張會(huì)敏，李天嬋，孫美青，周慶伍，李安軍，何宏魁，張治洲，，*

(1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東威海264209;2.安徽古井貢酒股份有限公司，安徽亳州236826)

中國(guó)許多局部地區(qū)的土壤、空氣及水環(huán)境污染已經(jīng)比較嚴(yán)重。許多釀造企業(yè)(白酒、醬油等)依賴特定的天然微生物群落，而環(huán)境惡化非常有可能逐步改變微生物群落的結(jié)構(gòu)，繼而影響企業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。另外，基于天然微生物群落發(fā)酵的釀造企業(yè)新建生產(chǎn)基地在目前的技術(shù)水平下是不能遠(yuǎn)遷的，其原因就是它不能離開特定的水土所孕育的微生物群落結(jié)構(gòu)，就近擴(kuò)大生產(chǎn)基地并盡快投產(chǎn)一般也需要成熟的微生物群落技術(shù)來相助。目前國(guó)內(nèi)較大河流之?dāng)?shù)目已經(jīng)減半，短時(shí)間內(nèi)非常容易發(fā)生大面積或局部地區(qū)的氣候失調(diào)?？梢钥隙ǖ氖牵芏嗥髽I(yè)將陸續(xù)遇到不同程度的釀造過程發(fā)生異常的問題，繼而可能帶來產(chǎn)品質(zhì)量的波動(dòng)或成本提高。為了應(yīng)對(duì)上述挑戰(zhàn)，研究人員需要研發(fā)能夠快速定量檢測(cè)微生物群落結(jié)構(gòu)的生物技術(shù)，以便對(duì)發(fā)酵過程從分子水平上進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤測(cè)定，繼而研制群落結(jié)構(gòu)調(diào)制技術(shù)。為此，需要首先對(duì)發(fā)酵相關(guān)微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析鑒定。

研究人員已對(duì)若干傳統(tǒng)白酒釀造的窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了非常有效的分子鑒定和初步的群落調(diào)制［1－13］。比如熊小毛等［7－8］采用 DGGE 技術(shù)，對(duì)白云邊酒釀酒工藝過程中的大曲、堆積發(fā)酵產(chǎn)物、酒醅和窖泥，以及醬香型和濃香型酒相應(yīng)工藝中的原核微生物和真菌進(jìn)行了分子水平分析，發(fā)現(xiàn)白云邊酒整個(gè)工藝過程中的原核微生物種類和醬香型酒相近，但窖底泥的原核微生物種類比醬香型多，而真菌數(shù)量比較接近;本研究通過構(gòu)建16S rDNA文庫(kù)和DNA測(cè)序?qū)啪暰瞥乇诮涯嗪统氐捉涯嘀兴募?xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行了初步解析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

古井窖泥樣品2012年11月18日采于古井貢酒股份有限公司西廠和四分廠的八個(gè)樣品S10－S17，見表1。所取樣品密封后于－80℃度冷藏備用。土壤基因組DNA提取試劑盒Solarbio D2600 北京索萊寶科技有限公司;NPK02 PCR試劑盒 購(gòu)自GREDBIO，山東;膠回收試劑盒SK8132 購(gòu)自上海生工;TA克隆試劑盒D102A及大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α(Code No.9027)購(gòu)自大連寶生物;LB培養(yǎng)基成分、分子量標(biāo)記DL2000等其他生化試劑 均購(gòu)自上海生工。

普通PCR儀TP600 TaKaRa;生化恒溫培養(yǎng)箱SPX－250B－Z 博訊;震蕩培養(yǎng)箱THZ－92A 博訊;超凈工作臺(tái)SW－CJ－1F 博訊;普通離心機(jī)TGL－16GB 生工;凝膠成像分析儀WD－9413C 六一。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 窖泥樣品基因組總DNA提取 每種窖泥樣品稱取200mg，采用Solarbio試劑盒方法提取基因組，最后洗脫體積為50μL?；蚪M樣品－80℃冷藏備用。

1.2.2 細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增 擴(kuò)增引物為27F(5'－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3')和 1492R(5'－GGTTACCTTGTTACGACTT－3')。PCR 反應(yīng)12μL 體系:6μL 2 × NPK02(GREDBIO)buffer，1μL(50ng)DNA 模板，0.8μL each primer(2μmol/L)，0.2μL Taq DNA polymerase(5U/μL)，4μL ddH2O.PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性5min;94℃ 1min，55℃1min，72℃ 1min，38 個(gè)循環(huán);72℃延伸2min。

1.2.3 細(xì)菌16S rDNA克隆文庫(kù)的構(gòu)建及陽(yáng)性克隆的篩選 PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2% 瓊脂糖凝膠電泳，將位于1500bp左右的條帶切膠純化。按說明書將純化片段與載體pMD19－T連接進(jìn)行TA克隆。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，涂布于含氨芐(100μg/mL)LB板上37℃過夜培養(yǎng)，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。每個(gè)LB板預(yù)先涂有 40μL X－gal(20mg/mL)和 70μL IPTG(20mg/mL)。每種窖泥樣品從板上隨機(jī)挑取80～120個(gè)白斑克隆，進(jìn)行轉(zhuǎn)板備份培養(yǎng)并進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 克隆測(cè)序及序列分析 利用PCR引物27F和1492R進(jìn)行 DNA雙向測(cè)序(上海生工)。使用CExpress軟件完成雙向序列拼接。拼接所得序列由EditSeq(Lasergene，DNASTAR，Madison，WI，USA)軟件編輯，并由 Seqman(Lasergene)軟件去掉來自于pMD19－T載體的多余序列。再經(jīng)過NCBI的BLAST進(jìn)行比對(duì)，確定與已知序列的同源關(guān)系。根據(jù)BLAST結(jié)果，下載(http://www.straininfo.net/)標(biāo)準(zhǔn)菌的16S rDNA序列，然后每個(gè)OTU選用1個(gè)代表序列，采用Mega 5軟件建立neighbour－joining(Bootstrap method with a 1000 replicates)系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 克隆文庫(kù)評(píng)價(jià) 用C值和稀釋曲線對(duì)克隆文庫(kù)的細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析和評(píng)價(jià)，C值代表克隆文庫(kù)中所包含的微生物的種類占樣品中全部微生物種類的比例，反映了克隆文庫(kù)對(duì)樣品群落多樣性的代表程度，數(shù)值越大，代表性越強(qiáng)［13］。計(jì)算公式為:C(%)=(1－n1/N)×100計(jì)算，N代表16S rDNA克隆文庫(kù)的庫(kù)容，n1為文庫(kù)中僅出現(xiàn)過1次的OTU的數(shù)量。稀釋曲線(rarefactioncurve)是通過aRarefactWin軟件，用已知的各種OTU的相對(duì)比例來推算抽取n個(gè)克隆時(shí)出現(xiàn)OTU數(shù)量的期望值，然后根據(jù)一組n值與其相對(duì)應(yīng)的OTU數(shù)量的期望值所做出的曲線，當(dāng)曲線趨于平緩或達(dá)到平臺(tái)期時(shí)可以認(rèn)為庫(kù)容已經(jīng)足夠。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥基因組總DNA提取和PCR擴(kuò)增結(jié)果

利用土壤基因組DNA提取試劑盒提取樣品基因組總DNA。然后，以樣品總DNA為模板，通用引物27F－1492R擴(kuò)增包含16S rDNA所有V區(qū)序列。瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR產(chǎn)物單一，大小約1500bp左右，見圖1。

圖1 古井窖泥細(xì)菌16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Agarose gel separation of 16S rDNA PCR products of eight GuJingGong pit mud samples

2.2 細(xì)菌16S rDNA克隆文庫(kù)的分析

古井窖泥的八個(gè)樣本經(jīng)過克隆測(cè)序所取得的陽(yáng)性克隆數(shù)，OUT數(shù)，C值等參數(shù)見表2。各樣本TA克隆文庫(kù)的稀釋曲線見圖2。從S10隨機(jī)挑取的120個(gè)克隆中獲得112個(gè)陽(yáng)性克隆，歸為21個(gè)OTU，16S克隆文庫(kù)的C值為91.07%;從S11隨機(jī)挑取的120個(gè)克隆中獲得116個(gè)陽(yáng)性克隆，歸為11個(gè)OTU，C值為97.41%;從S12隨機(jī)挑取的120個(gè)克隆中獲得113個(gè)陽(yáng)性克隆，歸為17個(gè)OTU，C值為91.05%;從S13隨機(jī)挑取的120個(gè)克隆中獲得118個(gè)陽(yáng)性克隆，歸為20個(gè)OTU，克隆文庫(kù)的C值為92.37%;從S14隨機(jī)挑取的80個(gè)克隆中獲得64個(gè)陽(yáng)性克隆，歸為19個(gè)OTU，克隆文庫(kù)的 C值為82.81%(略低);從S15隨機(jī)挑取的120個(gè)克隆中獲得92個(gè)陽(yáng)性克隆，歸為14個(gè)OTU，克隆文庫(kù)的C值為92.39%;從S16隨機(jī)挑取的120個(gè)克隆中獲得109個(gè)陽(yáng)性克隆，歸為21個(gè)OTU，克隆文庫(kù)的 C值為89.91%(略低);從S17隨機(jī)挑取的80個(gè)克隆中獲得69個(gè)陽(yáng)性克隆，歸為11個(gè)OTU，克隆文庫(kù)的C值為89.86%(略低);稀釋曲線見圖2。盡管S14，S16和S17的C值偏低，相比于以前的研究［19］，本研究的陽(yáng)性克隆數(shù)目已擴(kuò)大了很多倍。湯斌等［19］曾對(duì)古井窖泥細(xì)菌多樣性進(jìn)行過初步分析，但是他們當(dāng)時(shí)僅探索了池底窖泥的30個(gè)陽(yáng)性克隆。本次研究探索了池壁和池底的793個(gè)陽(yáng)性克隆。結(jié)合C值和稀釋曲線可知庫(kù)容已基本滿足要求，可以得到較為全面且可靠的群落信息。

表1 古井窖泥樣本資料Table 1 GuJingGong pit mud samples

表2 古井窖泥樣本細(xì)菌克隆文庫(kù)分析參數(shù)表Table 2 Information of TA－cloning library for GuJingGong pit mud samples

2.3 細(xì)菌群落多樣性分析

將各克隆文庫(kù)的序列通過NCBI BLAST分析得到與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中相似度最高的菌種。詳細(xì)統(tǒng)計(jì)信息如表3所示。

古井窖泥八個(gè)樣本所得到的總共793個(gè)克隆，歸為57個(gè)OTU，優(yōu)勢(shì)菌類為未知菌類(60.78%)和厚壁菌門(Firmicutes，31.16%)。另外變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)、放線菌門(Actinobacteria)的奇異菌屬(Atopobium)也有相應(yīng)比例分布。

表4中列出了57個(gè)OTU的代表菌株和比對(duì)詳細(xì)信息。結(jié)合表3和表4可以看出厚壁菌門對(duì)應(yīng)的前26個(gè)OTU部分約有50%的代表菌株的相似度低于97%。而其余大類的代表菌株中，第55個(gè)、第33個(gè)和第45個(gè)OTU代表菌株相似度偏低外，其余代表菌株的相似度菌均大于97%。一般認(rèn)為同源性小于97%極有可能是新種，所以對(duì)于這部分細(xì)菌的物種歸屬需要進(jìn)一步確定。

表5顯示了西廠和四分廠的細(xì)菌群落結(jié)果分布差異，池底泥和池壁泥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異。與西廠相比，四分廠的變形菌門細(xì)菌的含量似乎要明顯豐富一些。與池壁泥相比，池底泥的細(xì)菌群落種類更豐富。

2.4 細(xì)菌16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)表3和表4中各OTU代表菌株blast結(jié)果的分類，將大致屬于厚壁菌門的第1～27個(gè)OTU的代表序列和未知菌類的最后8個(gè)OTU的代表序列的系統(tǒng)發(fā)育分析圖如圖3所示。第28到57個(gè)OTU的代表序列的系統(tǒng)發(fā)育分析圖如圖4所示。

表4 古井貢酒窖泥細(xì)菌各OTU代表菌株詳細(xì)信息Table 4 Representative strains of each bacterium OTU in GuJingGong pit mud samples

表5 古井貢酒窖泥細(xì)菌各類比例分布信息Table 5 Distribution of various types of bacteria in GuJingGong pit mud samples

圖3 根據(jù)代表序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。使用了35個(gè)代表性O(shè)TU序列(第1到27以及第50到57個(gè)OTU)和14個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌序列Fig.3 Construction of phylogenetic tree based on 16s rDNA sequences using representative OTUs(1 to 27，50 to 57)and 14 standard sequences

圖4 根據(jù)代表序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹。使用了30個(gè)代表性O(shè)TU序列(第28到57個(gè)OTU)和15個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌序列Fig.4 Construction of phylogenetic tree based on 16s rDNA sequences using 30 representative OTUs(28 to 57)and 15 standard sequences

從圖3來看，可以明顯看到B18代表序列起源最早，且其與其它代表菌株的遺傳距離很遠(yuǎn)。從表4得知，B18比對(duì)相似度只有83%，可推測(cè)B18極有可能并不屬于后壁菌門(Firmicutes)。圖3中各序列聚類分布，依次屬于后壁菌門(Firmicutes)的Peptococcaceae(Clostridiales)，Syntrophomonadaceae(Clostridiales)，Thermoanaerobacteraceae (Thermoanaerobacterales)，Clostridiales FamilyⅪ.Incertae Sedis(Clostridiales)，Bacillaceae(Bacillales，Bacilli)，Lactobacillales(Bacilli)，Clostridiaceae(Clostridiales)。中間部分，代表序列A47、C19、E19、N65、K16、E8、C13 沒有與標(biāo)準(zhǔn)菌聚類，可推測(cè)它們屬于后壁菌門(Firmicutes)的其余科屬。最后部分的M21、F12、F24代表菌株與其余菌株遺傳距離比較近，有可能屬于后壁菌門，而未知菌類的G22和C64兩者單成一支，并不屬于后壁菌門。

從圖4來看，A46代表序列起源最早，且其與其它代表菌株的遺傳距離很遠(yuǎn)。從表4得知，A46序列在NCBI中找不到相似序列，結(jié)合圖3可推測(cè)A46序列與后壁菌門有一定的親緣關(guān)系。很可能為近代進(jìn)化未鑒定菌類。圖4中各序列聚類分布，依次屬于變形菌門(Proteobacteria)的 Xanthomonadaceae、Pseudomonadaceae、Enterobacteriaceae、互 養(yǎng) 菌 門(Synergistetes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。

結(jié)合圖3和圖4，可確定8個(gè)未知菌代表的大致歸屬。G22明顯屬于擬桿菌門(Bacteroidetes);C64屬于變形菌門(Proteobacteria)的Xanthomonadaceae;A21、P3、C60、E19、M57 屬于后壁菌門(Firmicutes)。其中P3與標(biāo)準(zhǔn)菌Clostridium sardiniense DSM 599T有100%的相似度。A46顯示出與后壁菌門有很大親緣關(guān)系，由于進(jìn)化比較晚，具體歸屬需要進(jìn)一步鑒定。

3 結(jié)論

本研究利用16S rDNA克隆文庫(kù)對(duì)古井貢酒窖泥微生物群落進(jìn)行了較大規(guī)模的分子鑒定，發(fā)現(xiàn)在793個(gè)有效測(cè)序的陽(yáng)性克隆中未知菌種占據(jù)過半(60.78%)，已知菌類分別屬于Firmicutes(31.16%)、Proteobacteria(3.55%)、Bacteroidetes(3.79%)、以及Synergistetes(0.63%)、Actinobacteria的 Atopobium(0.13%)。這些結(jié)果為進(jìn)一步研制窖泥微生物群落組成的快速定量技術(shù)，繼而為實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)酵過程提供服務(wù)奠定了基礎(chǔ)。

目前所有已知的天然微生物群落都是比較復(fù)雜的，而且其中的絕大部分微生物都是人類所知甚少的物種。這說明在群落(而不是單個(gè)或少數(shù)微生物物種)水平上，微生物群落綜合研究水平及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用在國(guó)際范圍內(nèi)都處于初級(jí)階段。古井集團(tuán)研究人員及合作者已經(jīng)開展了若干研究［14－19］，包括曾經(jīng)對(duì)古井貢窖泥的微生物群落結(jié)構(gòu)做過分析［19］，得出了一些重要結(jié)論，而本研究是對(duì)以前工作的延續(xù)和補(bǔ)充。與已報(bào)道的其他類似研究一樣，研究結(jié)果顯示了窖泥微生物群落組成的復(fù)雜性，其中含量最高的一部分物種或種屬除了部分16S rDNA序列外往往沒有任何別的分子信息;在這種條件下建立快速實(shí)時(shí)測(cè)定群落結(jié)構(gòu)的方法比較困難;而要建立這種復(fù)雜性與釀造風(fēng)味及質(zhì)量控制之間的因果關(guān)系，更是需要研究人員的長(zhǎng)期努力。

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