釀酒酵母∶米曲霉接種比例(2∶2∶1，2∶1∶1，1∶1∶1，1∶2∶1，1∶1∶2，1∶2∶2)分 別 對(duì) 應(yīng) 試驗(yàn)編號(hào)1～6，由圖3中的a圖可以看出，當(dāng)接種比例為1∶1∶2時(shí)，發(fā)酵豆粕的酸溶性蛋白含量最高為18.34%。米曲霉含量低的接種比例對(duì)應(yīng)酸溶性蛋白含量稍低，因此選擇最佳接種比例為1∶1∶2。

圖3中的b圖顯示當(dāng)接種量為8%時(shí)，酸溶性蛋白含量較低，隨著接種量的增加酸溶性蛋白的含量先增加后降低。在接種量為10%時(shí)，酸溶性蛋白的含量達(dá)到最高18.09%，因此，選擇10%為最佳接種量。

圖3 不同接種比例及接種量對(duì)酸溶蛋白含量的影響Fig.3 Influence of different proportion and inoculated quantity on the acid soluble protein content

2.2.4 發(fā)酵溫度的確定 由圖4看出，豆粕發(fā)酵過(guò)程中酸溶性蛋白的含量有先增加后減少，最后達(dá)到平緩的趨勢(shì)。由于枯草芽孢桿菌的最適溫度是37℃，而釀酒酵母和米曲霉的最適溫度在28℃左右，不在同一范圍，混菌發(fā)酵溫度不一定是某一種菌的最適生長(zhǎng)溫度，因此由圖4知，混菌發(fā)酵的最佳溫度在30℃左右。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)酸溶性蛋白含量的影響Fig.4 Influence of fermentation temperature on the acid soluble protein content

2.2.5 含水量的確定 對(duì)于固態(tài)發(fā)酵來(lái)說(shuō)，培養(yǎng)菌基質(zhì)中的水分含量是影響菌體酸溶蛋白增加的一個(gè)重要因素［11］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)含水量從40%到80%過(guò)程中，發(fā)酵豆粕中酸溶性蛋白的含量先增加，后平穩(wěn)，之后下降又有上升趨勢(shì)。如圖5，當(dāng)含水量為60%時(shí)，酸溶性蛋白的含量最高。

圖5 含水量對(duì)酸溶性蛋白含量的影響Fig.5 Influence of water content on the acid soluble protein content

2.3 響應(yīng)面分析

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果 綜合分析單因素試驗(yàn)，確定接種順序、發(fā)酵時(shí)間和接種比例3個(gè)因素，選擇對(duì)酸溶性蛋白含量影響顯著的接種量、含水量和發(fā)酵溫度3個(gè)因素為自變量，根據(jù)Box－Behnken的設(shè)計(jì)原理，以酸溶性蛋白含量為響應(yīng)值設(shè)計(jì)試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。

2.3.2 回歸模型的建立及方差分析 使用Design Expert7.0.0分析軟件，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程:

由表4回歸模型方差分析可知，二次回歸模型極顯著，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明建模成功。響應(yīng)面的回歸系數(shù)R2=0.9574，校正后的 Adj R2=0.9027，Adeq Precision測(cè)得的信噪比=11.689通常大于4，這表明該模型的擬合程度較好，實(shí)驗(yàn)誤差較小，能夠用于發(fā)酵豆粕條件的分析和預(yù)測(cè)［12］。方差分析結(jié)果還表明，B和C對(duì)酸溶性蛋白含量的影響顯著，A2和B2對(duì)酸溶性蛋白含量的影響極顯著，說(shuō)明B含水量是影響豆粕發(fā)酵過(guò)程的重要因素，而AC的交互作用影響極顯著。從方差分析表中的F值可知，各因素對(duì)發(fā)酵豆粕酸溶性蛋白含量的影響程度大小為:含水量＞發(fā)酵溫度＞接種量。

表3 Box－Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of Box－Behnken

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Analysis results of regression and variance

2.3.3 響應(yīng)面分析 從圖6可以看出，在所選的范圍內(nèi)存在極值點(diǎn)。響應(yīng)值酸溶性蛋白的含量隨著接種量、含水量、溫度呈現(xiàn)先增大后下降的趨勢(shì)，且三個(gè)響應(yīng)曲面都呈開口向下的凸形曲面。根據(jù)響應(yīng)面法建立的數(shù)學(xué)模型分析，預(yù)測(cè)出最佳發(fā)酵條件為:接種量10.17%、含水量60.23%、溫度32℃，響應(yīng)面模型在此條件下預(yù)測(cè)到的酸溶性蛋白含量為21.07%。

2.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 考慮到試驗(yàn)的實(shí)際情況和操作可行性，對(duì)最佳發(fā)酵條件進(jìn)行調(diào)整，最佳發(fā)酵條件選取接種量10%、含水量60%、發(fā)酵溫度32℃，3次平行試驗(yàn)的結(jié)果表明，發(fā)酵豆粕酸溶性蛋白的含量為20.73%，與預(yù)測(cè)值相近，說(shuō)明模型準(zhǔn)確性較高，能較好地預(yù)測(cè)豆粕的發(fā)酵條件。

圖6 接種量和含水量、接種量和溫度、含水量和溫度對(duì)酸溶性蛋白含量影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface of inoculation quantity and water content，inoculation quantity and temperature，water content and temperature on the influence of acid soluble protein content

3 結(jié)論

對(duì)峙試驗(yàn)表明米曲霉、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母相互兼容，能用于混菌發(fā)酵豆粕。單因素試驗(yàn)研究了接種順序、接種比例、接種量、含水量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對(duì)酸溶性蛋白含量影響的趨勢(shì)，在此基礎(chǔ)上運(yùn)用響應(yīng)面分析得出最佳發(fā)酵工藝條件:接種量10%、含水量60%、發(fā)酵溫度32℃、發(fā)酵時(shí)間72h、接種比例為1∶1∶2和接種順序?yàn)橄冉涌莶菅挎邨U菌24h后接種釀酒酵母和米曲霉。在最佳條件下，發(fā)酵豆粕酸溶性蛋白的含量為20.73%。

研究表明，枯草芽孢桿菌、釀酒酵母和米曲霉混菌發(fā)酵豆粕，能很好的降解大分子蛋白，提高酸溶性蛋白的含量，提高豆粕的利用率。

［1］李建.發(fā)酵豆粕研究進(jìn)展［J］.糧食與飼料工業(yè)，2009(6):31－35.

［2］朱平軍，程茂基，江濤，等.黑曲霉發(fā)酵豆粕對(duì)豆粕中酸溶蛋白含量影響的研究［J］.飼料博覽，2011(6):5－8.

［3］Teng Da，Gao Meiyun，Yang Yalin，et al.Bio－modification of soybean meal with Bacillus subtilis or Aspergillus oryzae［J］.Biocatalysis and Agricultural Biotechnology，2012(1):32－38.

［4］劉海燕，邱玉朗，魏炳棟，等.微生物發(fā)酵豆粕研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2012，24(1):35－40.

［5］卓林霞，吳暉，劉冬梅.枯草芽孢桿菌發(fā)酵豆粕產(chǎn)蛋白酶優(yōu)化試驗(yàn)研究［J］.糧食與飼料工業(yè)，2009(2):32－35.

［6］周德慶.微生物學(xué)教程［M］.北京:高等教育出版社，2002.

［7］鄧露芳，范學(xué)珊，王加啟.固態(tài)發(fā)酵豆粕、菜粕和棉粕的復(fù)合菌篩選［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2012，39(4):102－104.

［8］常磊，劉永萍，徐聰聰，等.飼用酶與芽孢桿菌協(xié)同作用發(fā)酵豆粕的相關(guān)研究［J］.飼料工業(yè)，2011，32(22):21－25.

［9］張帥，董基，吳紫俊.米根霉固態(tài)發(fā)酵橘皮產(chǎn)纖維素酶工藝的優(yōu)化［J］.食品工業(yè)，2012(3):27－30.

［10］單達(dá)聰，王四新，季海峰，等.固態(tài)發(fā)酵工藝對(duì)豆粕蛋白質(zhì)降解度影響的研究［J］.飼料工業(yè)，2010，31(21):20－22.

［11］劉曉艷，于純淼，國(guó)立東，等.固態(tài)發(fā)酵高溫豆粕制備多肽飼料的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件研究［J］.大豆科學(xué)，2011，30(2):286－289.

［12］胡龍，吳雪輝，李葉青，等.響應(yīng)面法優(yōu)化油茶餅粕發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(13):249－252.