徐靚，張慧濤，鄭晶，賈寧，林琳，林宇靜，李玲玲，周文英，張樺△

(中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院1腎內(nèi)科，2病理科，3中心實(shí)驗(yàn)室，廣東珠海 519000)

白細(xì)胞介素17在狼瘡性腎炎小鼠中的表達(dá)及抗白細(xì)胞介素17抗體的干預(yù)作用*

徐靚1，張慧濤1，鄭晶1，賈寧1，林琳1，林宇靜2，李玲玲3，周文英3，張樺1△

(中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院1腎內(nèi)科，2病理科，3中心實(shí)驗(yàn)室，廣東珠海 519000)

目的:探討白細(xì)胞介素17(IL-17)在狼瘡性腎炎(LN)小鼠中的表達(dá)及抗IL-17抗體的干預(yù)作用。方法：11周齡的雌性MRL/lpr小鼠36只隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和干預(yù)組，另有同齡雌性昆明小鼠18只為對(duì)照組。干預(yù)組每只小鼠腹腔注射抗小鼠IL-17多克隆抗體20 μg，每2周1次，至實(shí)驗(yàn)觀察點(diǎn)結(jié)束。各組分別于第1次給藥后的24 h、14 d及28 d處死6只小鼠。光鏡下觀察腎臟病理情況，ELISA法檢測(cè)小鼠血清IL-17的含量，免疫組化法檢測(cè)腎組織IL-17的表達(dá)水平。結(jié)果:MRL/lpr小鼠腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)彌漫增生，腎小管上皮細(xì)胞顆粒及空泡變性，灶狀萎縮，腎間質(zhì)淋巴及單核細(xì)胞浸潤(rùn)伴纖維化;而干預(yù)組腎臟病理改變較實(shí)驗(yàn)組為輕。MRL/lpr小鼠的血清IL-17含量在實(shí)驗(yàn)組各時(shí)點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，而在干預(yù)組各時(shí)點(diǎn)均顯著低于實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)。IL-17在實(shí)驗(yàn)組小鼠腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)明顯增強(qiáng)，在各時(shí)點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05);在干預(yù)組，IL-17在各時(shí)點(diǎn)的表達(dá)均顯著低于實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)。結(jié)論:IL-17在MRL/lpr小鼠血清與腎組織中的表達(dá)顯著增加，而抗IL-17抗體可通過抑制IL-17的表達(dá)而抑制LN的炎癥免疫反應(yīng)，減輕腎臟病理?yè)p害。

狼瘡性腎炎;白細(xì)胞介素17;抗白細(xì)胞介素17抗體

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種常見的累及多臟器、多系統(tǒng)的自身免疫性疾病，腎臟是其最常見的受累器官，狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)是SLE致殘和致死的首位原因［1］。LN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，突出表現(xiàn)為多種自身抗體并通過免疫復(fù)合物等途徑誘導(dǎo)的炎癥免疫反應(yīng)，而炎癥通路的激活、炎癥細(xì)胞(特別是巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞)的浸潤(rùn)及炎癥因子的表達(dá)發(fā)揮著重要作用［2-4］。研究表明，白細(xì)胞介素(interleukin，IL)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)和各種趨化因子參與LN的發(fā)病及活動(dòng)狀態(tài)，從而引起和促進(jìn)腎臟損傷。其中近年發(fā)現(xiàn)的IL-17是LN發(fā)病機(jī)制中重要的細(xì)胞因子之一，其通過與受體特異性結(jié)合發(fā)揮促進(jìn)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答等多種生物學(xué)效應(yīng)［2-4］。目前尚不清楚拮抗IL-17的產(chǎn)生及其功能能否減輕LN的腎臟損傷。為此，本實(shí)驗(yàn)通過觀察IL-17在不同周齡的MRL/lpr小鼠血清及腎臟中的表達(dá)變化，同時(shí)使用抗小鼠IL-17抗體進(jìn)行干預(yù)，探討IL-17在LN炎癥免疫反應(yīng)中的作用以及抗IL-17抗體的干預(yù)效果。

材料和方法

1 動(dòng)物與試劑

健康雌性11周齡SPF級(jí)狼瘡小鼠(MRL/lpr)36只和昆明小鼠18只，體重25～26 g，購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［許可證號(hào)為SCXK(粵)2008-0002］，飼養(yǎng)環(huán)境:廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室。

小鼠IL-17 ELISA試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司;兔抗小鼠IL-17免疫組化多克隆抗體、兩步法免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司;抗小鼠IL-17多克隆抗體購(gòu)自上海今邁生物科技公司。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組11周齡雌性的MRL/lpr小鼠36只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和干預(yù)組，每組18只。另設(shè)相同周齡昆明小鼠18只為對(duì)照組。

干預(yù)組每只小鼠腹腔注射抗小鼠IL-17多克隆抗體20 μg，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠腹腔注射等容量生理鹽水，每2周1次，至實(shí)驗(yàn)觀察點(diǎn)結(jié)束。

各組分別于第1次給藥(抗IL-17抗體或生理鹽水)后的24 h(12周齡)、14 d(14周齡)及28 d(16周齡)各處死6只小鼠，取血標(biāo)本和腎臟。以上實(shí)驗(yàn)在廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室完成。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察及IL-17含量測(cè)定制備腎組織石蠟切片，行HE染色光鏡下觀察腎組織的病理學(xué)改變。免疫組化法檢測(cè)腎組織IL-17的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)步驟如下:石蠟切片常規(guī)脫蠟，梯度乙醇入水，檸檬酸鹽抗原修復(fù)液高溫高壓修復(fù)，過氧化物酶封閉液室溫孵育，滴加適當(dāng)濃度Ⅰ抗，4℃過夜復(fù)溫后滴加Ⅱ抗，DAB溶液顯微鏡下控制顯色，復(fù)染細(xì)胞核、分化、反藍(lán)，梯度乙醇脫水干燥，中性樹膠封片。用PBS代替Ⅰ抗作為空白對(duì)照。陽(yáng)性結(jié)果為細(xì)胞質(zhì)染色呈棕黃色，采用全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析。結(jié)果判定:采用陽(yáng)性面積百分率評(píng)分(0～4分)與陽(yáng)性強(qiáng)度評(píng)分(0～3分)的積分表示。用ELISA法檢測(cè)血清IL-17含量，具體步驟按照試劑盒說明書操作。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，腎臟免疫組化結(jié)果采用半定量分析，組間均數(shù)的差異采用單因素方差分析(Oneway ANOVA)，多個(gè)樣本均數(shù)兩兩之間的比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 腎臟病理改變

對(duì)照組小鼠腎臟腎小球、腎小管及腎間質(zhì)未見異常。在實(shí)驗(yàn)組，MRL/lpr狼瘡小鼠腎小球系膜細(xì)胞及基質(zhì)彌漫增生，伴局灶節(jié)段中到重度加重，腎小管上皮細(xì)胞顆粒及空泡變性，灶狀萎縮，腎間質(zhì)淋巴及單核細(xì)胞浸潤(rùn)伴纖維化，腎血管內(nèi)膜增生，管腔變窄。上述改變從12周齡到16周齡逐漸加重。而在干預(yù)組，12周齡時(shí)小鼠腎臟病理情況無(wú)顯著變化，在14和16周齡時(shí)腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)增生以及腎小管上皮細(xì)胞損傷減輕，腎間質(zhì)淋巴及單核細(xì)胞浸潤(rùn)減少。

2 血清IL-17含量的變化

實(shí)驗(yàn)組小鼠的血清IL-17含量在各時(shí)點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)進(jìn)行性升高。而在干預(yù)組，小鼠血清IL-17含量在各時(shí)點(diǎn)均顯著低于實(shí)驗(yàn)組(P＜0.05)，但仍高于對(duì)照組(P＜0.05)，見表1。

表1 MRL/lpr小鼠血清IL-17含量的變化Table 1.The levels of serum IL-17 in MRL/lpr lupus mice(ng/ L.Mean±SD.n=6)

3 腎組織IL-17的表達(dá)

IL-17主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)中，在對(duì)照組僅有微量表達(dá)，在實(shí)驗(yàn)組則有高表達(dá)，且隨小鼠周齡增加表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在各時(shí)點(diǎn)均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。干預(yù)組IL-17的表達(dá)水平在各時(shí)點(diǎn)均較實(shí)驗(yàn)組顯著降低(P＜0.05)，但仍高于對(duì)照組(P＜0.05)，見圖1、表2。

Figure 1.The expression of IL-17 in the renal tissues of MRL/ lprlupusmice(immunohistochemicalstaining，×400).A:Kunming mice in control group;B: MRL/lpr mice of 12 weeks in experimental group;C: MRL/lpr mice of 14 weeks in experimental group;D: MRL/lpr mice of 16 weeks in experimental group;E: MRL/lpr mice of 12 weeks in intervention group;F: MRL/lpr mice of 14 weeks in intervention group;G: MRL/lpr mice of 16 weeks in intervention group.圖1 MRL/lpr小鼠腎組織IL-17的表達(dá)

表2 IL-17在MRL/lpr小鼠腎臟中的表達(dá)情況Table 2.The expression of IL-17 in the renal tissues of MRL/lpr lupus mice(Mean±SD.n=6)

討論

MRL/lpr狼瘡小鼠模型是一種研究LN發(fā)生機(jī)制和評(píng)價(jià)LN治療方法及效果的理想模型，是目前應(yīng)用最為廣泛的研究LN的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型之一。本實(shí)驗(yàn)選擇12～16周齡的MRL/lpr小鼠作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探討IL-17在LN的早期發(fā)生機(jī)制和炎癥免疫反應(yīng)中的作用。結(jié)果顯示，IL-17在實(shí)驗(yàn)組MRL/lpr小鼠的血清含量顯著增高，在腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而且隨著小鼠周齡的增加，IL-17呈現(xiàn)進(jìn)行性升高，同時(shí)腎臟病理改變逐漸顯著，且間質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤(rùn)。這些結(jié)果提示，IL-17參與了LN的發(fā)病和病理生理過程。

IL-17可由許多免疫細(xì)胞產(chǎn)生，而T淋巴細(xì)胞是其主要來(lái)源，主要包括CD4+T細(xì)胞亞群的Th17細(xì)胞和雙陰性T細(xì)胞。其生物學(xué)功能是具有強(qiáng)大的致炎性，它能促進(jìn)多種細(xì)胞合成并釋放多種生長(zhǎng)因子和趨化因子(如IL-8、單核細(xì)胞趨化蛋白-1、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子-α)，并與TNF-α、IL-1等細(xì)胞因子有著復(fù)雜的相互作用和協(xié)同效應(yīng);同時(shí)IL-17具有強(qiáng)大的募集中性粒細(xì)胞的作用，使單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞迅速增多和大量聚集，并刺激產(chǎn)生IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α和前列腺素E2，增強(qiáng)局部炎癥和免疫損傷;此外，IL-17可促進(jìn)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生免疫球蛋白，增強(qiáng)B淋巴細(xì)胞的功能［4-9］。近年多項(xiàng)研究表明，SLE和LN患者或動(dòng)物體內(nèi)有高水平的IL-17表達(dá)，腎組織中出現(xiàn)IL-17生成細(xì)胞(雙陰性T淋巴細(xì)胞)浸潤(rùn)，且IL-17水平與疾病的活動(dòng)性及嚴(yán)重性相關(guān)［6，10-14］;LN患者或動(dòng)物的腎組織不僅可檢測(cè)到產(chǎn)生IL-17的T淋巴細(xì)胞，而且模型鼠的臨床表現(xiàn)隨著鼠體內(nèi)IL-17的產(chǎn)生減少而改善［5，15］。可見IL-17參與LN的炎癥免疫反應(yīng)過程，并在其中扮演著重要角色。

為進(jìn)一步探討IL-17在LN的發(fā)病和病理生理過程中的作用，本實(shí)驗(yàn)還設(shè)立了干預(yù)組，使用抗小鼠IL-17抗體對(duì)MRL/lpr小鼠進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果顯示:干預(yù)組小鼠在腹腔注射抗小鼠IL-17抗體后，在各時(shí)點(diǎn)IL-17的血清含量均顯著降低，腎組織中的表達(dá)亦顯著減少。同時(shí)，14周齡后MRL/lpr小鼠的腎臟病理情況得到改善。這些結(jié)果提示，使用抗小鼠IL-17抗體能顯著拮抗MRL/lpr小鼠產(chǎn)生的內(nèi)源性IL-17，從而影響IL-17的生物學(xué)效應(yīng)?？笽L-17抗體可以作為一種阻斷劑，通過抑制或下調(diào)IL-17在LN中的表達(dá)而達(dá)到抑制LN炎癥免疫反應(yīng)、改善腎臟病變的效果。其他學(xué)者的類似研究亦表明，IL-17及其受體可作為L(zhǎng)N治療的一個(gè)新靶點(diǎn)［3，5，11，13］。

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Expression of interleukin-17 and role of anti-interleukin-17 antibody in MRL/lpr lupus mice

XU Liang1，ZHANG Hui-tao1，ZHENG Jing1，JIA Ning1，LIN Lin1，LIN Yu-jing2，LI Ling-ling3，ZHOU Wen-ying3，ZHANG Hua1
(1Department of Nephrology，2Department of Pathology，3Centre of Laboratory，The Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Zhuhai 519000，China.E-mail:zh3196@126.com)

AIM:To investigate the expression of interleukin-17(IL-17)and the role of anti-IL-17 antibody in MRL/lpr lupus mice.METHODS:Female MRL/lpr lupus mice(n=36)were randomly divided into experimental group and intervention group，and female Kunming mice(n=18)served as control group.Each mouse in intervention group received intraperitoneal injection of 20 μg anti-mouse IL-17 antibody.The histological examination of the kidney samples was conducted under optical microscope with HE staining.The serum concentration of IL-17 was measured by ELISA.The protein expression of IL-17 in the renal tissues was detected by the method of immunohistochemistry.RESULTS:Remarkable pathological changes of the renal tissues in experimental group，such as diffuse hyperplasia in glomerular mesangial cells and stroma，granular denaturation of renal tubular epithelial cells，and focal infiltration of lymphocytes and monocytes in renal interstitial，were observed.Significant improvement of renal histology in intervention group was found compared with experimental group.The level of serum IL-17 in experimental group obviously increased as compared to that in control group.The level of serum IL-17 in intervention group was lower significantly than that in experimental group.The protein expression of IL-17 in the renal tissues in experimental group was increased as compared to control group.The expression of IL-17 in intervention group was apparently less than that in experimental group.CONCLUSION:The levels of IL-17 in the serum and renal tissue significantly increase in MRL/lpr lupus mice.Anti-IL-17 antibody may suppress the inflammatoryreaction and renal injury by down-regulating the expression of IL-17 in the mice with lupus nephritis.

Lupus nephritis;Interleukin-17;Anti-interleukin-17 antibody

R363.2+1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.027

1000-4718(2014)02-0343-04

2013-09-15

2013-11-26

廣東省科技計(jì)劃(No.2009B03081374);珠海市醫(yī)學(xué)科研基金(No.20110042)

△通訊作者Tel:0756-2528189;E-mail:zh3196@126.com