王玲，徐夢菲，劉曦，王維維，陳三妹，程錦國，陳國榮△

(溫州醫(yī)科大學1附屬第一醫(yī)院病理科，2附屬第二醫(yī)院，浙江溫州 325015;3浙江大學附屬第二醫(yī)院病理科，浙江杭州 310000;4紹興文理學院醫(yī)學院，浙江紹興 312000)

姜黃素衍生物B06對2型糖尿病大鼠肝臟的保護作用*

王玲1，徐夢菲1，劉曦2，王維維3，陳三妹4，程錦國2，陳國榮1△

(溫州醫(yī)科大學1附屬第一醫(yī)院病理科，2附屬第二醫(yī)院，浙江溫州 325015;3浙江大學附屬第二醫(yī)院病理科，浙江杭州 310000;4紹興文理學院醫(yī)學院，浙江紹興 312000)

目的:研究姜黃素衍生物B06對2型糖尿病大鼠肝臟的保護作用及機制。方法：雄性SD大鼠35只，隨機均分成5組:正常對照組、高脂組、高脂治療組、糖尿病組和糖尿病治療組。采用高脂飲食加鏈脲佐菌素誘導2型糖尿病大鼠模型。高脂治療組及糖尿病治療組用0.2 mg·kg-1·d-1B06灌胃8周。治療結(jié)束后用光鏡和透射電鏡觀察大鼠肝組織的形態(tài)學改變，并用Western blotting方法檢測肝臟AMP活化蛋白激酶α(AMPKα)和磷酸化AMPKα(p-AMPKα)蛋白的表達。結(jié)果:高脂組及糖尿病組大鼠肝臟顯示肝細胞脂肪變性、壞死，炎癥細胞浸潤，纖維組織增生，2型糖尿病大鼠和高脂血癥大鼠肝臟組織p-AMPKα表達降低;經(jīng)B06干預后，糖尿病大鼠和高脂血癥大鼠肝臟的形態(tài)學損害明顯得到改善，且肝臟組織p-AMPKα的表達水平升高(P＜0.05)。結(jié)論:B06對2型糖尿病大鼠的肝臟具有保護作用，可能與其上調(diào)肝臟p-AMPKα蛋白表達有關(guān)。

糖尿病;高脂血癥;姜黃素衍生物B06;肝;AMP活化蛋白激酶α;大鼠

2型糖尿病發(fā)病機制復雜，但總的來說，是以胰島素抵抗為主，同時伴隨有高脂血癥，有廣泛的并發(fā)癥，其中肝臟是受累的重要的靶器官之一。姜黃素衍生物B06去除了姜黃素不穩(wěn)定的β-二酮基團，改善了其不穩(wěn)定性和在體內(nèi)的代謝速度快、吸收少、生物利用度低等缺點，更好地發(fā)揮姜黃素的降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理作用［1］。然而，姜黃素衍生物B06對高脂飼養(yǎng)及2型糖尿病大鼠肝臟的作用國內(nèi)外尚未見報道。本研究通過對糖尿病大鼠和高脂血癥大鼠行B06干預，觀察肝臟的形態(tài)學改變，并測定肝臟組織AMP活化蛋白激酶α(AMP-activated protein kinase α，AMPKα)、磷酸化AMPKα(phosphorylated AMP-activated protein kinaseα，p-AMPKα)的蛋白表達水平，探討其對肝臟的影響及作用機制。

材料和方法

1 動物分組及模型建立

健康雄性SD大鼠(溫州醫(yī)科大學實驗動物中心提供)35只，SPF級，體重160～200 g，普通飼料適應性喂養(yǎng)1周后，隨機均分成5組:正常對照(NC)組、高脂(high-fat，HF)組、高脂治療(HF+B06 treatment，HFT)組、糖尿病(diabetes mellitus，DM)組和糖尿病治療(DM+B06 treatment，DMT)組。對照組繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)，其余組改用高脂飼料(飼料配方參考文獻［2］)喂養(yǎng)4周后，其中DM組與DMT組大鼠按30 mg/kg單次腹腔注射鏈脲佐菌素(鏈脲佐菌素溶于0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液內(nèi)，pH 4.0)，72 h后尾靜脈采血測空腹血糖，大于16.7 mmol/L為模型成功，NC組、HF組及HFT組腹腔注射等容積枸櫞酸緩沖液。成模后，后4組繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)，HFT組及DMT組用0.2 mg·kg-1·d-1B06灌胃8周，其余組給予等容積的2%羧甲基纖維素鈉灌胃。實驗期間動物自由進食進水，未使用胰島素及其它降糖藥物。治療結(jié)束后，禁食12 h后股動脈放血處死動物。

2 藥品

姜黃素衍生物B06為溫州醫(yī)科大學藥學院廣教授惠贈。

3 主要試劑

胰島素檢測試劑盒購自上海西塘生物科技有限公司;鏈脲佐菌素購自廈門星隆達化學試劑有限公司;AMPKα和p-AMPKα抗體購自Cell Signaling。

4 空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C)和穩(wěn)態(tài)模型評估的胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)的測定

分別取上述5組大鼠，股動脈放血處死，取血3 mL室溫凝固約25 min，1 500 r/min離心20 min，分離血清，用日立7600大型生化分析儀檢測各組大鼠FBG、TC、TG、LDL-C和HDL-C。ELISA測定空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)水平，并計算HOMA-IR。

5 肝臟的病理檢查

5.1 HE染色標本制備具體步驟見參考文獻［3-4］。

5.2 膠原纖維(Masson)染色標本制備石蠟切片，常規(guī)脫蠟，蘇木素染色5 min，1%鹽酸乙醇分化2 s，置于Masson液［組成成份:變色酸2R(chromotrope 2R)0.25 g、磷鎢酸0.5 g、冰醋酸0.5 mL和蒸餾水50 mL］中染色5 min，水洗，亮綠液染色5 min，95%乙醇脫水1 min，于石炭酸二甲苯中3 s，二甲苯透明，中性樹膠封固。

5.3 電鏡標本制備具體步驟見參考文獻［3-4］。

6 Western blotting法檢測肝臟組織中p-AMPKα蛋白的表達

6.1 蛋白樣品制備從-80℃冰箱中取出肝臟組織，稱取50 mg組織塊置于5 mL試管中，用預冷的PBS洗組織塊3次。倒去PBS，加500 μL裂解液，用組織勻漿器將組織徹底破碎。冰上靜置30 min。置于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心5 min。取上清液分裝于0.5 mL離心管中并置于-80℃保存。

6.2 結(jié)果分析用Bio-Rad Quantity One 4.6凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，用計算機圖像分析軟件(GelPro32)進行灰度掃描分析。以目的蛋白條帶(AMPKα或p-AMPKα)與β-actin條帶累積吸光度(A)值之比作為反映蛋白表達水平的相對指標。

7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)均為正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 生化檢驗結(jié)果

1.1 FBG、FINS和HOMA-IR檢測結(jié)果與NC組相比，HF組FBG和FINS明顯升高(P＜0.05)，HOMA-IR明顯升高(P＜0.01);DM組FBG和HOMAIR顯著升高(P＜0.01)，F(xiàn)INS差異不顯著;經(jīng)B06干預后，HFT組和DMT組大鼠FBG、FINS和HOMAIR均顯著降低(P＜0.01)，見表1。1.2血清TG、TC、LDL-C、HDL-C檢測結(jié)果及LDLC/HDL-C的比值與NC組比較，HF組血漿TG顯著升高(P＜0.01)，TC和LDL-C升高(P＜0.05)，HDL-C差異不顯著，LDL-C/HDL-C升高(P＜0.05); 經(jīng)B06干預后，HFT組大鼠TG下降(P＜0.05)，其余血脂指標差異不顯著。與NC組比較，DM組大鼠TG、TC和LDL-C顯著升高(P＜0.01)，LDL-C/HDLC顯著升高(P＜0.01)。經(jīng)B06干預后，DMT組大鼠TC、TG、LDL-C水平及LDL-C/HDL-C顯著降低(P＜0.01)，見表2。

表15 組大鼠FBG、FINS及HOMA-IR結(jié)果對比Table 1.Comparison of the levels of FBG，F(xiàn)INS and HOMA-IR among different groups(Mean±SD.n=7)

表25 組大鼠血脂結(jié)果比較Table 2.Comparison of the concentrations of blood lipids among different groups(Mean±SD.n=7)

2 肝臟的形態(tài)學改變

2.1 光鏡下觀察結(jié)果(1)HE染色:NC組大鼠肝細胞呈立方形，排列整齊，匯管區(qū)及小葉結(jié)構(gòu)清晰，見圖1A;HF組肝細胞脂肪變性明顯，細胞漿內(nèi)形成大小不等的脂滴，有炎癥細胞浸潤，膠原纖維增生不明顯，見圖1B;HFT組肝細胞脂肪變性較之前減輕，炎癥細胞減少，見圖1C;DM組中大鼠肝細胞水樣變性、脂肪變性明顯，脂滴以小脂滴為主，膠原纖維明顯增生并延伸至匯管區(qū)周圍肝細胞間，伴有多灶區(qū)炎癥細胞浸潤，見圖1D;DMT組中肝細胞變性明顯減輕，細胞間纖維組織減少，見圖1E。(2)Masson染色:NC組大鼠肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞形態(tài)正常，僅有中央靜脈壁、匯管區(qū)血管壁可見少量被染成綠色的膠原纖維，其余部位未見明顯纖維組織，見圖2A;HF組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整但排列紊亂，其中可見脂肪變性的肝細胞，匯管區(qū)周圍、肝細胞間見少量膠原纖維環(huán)繞，不形成明顯纖維化區(qū)域，見圖2B;DM組肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，肝細胞索明顯破壞，可見肝細胞脂肪變性并伴有壞死及炎癥細胞浸潤，肝臟纖維組織增生明顯，除匯管區(qū)外，其余肝組織間也可見膠原纖維相互連接包繞肝細胞，綠染面積增大，見圖2C;HFT組和DMT組中肝小葉結(jié)構(gòu)病變減輕，膠原纖維成分減少，肝組織纖維化程度明顯減輕，見圖2D、E。

Figure 1.Hepatic tissue morphological changes of each group(HE staining，×100).A:NC group;B:HF group;C:HFT group;D: DM group;E:DMT group.圖1 HE染色觀察各組大鼠肝臟的形態(tài)學改變

Figure 2.Hepatic tissue morphological changes of each group(Masson staining，×200).A:NC group;B:HF group;C:DM group; D:HFT group;E:DMT group.圖2 Masson染色觀察各組大鼠肝臟的形態(tài)學改變

2.2 電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果NC組肝細胞細胞核橢圓形，胞漿內(nèi)線粒體呈橢圓形，嵴豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈層狀排列，核糖體、糖原豐富，無脂滴形成，見圖3A。HF組大鼠肝細胞內(nèi)充滿脂質(zhì)顆粒，大小不一，部分相互融合成巨大脂滴，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，線粒體腫脹，內(nèi)室擴張，嵴減少，見圖3B。DM組大鼠脂質(zhì)顆粒明顯增多，以小脂滴為主;肝細胞核固縮，染色質(zhì)加深，染色質(zhì)呈不規(guī)則塊狀凝集，多居于核膜下;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少、擴張、斷裂;線粒體腫脹，嵴排列紊亂、模糊、中斷;狄氏間隙膠原纖維明顯增生，見圖3C。HFT組及DMT組肝細胞內(nèi)脂質(zhì)顆粒數(shù)量減少，核固縮減輕，線粒體增多，腫脹明顯減輕，板狀嵴清晰，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增多，排列較整齊，見圖3D、E。

Figure 3.Ultrastructure of rat hepatocytes in each group observed under transmission electron microscope(×5 000).A:NC group; B:HF group;C:DM group;D:HFT group;E:DMT group.圖3 電鏡下各組大鼠肝細胞超微結(jié)構(gòu)的改變

3 肝組織p-AMPKα的表達水平

與NC組比較，HF組AMPKα表達水平無顯著差異，p-AMPKα表達降低(P＜0.05)，經(jīng)B06干預后，HFT組AMPKα表達水平無顯著差異，p-AMPKα表達升高(P＜0.05);與NC組比較，DM組AMPKα 及p-AMPKα表達顯著降低(P＜0.01)，經(jīng)B06干預后，DMT組AMPKα及p-AMPKα表達顯著升高(P＜0.01)，見圖4。

Figure 4.Comparison of the levels of AMPKα and p-AMPKα among different groups.A:NC group;B，C:HFT group;D，E:HF group;F，G:DM group;H，I:DMT group.Mean±SD.n=7.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs NC;#P＜0.05 vs HF;△△P＜0.01 vs DM.圖4 各組大鼠肝臟內(nèi)AMPKα及p-AMPKα蛋白的表達

討論

在美國，肝臟病變是2型糖尿病患者死亡的主要原因之一，2型糖尿病患者肝臟病變的標準死亡率遠遠大于2型糖尿病患者心血管病變的標準死亡率［5］。糖尿病患者由于對糖利用有障礙，導致機體大量動員脂肪，從而引起過多游離脂肪酸進入肝臟，這是糖尿病肝病發(fā)生的關(guān)鍵因素;另一方面，由于糖尿病患者胰島素抵抗或分泌不足，導致機體胰島素抗脂溶作用減弱，也是導致肝損傷的一個主要原因。McGarry［6］在2001年的美國糖尿病協(xié)會年會上提出2型糖尿病中糖代謝紊亂的根源為脂代謝異常，他甚至將2型糖尿病稱為“糖脂病”。

AMPK是一種細胞內(nèi)能量代謝的重要調(diào)節(jié)因子［7］。它是一種異源三聚體，由α、β和γ 3個亞基組成［8］，其中α亞基起著催化作用，β和γ亞基則有著調(diào)節(jié)作用。α亞基N末端包含一個典型的絲/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，Thr172位點是其活性調(diào)節(jié)位點，此位點的磷酸化是維持AMPKα活性所必需的，故p-AMPKα是其活性形式。β亞單位通過連接α和γ亞單位從而作為該復合物的結(jié)構(gòu)核心。本實驗檢測肝臟內(nèi)AMPKα和p-AMPKα的表達水平。

大量的研究說明，AMPK可通過減少血糖來源和增加血糖去向從而在糖代謝中起重要作用。Halse等［9］的研究證實AMPK可以通過促使細胞對葡萄糖的攝取和利用、抑制糖原的合成，進而促進葡萄糖向糖酵解方向轉(zhuǎn)化，從而降低血糖濃度;另有研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素靶蛋白復合物2(target of rapamycin complex 2，TORC2)蛋白是一種調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性蛋白，其對調(diào)控肝臟的糖代謝起關(guān)鍵作用，而活化的AMPK能使TORC2處于磷酸化狀態(tài)并滯留在細胞內(nèi)，導致糖生成相關(guān)的酶表達受限，從而使糖生成減少;此外，F(xiàn)oretz等［10］的研究則表明活化的AMPK還可通過抑制果糖-1，6-二磷酸酶從而起到抑制糖異生的作用。最近研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素是一種對抗糖尿病胰島素抵抗的激素，它具有調(diào)節(jié)能量平衡、葡萄糖和脂肪代謝的作用。在2型糖尿病的發(fā)病過程中，血漿脂聯(lián)素水平的下降與胰島素抵抗的進展程度相平行，Shishodia等［11］認為其信號轉(zhuǎn)導機制是通過激活AMPK起作用的。另外，Yamauchi等［12］證實，在肝臟中，脂聯(lián)素是通過激活AMPK下調(diào)葡萄糖-6-磷酸酶，減少肝臟葡萄糖的輸出，進而減輕肝臟胰島素抵抗。

相關(guān)的研究表明，AMPK在脂代謝中也有重要的作用。羥甲基戊二酰CoA還原酶和乙酰CoA羧化酶分別是膽固醇和脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，而且都是AMPK活化的重要底物。激活AMPK可使兩者磷酸化而失活，從而分別抑制膽固醇和脂肪的合成。另外肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1是脂肪酸氧化的關(guān)鍵酶，丙二酰輔酶A是其生理性的抑制劑。AMPK激活后可使乙酰輔酶A羧化酶磷酸化失活，下調(diào)胞漿內(nèi)丙二酰輔酶A的含量，解除其對肉毒堿脂酰轉(zhuǎn)移酶1的抑制作用，促進細胞內(nèi)脂肪酸的氧化供能。

此外，研究表明，AMPK也是改善肝臟纖維化的關(guān)鍵靶點。肝星狀細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)型的激活過程是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)［13］，激活的肝星狀細胞大量增殖，合成分泌過多的膠原促使肝纖維化形成;然而，在肝纖維化逆轉(zhuǎn)過程中伴隨肝星狀細胞的凋亡［14］，因此誘導肝星狀細胞的凋亡及阻止其激活增生也成為肝纖維化治療的重要策略之一［15］，最近研究結(jié)果也顯示，AMPK表達可以誘導肝星狀細胞株LX2發(fā)生凋亡［16］，從而改善肝臟纖維化。

近些年來，大量研究提示姜黃素衍生物可以穩(wěn)定血糖，改善糖尿病的代謝紊亂，在治療和預防糖尿病方面有顯著的療效。本實驗研究發(fā)現(xiàn)DM組和HF組大鼠血糖、血脂的大多指標都有顯著升高，并都產(chǎn)生了胰島素抵抗，肝細胞發(fā)生脂肪變性伴肝細胞壞死及不同程度纖維化，經(jīng)B06干預后，DMT組和HFT組大鼠血糖指標及血脂主要指標均顯著降低(少數(shù)沒有顯著差異的結(jié)果，都出現(xiàn)了相應的趨勢，筆者考慮為姜黃素對不同指標的作用強度不同及樣本例數(shù)的限制所致)，肝臟形態(tài)學有明顯改善;同時，DM組中肝組織AMPKα和p-AMPKα的表達均顯著降低，提示AMPKα和p-AMPKα可能參與了2型糖尿病大鼠肝臟的纖維化、糖脂代謝異常和IR的發(fā)生，與文獻報道一致，經(jīng)B06干預后，DMT組AMPKα 和p-AMPKα的表達明顯升高(HF組與NC組及HFT組與HF組組間比較，AMPK無顯著差異，我們認為可能是HF組持續(xù)高脂喂養(yǎng)時間較短所致，只表現(xiàn)為降低或升高趨勢)，這說明B06可以激活肝組織AMPK，AMPK可能是其下游靶標之一，這與相關(guān)文獻報道一致［17］，但具體機制還待進一步研究。

綜上所述，本實驗說明了姜黃素衍生物B06可能通過調(diào)節(jié)肝臟內(nèi)AMPKα及其活性從而達到改善大鼠肝臟纖維化、降血糖、降血脂和增加胰島素敏感性的療效。

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Effect of curcumin derivative B06 on liver from type 2 diabetic rats

WANG Ling1，XU Meng-fei1，LIU Xi2，WANG Wei-wei3，CHEN San-mei4，CHENG Jinguo2，CHEN Guo-rong1
(1Department of Pathology，The First Affiliated Hospital，2The Second Affiliated Hospital，Wenzhou Medical University，Wenzhou 325015，China;3Department of Pathology，The Second Affiliated Hospital，Zhejiang University，Hangzhou 310000，China;4School of Medical Sciences，Shaoxing University，Shaoxing 312000，China.E-mail:chengr1978@ aliyun.com)

AIM:To observe the protective effect of curcumin derivative B06 on the liver from the rats with hyperlipidemia and type 2 diabetes mellitus.METHODS:Male Sprague-Dawley rats(n=35)were divided randomly into 5 groups:normal control group，high-fat group，high-fat+B06-treated group，diabetic group and diabetic+B06-treated group.After fed with a high-fat diet for 4 weeks，the rats in the later 2 groups were injected with streptozotocin intraperitoneally to induce type 2 diabetes mellitus.The rats in B06-treated groups were given B06 by gavage at a dose of 0.2 mg· kg-1·d-1for 8 weeks.After the treatment，the morphology of the liver was observed under light and transmission electron microscopes.The protein expression of AMP-activated protein kinase α(AMPKα)and phosphorylated AMPK α(p-AMPKα)was detected by Western blotting.RESULTS:Fatty degeneration，hepatocellular necrosis，inflammatory cell infiltration and hyperplasia of fibrous tissue were observed in the liver from the rats in high-fat group and diabetic group，and were relieved after B06 treatment.The protein expression of p-AMPKα was decreased in the liver of the rats in diabetic group and high-fat group，and it was increased in the liver of the high-fat and diabetic rats in B06-treated group.CONCLUSION:Curcumin derivative B06 exerts a protective effect on the liver in type 2 diabetic rats，and the increased expression of p-AMPKα may be involved in the mechanism of protection.

Diabetes mellitus;Hyperlipidemia;Curcumin derivative B06;Liver;AMP-activated protein kinase α;Rats

R587.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.024

1000-4718(2014)02-0328-06

2013-10-23

2014-01-07

浙江省公益性技術(shù)應用研究計劃項目(No.2011c23123);溫州市高層次人才創(chuàng)新技術(shù)項目

△通訊作者Tel:0577-55579795;E-mail:chengr1978@aliyun.com