湯加寧 程向東 徐志遠(yuǎn)

胃癌嚴(yán)重危害人類健康，在各類惡性腫瘤死因中排名第2位[1]。腹膜轉(zhuǎn)移是胃癌進展過程中以及胃癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的常見現(xiàn)象，當(dāng)發(fā)生腹腔種植后，其治療效果往往不佳，5年生存率低于20%[2]。有研究者回顧性研究1172例胃癌RO切除術(shù)患者，胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的發(fā)生率為29%，且患者的中位生存時間只有6個月[3]。因此，迫切需要一個成熟、穩(wěn)定、可靠、價廉的胃癌腹膜種植轉(zhuǎn)移動物模型，這將有助于研究胃癌腹膜轉(zhuǎn)移機制，檢測各類抗胃癌藥物療效，進一步提高臨床治療策略，從而改善患者預(yù)后。有研究者曾采用Hp(幽門螺桿菌)感染小鼠，N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(N-methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidine，MNNG)、硝酸、乙醇等化學(xué)致癌物質(zhì)誘導(dǎo)Wister鼠等動物形成胃癌[4，5]。這些方法，原位胃癌成瘤時間長(要等10個月或者更久)，腹膜成瘤率低，且對于實驗人員有潛在Hp感染和化學(xué)致癌危險。還有研究者采用基因工程技術(shù)建立胃癌轉(zhuǎn)基因小鼠如p53/CDH1(一種通過歷時12個月的基因敲除技術(shù)形成于胃體的低分化腺癌小鼠模型)等[6]。此種方法雖能特異性的形成胃癌模型，但其成瘤時間長、代價巨大，不符合大批量的動物實驗研究。這些年來，國內(nèi)外主要采用細(xì)胞系建立胃癌腹膜種植轉(zhuǎn)移動物模型，具有成瘤周期短、成瘤率高、可以根據(jù)不同實驗?zāi)康慕⑨槍π阅Ｐ偷忍攸c，極大推動了胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的研究。

一、采用細(xì)胞系建立胃癌腹膜種植轉(zhuǎn)移動物模型的方法

1.胃癌灶原位移植形成腹膜轉(zhuǎn)移癌:目前最常用的宿主動物有:T細(xì)胞功能缺陷的BALB/c-nu/nu裸小鼠，T、B細(xì)胞功能聯(lián)合免疫缺陷的SCID鼠，T、B、NK細(xì)胞聯(lián)合免疫缺陷的BNX小鼠。一般選用6～8周齡的雄性鼠。上述實驗動物具有不同程度免疫缺陷，為了降低宿主動物感染致死率，通常采用SPF級動物(specific pathogen-free animal)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。SPF級動物飼養(yǎng)于具有嚴(yán)格屏障體系的環(huán)境中，該環(huán)境對于實驗員、動物飼料和空氣的出入都有嚴(yán)格要求[7]。

所用胃癌灶原位移植瘤組織主要來源于胃癌細(xì)胞株(SGC-7901、MKN-45、AGS、NCI-N87、SNU-16、MGC-803等)經(jīng)宿主動物皮下注射所形成的皮下瘤。待瘤體長到直徑0.8～1.0cm時，剔除包膜等其他組織，選取新鮮魚肉狀瘤塊，切成1mm3大小的小瘤塊作為原位移植瘤源。然后將這些小瘤塊移植于胃竇部近大彎側(cè)漿膜處，在宿主動物生存期內(nèi)將形成腹膜轉(zhuǎn)移瘤。

將小瘤塊移植于胃竇部有多種方法:如“懸掛法”、“胃囊法”、“OB膠粘貼法”、“纖維蛋白原-凝血酶法”[8～10]。(1)“懸掛法”:直接接將腫瘤以7-0的絲線縫掛于漿膜層，操作簡便、快速，但有可能術(shù)后脫落，故較少運用。(2)“胃囊法”:指在漿膜處造一個2mm長的創(chuàng)口，將小瘤塊置入漿膜層缺損處后采用荷包縫合，或是充分游離漿膜，在局部區(qū)域造成一小囊，而后將瘤塊置于小囊中，再縫合囊袋，使瘤塊整體被包埋于胃壁的漿膜層與黏膜層之間。(3)“OB膠黏貼法”:指用一次性注射針頭輕度損傷胃大彎中部漿肌層，以出血為度，將腫瘤小塊用醫(yī)用OB膠黏合在損傷處。(4)“纖維蛋白原-凝血酶法”:用無菌空針頭輕微劃破胃竇漿肌層，置入3～4塊小瘤塊(1mm3大小)，滴上約10滴凝血酶以覆蓋瘤組織表面，待凝血酶與纖維蛋白原反應(yīng)(約10s)，使得小瘤塊附著于胃上。

胃癌灶原位移植形成腹膜轉(zhuǎn)移癌的建模方法，模擬了人體內(nèi)胃癌的自然生長和腹膜轉(zhuǎn)移過程。移植瘤組織保留了胃癌細(xì)胞與細(xì)胞外的微環(huán)境，其完整性避免了腫瘤的生物學(xué)行為遭到破壞。建立這種模型不僅再現(xiàn)了胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程，而且可以通過測定相關(guān)分子的表達，探究胃癌轉(zhuǎn)移機制。胃癌灶原位移植的成功率都比較高。但是由于胃癌細(xì)胞系的差異以及宿主動物各個品系的差異，建模方法的差異，各宿主動物的生存時間的差異，腹膜瘤形成的靶向不確定性，造成了腹膜瘤形成的比率存在較大差異，詳見表1。

表1 胃癌灶原位移植形成腹膜轉(zhuǎn)移癌的模型比較

2.經(jīng)皮下穿刺腹腔注射瘤細(xì)胞形成腹膜癌:將細(xì)胞株制成細(xì)胞懸液(濃度數(shù)量級一般為106以上)，經(jīng)皮下穿刺腹腔注射形成腹膜瘤。這種方法模擬了胃癌細(xì)胞自然脫落形成腹膜瘤的過程，具有簡單、易操作、創(chuàng)傷小的優(yōu)點，深受研究者歡迎。Zhang等[14]選用裸鼠和SCID鼠經(jīng)皮穿刺腹腔注射胃癌細(xì)胞株AGS、NCI-N87和 SNU-16構(gòu)建腹膜種植瘤模型。探索出將(20～40)×106個 SNU-16細(xì)胞經(jīng)腹腔注射到SCID鼠中，能夠構(gòu)建穩(wěn)定實用的胃癌腹膜種植瘤模型。該模型的SCID鼠中位生存期為44～78天，可以為抗癌藥物的研究，提供一個寬闊的時間窗。該模型中不同的細(xì)胞系，不同宿主動物經(jīng)皮穿刺腹腔注射成瘤率比較，詳見表2。

表2 經(jīng)皮下穿刺腹腔注射法形成腹膜轉(zhuǎn)移癌比較

3.其他方法:(1)開腹胃黏膜下注射瘤細(xì)胞法:將宿主動物開腹后，將瘤細(xì)胞懸液注射于胃黏膜下，繼而形成腹膜癌。(2)開腹后瘤塊包埋法:用眼科鑷將體積為1.0～2.0mm3的瘤塊(細(xì)胞系接種宿主動物皮下成瘤所得)包埋于胃竇部大網(wǎng)膜內(nèi)。梅列軍等[15]用兔VX2瘤細(xì)胞采用開腹胃黏膜下注射瘤細(xì)胞法、開腹后瘤塊包埋法、經(jīng)皮穿刺瘤細(xì)胞懸液注射法在新西蘭大白兔上建立大動物的腹膜轉(zhuǎn)移癌模型。這3種方法構(gòu)建模型的成功率分別是100%(12/12)、91.7%(11/12)和58.3%(7/12)，呈現(xiàn)出開腹法與經(jīng)皮穿刺法相比有顯著性差別。

二、成功建立胃癌腹膜種植轉(zhuǎn)移動物模型的鑒定

為了鑒定以上幾種建模方法造模是否成功，研究員通常在宿主動物出現(xiàn)消瘦、乏力、厭食、腹腔積液、腹部包塊等惡病質(zhì)癥狀時，將宿主動物開腹直接用肉眼觀察腹腔內(nèi)腫瘤情況，包括大小、部位、質(zhì)地，有無局部區(qū)域侵襲播散等，而對于那些肉眼可疑部位進行取材，借助病理學(xué)檢查加以篩選。

三、采用細(xì)胞系建立胃癌腹膜種植轉(zhuǎn)移動物模型的應(yīng)用

1.胃癌腹膜轉(zhuǎn)移機制的研究:胃癌腹膜轉(zhuǎn)移涉及黏附、降解、移動、血管生成等多個階段，每一階段都有不同種類基因的改變和多種生物學(xué)活性物質(zhì)的介入[16]。王殿棟等[17]采用裸鼠腹腔注射 SGC-7901法建立胃癌腹膜轉(zhuǎn)移模型，聯(lián)合運用基因芯片技術(shù)篩選出數(shù)百個胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的差異性表達基因。實驗研究結(jié)果為研究與胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因提供了理論依據(jù)并具有一定的參考價值。吳濤等[18]用SGC-7901建立裸鼠腹膜癌轉(zhuǎn)移模型，論述轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)小干擾RNA抑制SGC-7901腹膜轉(zhuǎn)移。Miyake等[19]通過將HIF-1α敲除的胃癌細(xì)胞系采用腹腔注射法建立腹膜種植轉(zhuǎn)移模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-1α在腹膜轉(zhuǎn)移癌形成過程中具有促進腫瘤血管形成的作用。

2.抗癌藥物動力學(xué)及抗癌藥效應(yīng)的研究:Mori等[20]用MKN-45在BALB/c-nu/nu裸小鼠上建立模型，證明口服抗癌藥S-1(一種口服的氟尿嘧啶衍生物)具有抑制腹膜轉(zhuǎn)移瘤形成，提高裸小鼠生成率的效應(yīng)。Aoyagi等[21]在 BALB/c-nu/nu裸小鼠上采用腹腔注射胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系MKN-45P法建立胃癌腹膜轉(zhuǎn)移模型，研究表明貝伐單抗能抑制血管內(nèi)皮生長因子，抑制胃癌腹膜播散。Oh等[22]在BALB/c-nu/nu裸鼠腹腔注射AGS建立腹膜轉(zhuǎn)移模型，研究WIN55，212-2(大麻素受體激動劑)的抗癌作用。

3.腹腔熱灌注療法(hyperther-mic intraperitoneal chemotherapy，HIPEC)的抗癌療效研究。董怡民等[23]在BA-LB/c-nu/nu裸小鼠行腹腔注射SGC-7901建立模型，證明納米活性炭吸附氟尿嘧啶具有提高腹腔內(nèi)化療的效果。Tang等[24]用兔VX2細(xì)胞株在新西蘭大白兔上建立胃癌腹膜轉(zhuǎn)移癌模型，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合多西紫杉醇、卡鉑腹腔熱灌注可顯著延長發(fā)生胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的新西蘭大白兔的生存時間。

四、展 望

用細(xì)胞系建立胃癌腹膜種植轉(zhuǎn)移動物模型彌補了Hp感染、化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)動物形成胃癌時間長，腹膜成瘤率低的缺點，也克服了胃癌轉(zhuǎn)基因小鼠價格之昂貴的不足。而筆者介紹的上述幾種方法，雖具有腹膜成瘤率高，安全性好，成本低的優(yōu)點，但仍存在成瘤時間相對較長(數(shù)月之久)，成功建模動物篩選的主觀性(肉眼觀察)、復(fù)雜性(病理學(xué)檢測)，宿主動物體型偏小(裸小鼠、BNX鼠、SCID鼠)的缺點。為成功建立成熟、穩(wěn)定、可靠、價廉的胃癌腹膜種植轉(zhuǎn)移動物模型，筆者認(rèn)為應(yīng)該從以下3個方面改進:(1)進一步篩選高效的腹膜種植轉(zhuǎn)移細(xì)胞系。Koga等[25]建立了腹膜高轉(zhuǎn)移的MKN45-P細(xì)胞系，白飛虎等[26]順利地構(gòu)建了胃癌腹膜高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系GC9811-P。(2)采取客觀的方法篩選出發(fā)生腹膜種植轉(zhuǎn)移的宿主動物。Kaneko等[27]采用綠色熒光蛋白標(biāo)記的人胃癌細(xì)胞系MKN-45建立腹膜癌轉(zhuǎn)移模型，當(dāng)用熒光立體顯微鏡時，就可發(fā)現(xiàn)腹膜直徑150μm大小的微轉(zhuǎn)移癌。這種方法可以客觀地篩選出腹膜種植的宿主動物。(3)尋找更大更適宜手術(shù)干預(yù)的宿主動物。畢竟免疫缺陷小鼠體型較小，有效循環(huán)血量少，不利于手術(shù)干預(yù)。梅烈軍等[15]和 Tang等[24]用兔 VX2瘤株建立兔VX2腹膜轉(zhuǎn)移癌模型，但此法筆者認(rèn)為有些瑕疵，畢竟VX2為SHOP病毒在兔身上誘發(fā)出誘發(fā)型乳頭狀瘤后，經(jīng)過惡變成為鱗癌，非腺癌，不同于人常見的胃腺癌，況且VX2瘤并不是人胃來源的腫瘤。但該模型為研究腹膜各類轉(zhuǎn)移癌提供了較好的科研平臺。眾所周知，裸小鼠、SCID鼠、BNX鼠都是基因工程產(chǎn)物。隨著科學(xué)技術(shù)的法展，分子生物學(xué)領(lǐng)域的不斷拓展，更好更經(jīng)濟更適合科研需要的宿主動物的產(chǎn)生應(yīng)當(dāng)不是問題?？傊?，建立胃癌腹膜種植轉(zhuǎn)移模型的細(xì)胞系、宿主動物的種類，采用的成瘤方式很多，我們可以通過以上3個方面的改進，進一步完善模型，繼而建立出適合不同種應(yīng)用目的的胃癌腹膜種植轉(zhuǎn)移動物模型。

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