周 杰， 劉 艷， 張桂榮， 孟慶繁， 滕利榮

（吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130023）

石蠟切片技術(shù)改進及細(xì)胞生物學(xué)實驗的統(tǒng)籌

周 杰， 劉 艷， 張桂榮， 孟慶繁， 滕利榮

（吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130023）

以細(xì)胞生物學(xué)實驗為代表的生物學(xué)實驗教學(xué)中，存在知識點多、技術(shù)操作要點多、課時有限等具體問題，針對細(xì)胞生物學(xué)實驗課的教學(xué)實踐，以提高學(xué)生綜合創(chuàng)新能力為目的，圍繞實驗教學(xué)創(chuàng)新，在實驗內(nèi)容、實驗方法、時間統(tǒng)籌安排等多方面進行了探討。在不增加實驗投入前提下，改進了以石蠟切片技術(shù)為代表的關(guān)鍵實驗環(huán)節(jié)、基于技術(shù)改造調(diào)整實驗時間，使學(xué)生在有限的時間內(nèi)掌握更多的實驗技術(shù)，并獲得對同一實驗進程從多角度多層次進行分析的訓(xùn)練，提高了實驗效率，培養(yǎng)了學(xué)生綜合分析解決實際問題的能力和科學(xué)思維，提高了實驗教學(xué)的質(zhì)量。

細(xì)胞生物學(xué)實驗;石蠟切片;教學(xué)改革

0 引言

以細(xì)胞生物學(xué)實驗為代表的生物學(xué)實驗教學(xué)中，存在知識點多、技術(shù)操作要點多，課時有限等具體問題。如何在有限的課時內(nèi)，既完成大綱要求的教學(xué)任務(wù)，又激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)熱情、培養(yǎng)學(xué)生綜合分析解決實際問題的能力和科學(xué)思維，就成為現(xiàn)代生物學(xué)實驗教學(xué)及教學(xué)改革的重要內(nèi)容及方向。

細(xì)胞生物學(xué)是一門實驗性很強的學(xué)科，也是生命科學(xué)領(lǐng)域中重要的基礎(chǔ)課程，學(xué)生通過細(xì)胞生物學(xué)課程了解細(xì)胞結(jié)構(gòu)及細(xì)胞活動的基本規(guī)律，細(xì)胞生物學(xué)理論課與實驗課密不可分。細(xì)胞生物學(xué)實驗課既是理論課程的驗證和補充，又是培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力、獨立思考能力、分析解決問題能力的重要手段［1-3］。而細(xì)胞生物學(xué)實驗專業(yè)性較強，只有在順利完成基礎(chǔ)實驗培訓(xùn)之后，才有可能作進一步的設(shè)計創(chuàng)新實驗及科研性實驗，這就要求我們合理分配基礎(chǔ)性實驗與設(shè)計創(chuàng)新實驗、科研性實驗各部分的時間，充分提高時間利用率，使學(xué)生得到更多的獨立動手機會，提高其獨立思考、分析解決問題的能力。

筆者結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)實驗課的教學(xué)實踐，對實驗方法及時間統(tǒng)籌安排等方面進行了改進，希望通過本實驗課教學(xué)，使學(xué)生在相對較短的時間內(nèi)掌握基本的細(xì)胞生物學(xué)實驗技術(shù)，增強學(xué)生對理論課知識的理解，為接下來的設(shè)計創(chuàng)新實驗及研究性實驗打下基礎(chǔ)。

1 統(tǒng)籌安排實驗時間

我院細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)任務(wù)繁重，每學(xué)期64學(xué)時，參與實驗的本科生人數(shù)近200人，分6組進行，每組需要做:①培養(yǎng)技術(shù)、切片機使用技術(shù);②倒置顯微鏡的使用技術(shù);③植物組織培養(yǎng);④石蠟切片;⑤細(xì)胞內(nèi)多糖觀察;⑥細(xì)胞內(nèi)核酸觀察;⑦雞血紅細(xì)胞的融合實驗等多個實驗項目［4-7］。我們曾經(jīng)將每一部分分開進行(見圖1)，雖然這樣可以避免各實驗項目之間的相互干擾，減少錯誤發(fā)生率，但是會大大延長實驗時間，學(xué)生完成實驗需7天。由于實驗時間分配不合理，有時學(xué)生忙的不可開交，不能很好掌握實驗內(nèi)容;有時卻又無事可做，使學(xué)生產(chǎn)生厭煩情緒，對實驗效果影響頗大。為此，我們將其中的部分實驗進行整合，將實驗分3天進行(見圖2):第1天，進行儀器設(shè)備及相關(guān)技術(shù)培訓(xùn)，動物處死，組織切取及固定(過夜);第2天，進行植物傷愈組織培養(yǎng)、石蠟切片實驗的脫水、透蠟、包埋(過夜)、動物細(xì)胞融合;第3天，進行石蠟切片實驗的切片、展片、烘干、復(fù)水、HE染色與福爾根染色、PAS染色。但是由于實驗時間限制，展片后烘干時間較短(1至2 h)，為避免在復(fù)水、染色步驟組織切片的丟失，學(xué)生往往利用酒精燈外焰對載玻片上的蠟帶進行較長時間的展片操作，往往會造成蠟帶熔化和組織破壞，學(xué)生很難針對展片程度進行準(zhǔn)確判斷，進而影響實驗的成功率和效果。為了避免上述問題，學(xué)生通常會反復(fù)向教師詢問，是否可以進行下一步操作，不僅大大增加了實驗教師的工作量，而且來自教師多次否定的回答，使學(xué)生產(chǎn)生較強的挫敗感，降低了對實驗的興趣。針對以上問題，我們對實驗中的限速步驟進行了改進，縮短了操作時間，進而使展片、烘干操作提至前1天，然后過夜，充分延長烘干時間，下文將對實驗方法改進進行進一步闡述。

圖1 細(xì)胞生物學(xué)實驗安排

圖2 改進后細(xì)胞生物學(xué)實驗安排

另外，原來動物細(xì)胞融合實驗安排在石蠟切片之后進行，學(xué)生觀察到的細(xì)胞融合率非常低，經(jīng)過分析，我們認(rèn)為細(xì)胞融合率低的原因主要是由于融合時間比較短，于是對實驗時間進行調(diào)整，將動物細(xì)胞融合安排在石蠟切片實驗中間(從脫水到包埋步驟之間)，具體時間由學(xué)生自主統(tǒng)籌。這樣在石蠟切片實驗過程中，學(xué)生可以隨時觀察細(xì)胞融合結(jié)果，感興趣的學(xué)生還可以在實驗教師的引導(dǎo)下，看到動物細(xì)胞融合狀態(tài)隨時間的變化，可以自主設(shè)計研究動物細(xì)胞融合實驗中PEG添加量、融合溫度對實驗結(jié)果的影響，可以進行融合率與時間關(guān)系的研究，在不增加實驗投入前提下，使學(xué)生能夠得到在同一實驗進程中從多角度多層次進行分析的訓(xùn)練，提高了學(xué)生的實驗興趣與科研能力。

2 改進實驗方法

石蠟切片實驗是細(xì)胞生物學(xué)實驗的重要部分，迄今為止石蠟切片仍然是疾病診斷，尤其是病變性質(zhì)判斷的重要手段［8-9］。實驗中涉及到斷頭處死小鼠，剖開腹腔，取出組織，沖洗，修切成小塊，加入固定液進行固定，各級乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，切片，染色，顯微鏡下觀察等多個操作步驟，每一步操作都會對結(jié)果造成至關(guān)重要的影響，要求操作者具有很好的實驗技巧，對于某些步驟(如包埋)，不得不由實驗教師進行演示實驗，而學(xué)生不能參與，造成學(xué)生動手能力得不到提高，因此我們把其中某些步驟操作進行改進，使其更適宜學(xué)生操作，讓學(xué)生更多的參與到實驗中，動手動腦，不僅提高學(xué)生實驗技能，而且使他們具有分析問題、解決問題的意識，提高其獨立研究能力。

石蠟切片過程中，最易受操作人員實驗技術(shù)影響的步驟是浸蠟、包埋，而且包埋效果直接影響到實驗結(jié)果的好壞。原來本科學(xué)生浸蠟、包埋部分操作成功率僅為10%～16%，甚至更低，不僅大大降低整體實驗的速度、延長實驗時間，而且由于大量重復(fù)操作，很容易造成學(xué)生產(chǎn)生厭煩情緒，對實驗失去信心。已經(jīng)有相關(guān)研究人員對常規(guī)石蠟切片方法進行了研究，并取得了較好的效果［10-13］。中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)的楊捷頻提到在夏季、冬季分別選擇高熔點(58～60℃)高硬度的蠟和選擇低熔點(54～56℃)低硬度的蠟，并且不同組織采用硬度不同的蠟。但是在本科教學(xué)實驗中我們試用之后效果并不明顯，這可能與本科生實驗操作技術(shù)的熟練程度有關(guān)，所以進一步發(fā)掘新的實驗技術(shù)改進，降低這一操作的技術(shù)門檻，除了對相關(guān)研究人員具有一定的輔助意義外，對本科生石蠟切片實驗教學(xué)就顯得尤為重要;彎雪燕等自制鐵皮包埋盒，利用這一改進實驗設(shè)備，取得了較好的效果，但是該設(shè)備改造僅適用于小規(guī)模應(yīng)用，不適于40人甚至更多人同時參與的本科生實驗，而如果擴大設(shè)備規(guī)模，則會增加實驗成本。

經(jīng)過了多次實驗改進探索，試圖降低這一實驗步驟的技術(shù)門檻，提高操作的成功率，先后進行了下面4個實驗:①烘箱或培養(yǎng)箱輔助蠟盒包埋，我們分別采用電烘箱和培養(yǎng)箱，保證石蠟的溫度，這樣做雖然保證了操作的成功率，但是由于參與實驗學(xué)生較多，頻繁開關(guān)設(shè)備的門，對這類儀器設(shè)備損耗較大;②eppendorf管直接包埋［14］，我們用水浴鍋在 4.5 mL eppendorf管中直接進行浸蠟、包埋，待蠟?zāi)毯?，破壞eppendorf管，取出管內(nèi)的蠟塊，但是這樣得到的蠟塊是圓柱形，不僅給修蠟造成麻煩，而且由于修蠟除去的部分較多，組織也易丟失;③水浴鍋邊緣熱臺蠟盒包埋，在恒溫水浴中化蠟，把蠟盒放在水浴鍋邊沿，以提高包埋盒內(nèi)外溫度，盡量縮短浸蠟、包埋之間的時間間隔，保證溫度變化較小，但是由于實驗中操作人員較多，水浴鍋邊沿較窄，容易因操作人員間的相互擁擠，使包埋盒落水，造成實驗的頻繁失誤和失敗;④浮漂熱臺蠟盒包埋，經(jīng)過多次探索，我們采用在4.5 mL eppendorf管中裝入2至3 mL石蠟對樣品進行最后一步浸蠟，利用浮漂使其漂浮在恒溫水浴鍋中，同時在裝載了樣品的eppendorf管上部配以較重的器物，保證裝載樣品的eppendorf管全部浸入并漂浮在60℃水浴鍋中，同時另取一個浮漂放在此水浴鍋中，把容積為2至3 mL的包埋盒放在浮漂上，待浸蠟結(jié)束后，馬上將樣品管中的樣品和熔蠟倒于包埋盒中，此時樣品在包埋盒內(nèi)部處于接近凝固的固液混合態(tài)，可以利用浸泡在同溫度下的蠟缸內(nèi)取出的牙簽對目的樣品組織進行位置調(diào)整，最后從浮漂上取出蠟盒，將蠟盒置室溫、冷卻，整個過程一氣呵成，有效避免了浸蠟、包埋過程中的溫度變化，提高了操作成功率，而且可以手動調(diào)整樣品組織的位置，避免了組織位置不適對下一步的修蠟造成的影響，保證了切片質(zhì)量。

經(jīng)過對197名本科學(xué)生的教學(xué)實踐證明，實驗方法改進后學(xué)生操作成功率由原來的10～16%，提高到83～91%，實驗操作時間由原來的4至5 h縮短為1至2 h，此方法具有操作簡單、經(jīng)濟實用、節(jié)能低耗等優(yōu)點，又能充分保證和改善包埋質(zhì)量，提高工作效率，大幅度縮短實驗時間，在后續(xù)的切片及染色實驗中證明新方法制得的組織包埋蠟塊具有與傳統(tǒng)方法相同或者相近的實驗效果，更為重要的是，新方法的使用避免了樣品組織沉浸在蠟塊底部、樣品組織在蠟塊中排布取向不合理、樣品組織周圍存在空洞等常見問題的出現(xiàn)。

另外在實驗時間由4至5 h縮短為1至2 h的基礎(chǔ)上，我們將實驗時間進行進一步調(diào)整(見圖3)，將原來第3天實驗內(nèi)容中的切片、展片、烘干操作調(diào)整至第2天實驗內(nèi)容中，新的第2天實驗內(nèi)容為:植物傷愈組織培養(yǎng)、動物細(xì)胞融合、石蠟切片實驗的固定、脫水、透蠟、包埋、切片、展片、烘干(過夜)。這一調(diào)整的意義在于可以提高蠟帶在載玻片上的固定程度，避免在復(fù)水、HE染色與福爾根染色、PAS染色等實驗步驟中組織切片的丟失。我們改造了包埋技術(shù)后，調(diào)整實驗時間，使得烘干時間由過去的1至2 h延長為10 h以上(過夜)，這將極大地提高蠟帶的固著程度，降低外焰展片操作對學(xué)生帶來的實驗失敗、技術(shù)困窘與厭煩情緒，實驗成功率提高和實驗效果改善也極大地激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)和獨立操作興趣。

圖3 包埋技術(shù)改進后細(xì)胞生物學(xué)實驗安排

3 結(jié)語

筆者針對石蠟切片實驗教學(xué)過程中存在的問題，對包埋方法進行改進，在不增加實驗成本基礎(chǔ)上，使實驗成功率大幅度增加、縮短實驗時間、提高工作效率、保證包埋質(zhì)量、獲得質(zhì)量較好的切片。在此基礎(chǔ)上，統(tǒng)籌安排細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)時間，使得學(xué)生通過自主時間統(tǒng)籌，將動物細(xì)胞融合實驗和石蠟組織切片實驗的實驗時間有機的穿插起來，使整個細(xì)胞生物學(xué)實驗教學(xué)時間安排更加合理，有效減少學(xué)生重復(fù)操作次數(shù)，提高實驗成功率。在不增加實驗投入的前提下，使得學(xué)生能夠在有限的時間內(nèi)獲得對同一實驗進程從多角度多層次進行分析的訓(xùn)練，使得學(xué)生嘗試并掌握了自主統(tǒng)籌安排實驗時間的實驗技巧，提高了學(xué)生的實驗興趣與科研能力，為發(fā)展學(xué)生創(chuàng)新思維能力，進一步獲取和創(chuàng)造新知識打下基礎(chǔ)［15-16］。

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Improvement of the Technology of Paraffin Sections and the Time Arrangement in Cell Biology Experiments

ZHOU Jie，LIU Yan，ZHANG Gui-rong，MENG Qing-fan，TENG Li-rong
(College of Life Sciences，Jilin University，Changchun 130023，China)

In this paper，in order to improve the creativity of students，the experimental content，experimental methods and time arrangements are discussed based on the teaching experience of the cell biology experiments course.After the experimental techniques improvement and the experimental time adjusted，students can master the more experimental techniques in a shorter amount of time，and they can be able to be trained to analysis the same experimental process from multi-level and multi-angle.Thus the experimental efficiency is improved and the students obtain the ability to resolve practical problems and scientific thinking.

cell biology experiments;paraffin sections;teaching reform

G 642.0

A

1006－7167(2014)05－0167－04

2013－06－24

吉林省中醫(yī)藥管理局項目(2010-PT053);吉林大學(xué)第三批重大教學(xué)改革項目(ZD110503)

周 杰(1976－)，女，遼寧瀋陽人，博士，副教授，主要從事微生物與生化藥學(xué)研究及生物學(xué)實驗教學(xué)工作。

Tel.:0431-85155310;E-mail:jzhou@jlu.edu.cn

滕利榮(1954－)，男，吉林長春人，教授，副院長兼吉林大學(xué)國家級生物實驗教學(xué)示范中心主任，主要從事生物技術(shù)制藥研究。

E-mail:tenglr@jlu.edu.cn