嚴金海，王志強，韓西群，陳少紅，周新華，簡文靜，葛娟，趙彤

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院病理科，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，廣東廣州 510515)

Hsa-miR-150過表達誘導(dǎo)彌漫大B淋巴瘤細胞系OCI-Ly10再分化*

嚴金海，王志強，韓西群，陳少紅，周新華，簡文靜，葛娟，趙彤△

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院病理科，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，廣東廣州 510515)

目的:探究hsa-miR-150過表達誘導(dǎo)彌漫大B淋巴瘤細胞系OCI-Ly10再分化的機制。方法：運用real-time PCR檢測hsa-miR-150在永生化CD19+B細胞和OCI-Ly10細胞中的表達，利用Western blotting和免疫熒光細胞化學(xué)檢測hsa-miR-150靶基因c-myb的表達;通過LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法將含有重組慢病毒質(zhì)粒的病毒上清轉(zhuǎn)染OCI-Ly10細胞(Ly10-control組和Ly10-miR-150組);對新構(gòu)建的細胞亞系，通過MTT法檢測細胞增殖能力，流式細胞術(shù)檢測細胞周期及凋亡;運用real-time PCR、免疫熒光細胞化學(xué)和Western blotting檢測Ly10-control 和Ly10-miR-150的B細胞分化相關(guān)基因及c-Myb的表達;利用干擾片段干擾OCI-Ly10細胞c-myb表達后，運用real-time PCR和Western blotting檢測干擾效率及干擾后轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子BCL6和漿細胞分化開關(guān)蛋白PRDM1的表達。結(jié)果:(1)CD19+B淋巴細胞的hsa-miR-150表達量明顯高于OCI-Ly10細胞(P＜0.05);c-Myb在OCI-Ly10細胞中表達較強，而在CD19+B淋巴細胞表達較弱。(2)OCI-Ly10細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染hsa-miR-150后，B細胞分化相關(guān)基因的表達都明顯發(fā)生了變化，B細胞特異性激活蛋白(PAX5)和BCL6表達下調(diào)(P＜0.05);干擾素調(diào)節(jié)因子4(IRF4)、PRDM1和X盒結(jié)合蛋白1(XBP1)的表達上調(diào)(P＜0.05);和對照組相比，c-Myb在Ly10-miR-150細胞中表達明顯下調(diào)(P＜0.05)。(3)干擾OCI-Ly10細胞c-myb表達后，BCL6表達明顯下調(diào)，而PRDM1表達明顯上調(diào)。結(jié)論:(1)hsa-miR-150過表達對OCI-Ly10細胞抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用非常明顯。(2)過表達hsa-miR-150可誘導(dǎo)該瘤細胞向末端B細胞方向分化，作用機制可能與下調(diào)其靶基因c-myb的表達有關(guān)。

彌漫大B細胞淋巴瘤;分化;Hsa-miR-150;基因，c-myb

彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是一種高度異質(zhì)性惡性淋巴瘤，約占成人非霍奇金淋巴瘤30%～40%，近年來發(fā)病率逐年升高［1］。許多證據(jù)表明淋巴瘤的發(fā)生是由于正常淋巴細胞分化紊亂或分化阻滯的結(jié)果［2］。研究發(fā)現(xiàn)miRNA在B細胞分化過程中發(fā)揮重要作用，Zhou等［3］研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-150對B細胞的發(fā)育分化至關(guān)重要，隨著B細胞發(fā)育的不斷成熟，hsa-miR-150的表達量逐步升高。有文獻報道與正常B細胞相比，在不同亞類DLBCL細胞系中hsa-miR-150普遍低表達［4］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-150在伯基特淋巴瘤細胞株中明顯低表達，再表達hsamiR-150后可以通過調(diào)控其靶基因c-myb誘導(dǎo)EB病毒陽性伯基特淋巴瘤細胞株向末端B細胞方向分化［5］。那么在DLBCL細胞系中，hsa-miR-150的表達紊亂是否與瘤細胞分化相關(guān)呢?本研究通過構(gòu)建含有hsa-miR-150重組慢病毒質(zhì)粒的病毒上清轉(zhuǎn)染的DLBCL細胞系OCI-Ly10，探討hsa-miR-150與DLBCL細胞系OCI-Ly10分化的關(guān)系，為后續(xù)研究hsa-miR-150在侵襲性B細胞淋巴瘤分化的作用機制提供更多信息。

材料和方法

1 細胞系來源和培養(yǎng)

OCI-Ly10細胞是人彌漫大B淋巴瘤細胞株，由復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院惠贈［6］。CD19+B細胞是EB病毒轉(zhuǎn)化的永生化B淋巴細胞，為本實驗室保存。細胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)期、生長狀態(tài)良好的細胞進行后續(xù)實驗。

2 主要試劑

鼠抗人轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子BCL6抗體、鼠抗人干擾素調(diào)節(jié)因子4(interferon regulatory factor 4，IRF4)抗體、免疫熒光Ⅱ抗和Western blottingⅡ抗均購自北京中杉金橋生物公司;兔抗c-Myb單抗購自Abcam。MTT為廣州市威佳科技有限公司產(chǎn)品。DMSO和RPMI-1640、IMDM培養(yǎng)基均購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品。miRNA快速提取試劑盒購自BioTeke。miRNA逆轉(zhuǎn)錄和real-time PCR試劑盒All-in-OneTMmiRNA Q-PCR Detection Kit購自Genecopoeia。DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。蛋白提取試劑盒、蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購自上海申能博彩生物科技有限公司。PVDF膜購自Millipore。其它生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。所用引物由上海吉凱基因技術(shù)有限公司根據(jù)設(shè)計合成，見表1。靶向c-myb的siRNA序列(5’-AAGCTGAAGAAGCTGGTGGAA-3’)由Sigma公司合成。

表1 引物序列Table 1.Sequences of the primers

3 主要方法

3.1 Real-time PCR采用RNeasy Mini試劑盒分離純化各組細胞的總RNA，分光光度法測定計算提取的總RNA含量及濃度。參照TaKaRa試劑盒實驗操作說明進行real-time PCR，總反應(yīng)體積25.0 μL，其中Premix Taq 12.5 μL，cDNA 2.0 μL，上、下游引物各0.5 μL，去RNA酶水9.5 μL。擴增條件為:37℃逆轉(zhuǎn)錄15 min，85℃滅活5 s;95℃10 min;95℃10 s，60℃20 s，72℃34 s，40個循環(huán)。7500熒光定量PCR儀(Ambion)上機，反應(yīng)結(jié)束后，立即進行擴增曲線和融解曲線分析，由公式2-ΔΔCt計算各目的基因與內(nèi)參照基因相對表達量。實驗重復(fù)3次。

3.2 Western blotting和免疫熒光細胞化學(xué)染色離心收集對數(shù)生長期狀態(tài)良好細胞。采用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，進行10%SDS-PAGE，100 mA電轉(zhuǎn)PVDF膜2 h，5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h。用Ⅰ抗稀釋液按1∶10 000稀釋c-myb抗體，1∶500稀釋β-actin抗體，抗體和PVDF膜4℃孵育過夜。1∶5 000稀釋山羊抗兔lgG/辣根酶標記Ⅱ抗和1∶5 000稀釋山羊抗鼠IgG/辣根酶標記Ⅱ抗，孵育1 h，增強化學(xué)發(fā)光顯影。共聚焦顯微鏡免疫熒光細胞化學(xué)染色操作步驟:收集懸浮培養(yǎng)細胞后洗滌并用4%多聚甲醛室溫固定20～30 min。每孔加入Triton X-100 150 μL破膜;10%羊血清(150 μL/well)封閉20 min，棄去上清，不洗;用Ⅰ抗稀釋液按1∶100稀釋兔抗c-Myb單抗;1∶100稀釋兔抗BCL6多克隆抗體;1∶100稀釋鼠抗PRDM1單抗，4℃冰箱過夜，次日室溫孵育30 min。根據(jù)Ⅰ抗屬性，每孔分別加入羊抗兔Ⅱ抗(TRITC標記)和羊抗鼠Ⅱ抗(TRITC標記)，稀釋比例均為1∶100，室溫避光孵育1 h;DAPI復(fù)染;熒光共聚焦顯微鏡(Olympus)觀察，每組細胞取5個不同高倍鏡視野觀察并計數(shù)。

3.3 Hsa-miR-150慢病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染構(gòu)建的pEZX-miR-150-EGFP重組慢病毒載體送Invitrogen公司測序，結(jié)果表明，所獲得的has-miR-150前體基因及其側(cè)翼序列與GenBank所公布的相應(yīng)序列相符，無堿基缺失及錯誤。將測序結(jié)果輸入PubMed數(shù)據(jù)庫，運用BLAST程序進行比對分析，與GenBank所公布的相應(yīng)序列has-miR-150前體基因及其側(cè)翼序列完全一致。將包膜質(zhì)粒(pMD2.G)、包裝結(jié)構(gòu)質(zhì)粒(psPAX2)和目的基因重組質(zhì)粒(感染組含有pEZX-hsa-miR-150-EGFP，即含有hsa-miR-150病毒和EGFP;未感染組僅含pEZX-EGFP，即僅含EGFP)3種質(zhì)粒，通過LipofectamineTM2000共同轉(zhuǎn)染至包裝細胞293FT中，共感染24 h，換新鮮培養(yǎng)基。感染后每天倒置熒光顯微鏡下觀察各組細胞EGFP表達情況，并計算EGFP陽性細胞的百分比。收集病毒上清;將含有重組慢病毒質(zhì)粒(感染組和未感染組)的病毒上清轉(zhuǎn)染OCI-Ly10細胞株，分別命名為Ly10-control和Ly10-miR-150組。

3.4 MTT比色法和流式細胞術(shù)將對數(shù)生長期的Ly10-miR-150和Ly10-control兩組細胞懸液分別接種到96孔板中，每種細胞每天設(shè)置5個復(fù)孔，每孔接種細胞約2×103個，觀察7 d。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。每孔加20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4～5 h，將細胞培養(yǎng)液上清棄去，每孔加入200 μL DMSO，搖床混勻約10 min;以生長時間為橫坐標，連續(xù)檢測7 d，以波長570 nm處吸光度(A)為縱坐標繪制細胞生長曲線。流式細胞術(shù)檢測細胞增殖，收取對數(shù)生長期的Ly10-control和Ly10-miR-150細胞，進行PI染色:加無水乙醇固定30 min，用冷PBS離心洗滌1次，去上清后加入DNA染液室溫30 min，上機，計算細胞增殖中各期的百分數(shù)。流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡根據(jù)Hoechst 33342/PI雙染試劑盒操作要求進行。

3.5 mRNA干擾取1 OD的干擾片段加250 μL DEPC水重懸，配成濃度為20 μmol/L，分裝后-20℃避光保存;取對數(shù)期、生長狀態(tài)良好的實驗細胞，細胞計數(shù)，用RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整至1×109/L，每孔1.5 mL接種于6孔板;實驗分為實驗組(c-myb siRNA，即含干擾片段)、空白對照組(Negative siRNA，即不含干擾片段)，每組設(shè)3個復(fù)孔;轉(zhuǎn)染過程參照LipofectamineTM2000說明書:先分別將10 μL LipofectamineTM2000和250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基混合配成A液，室溫孵育5 min，再加入到配好的B液中(10 μL實驗干擾片段稀釋液和空白對照組分別與250 μL Opti-MEM培養(yǎng)基混合)配制轉(zhuǎn)染混合液，十字法混勻，分別加至實驗細胞;48 h后收細胞提取總RNA或者蛋白。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。組間比較采用兩獨立樣本t檢驗或兩獨立樣本非參數(shù)檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 Hsa-miR-150和c-Myb在CD19+B及OCI-Ly10細胞中的表達

Real-time PCR結(jié)果顯示CD19+B淋巴細胞的hsa-miR-150表達明顯高于OCI-Ly10細胞(P＜0.01)，見圖1A。Western blotting和免疫熒光細胞化學(xué)的結(jié)果都顯示c-Myb在OCI-Ly10細胞中表達較高，而在CD19+B淋巴細胞中表達較低，見圖1B、C。

2 轉(zhuǎn)染OCI-Ly10細胞48 h后2組細胞hsa-miR-150的表達

轉(zhuǎn)染48 h后，與Ly10-control組(1.00±0.00)相比，Ly10-miR-150組中hsa-miR-150表達量(44.23± 0.81)明顯增高(P＜0.05)。

3 轉(zhuǎn)染OCI-Ly10細胞48 h后2組細胞的增殖、細胞周期和凋亡

轉(zhuǎn)染48 h后，MTT比色法結(jié)果顯示Ly10-miR-150細胞的增殖能力明顯低于Ly10-control細胞(P＜0.05)，見圖2A;流式細胞術(shù)檢測Ly10-control 和Ly10-miR-150細胞的細胞周期，計算各組細胞的增殖率［(S期+G2期)%］，Ly10-miR-150細胞的增殖率明顯低于Ly10-control細胞(P＜0.05)，見圖2B、C;Ly10-miR-150細胞的凋亡率明顯高于Ly10-control細胞(P＜0.05)，見圖2D。

Figure 1.Expression of hsa-miR-150 in OCI-Ly10 and CD19+B cell lines detected by real-time PCR(A)and expression of c-Myb protein in the 2 cell lines detected by Western blotting(B)and immunofluorescence cytochemistry(C).Mean±SD.n= 3.＊＊P＜0.01 vs OCI-Ly10.圖1 Hsa-MiR-150和c-Myb在CD19+B及OCI-Ly10細胞中的表達

Figure 2.The cell proliferation detected by MTT assay(A)and flow cytometry(B，C)，and the cell apoptosis detected by flow cytometry(D)48 h after transfection.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs Ly10-control.圖2 轉(zhuǎn)染48 h后檢測各細胞亞系的增殖和凋亡

4 轉(zhuǎn)染OCI-Ly10細胞48 h后2組細胞的B細胞分化相關(guān)基因和c-Myb的表達

Real-time PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Ly10-control細胞相比，Ly10-miR-150細胞B細胞分化相關(guān)基因的表達發(fā)生了明顯變化，PAX5和BCL6表達明顯下調(diào)(P＜0.05)，而IRF4、PRDM1和XBP1的表達顯著上調(diào)(P＜0.05)，見圖3;real-time PCR、Western blotting及免疫熒光細胞化學(xué)檢測2組細胞c-Myb的表達，與Ly10-control細胞相比，Ly10-miR-150細胞中c-Myb表達明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見圖4。

5 干擾OCI-Ly10細胞c-myb表達48 h后B細胞分化相關(guān)基因的表達

干擾片段干擾OCI-Ly10細胞c-myb表達48 h后，c-myb mRNA表達明顯下調(diào)(P＜0.05)，見圖5A。Real-time PCR和Western blotting結(jié)果顯示，干擾OCI-Ly10細胞c-myb表達48 h后BCL6表達明顯下調(diào)，而PRDM1表達明顯上調(diào)(P＜0.05)，見圖5B、C。

Figure 3.The mRNA expression of B-lymphocyte differentiationrelated genes 48 h after transfection.Mean±SD.n= 5.*P＜0.05 vs Ly10-control.圖3 轉(zhuǎn)染48 h后檢測各細胞亞系的B細胞分化相關(guān)基因的表達

Figure 4.Expression of c-Myb detected by real-time PCR(A)，Western blotting(B)and immunofluorescence cytochemistry(C)48 h after transfection.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs Ly10-control.圖4 轉(zhuǎn)染48 h后檢測各細胞亞系c-Myb的表達

Figure 5.Expression of c-myb mRNA detected by real-time PCR (A)and expression of BCL6 and PRDM1 detected by real-time PCR(B)and Western blotting(C)48 h after interfernce.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs Negative siRNA.圖5 干擾48 h后檢測c-myb mRNA表達及BCL6和PRDM1的表達

討論

1 Hsa-miR-150過表達對OCI-Ly10細胞增殖、細胞周期和凋亡的影響

miRNA是一類內(nèi)源性RNA小分子，miRNA具有高度保守性、時序性、組織細胞特異性，能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達，主要作為基因表達的負性調(diào)控因子［7］。本研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-150在DLBCL細胞系OCI-Ly10細胞中表達很弱，甚至基本不表達。為進一步探究hsa-miR-150的生物學(xué)功能，我們構(gòu)建了穩(wěn)定表達hsa-miR-150的DLBCL細胞亞系Ly10-miR-150，先運用MTT法和流式細胞術(shù)檢測新構(gòu)建的細胞亞系的增殖能力、細胞周期及凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)hsa-miR-150的表達，OCI-Ly10細胞的增殖能力明顯下降，凋亡指數(shù)顯著增加，證實hsa-miR-150具有明顯抑制彌漫大B淋巴瘤細胞系OCI-Ly10增殖、促進該瘤細胞凋亡的作用。

2 Hsa-miR-150過表達誘導(dǎo)OCI-Ly10細胞向末端B細胞方向分化

許多證據(jù)表明淋巴瘤的發(fā)生是由于正常淋巴細胞分化紊亂或分化阻滯的結(jié)果［2］。有研究證實hsamiR-150的表達水平與造血細胞的分化關(guān)系非常密切，尤其是B細胞的分化發(fā)育，隨著B淋巴細胞從祖B細胞向成熟B細胞方向分化發(fā)育，hsa-miR-150表達水平逐步升高［8］。如果我們糾正該彌漫大B淋巴瘤細胞系OCI-Ly10中hsa-miR-150的紊亂表達是否也對其瘤細胞分化產(chǎn)生影響呢?為此，我們對新構(gòu)建的細胞亞系檢測了幾個與B細胞分化密切相關(guān)基因的表達。PAX5是一個非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，在B細胞的分化中起非常重要的作用;PAX5在B細胞分化成熟過程中持續(xù)表達，但在漿細胞(末端B細胞)階段不表達，PAX5可以通過抑制PRDM1和XBP1的表達，阻止B細胞向漿細胞方向分化，維持B細胞的特征［9］;在某些淋巴瘤中，PAX5異常持續(xù)高表達有可能阻止了B細胞向漿細胞方向分化，導(dǎo)致B細胞分化阻滯或紊亂，促進腫瘤的發(fā)生［10］。BCL6是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，它可以調(diào)控生發(fā)中心B細胞的分化，是生發(fā)中心B細胞的重要標記［11］;BCL6通過抑制PRDM1的表達，阻止生發(fā)中心B細胞向漿細胞方向分化［12］;在部分DLBCL病例中，可以檢測到BCL6對p53的抑制，阻止腫瘤細胞凋亡，說明BCL6的持續(xù)高表達與淋巴瘤的發(fā)生也存在著密切關(guān)系［13］。IRF4是干擾素調(diào)控因子家族中的重要成員，它在調(diào)控B細胞向漿細胞分化中起著非常重要的作用［14］;在正常淋巴結(jié)的生發(fā)中心，IRF4和BCL6的表達相互排斥。也就是說IRF4可以抑制BCL6的表達，促使B細胞向漿細胞方向分化。XBP1是除PRDM1外另一個重要的漿細胞的免疫分化標記，隨著漿細胞的分化成熟，XBP1的表達量逐步升高; PRDM1的表達可以進一步促進XBP1的表達上調(diào)，進而促使B細胞向漿細胞方向分化［10］。總之，PAX5 和BCL6抑制B細胞向末端B細胞方向分化，而IRF4、XBP1和PRDM1促進B細胞向末端B細胞方向分化。我們的研究發(fā)現(xiàn)在OCI-Ly10細胞上調(diào)hsamiR-150后，B細胞分化相關(guān)基因PAX5、BCL6、IRF4、PRDM1和XBP-1的表達水平都發(fā)生了明顯變化:PAX5和BCL6表達水平的下調(diào)打破了腫瘤細胞的分化阻滯狀態(tài);而IRF4、PRDM1和XBP-1的表達水平上調(diào)，促進了OCI-Ly10細胞朝末端B細胞方向分化。

有研究在大鼠動物模型體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-150是通過負性調(diào)節(jié)c-Myb表達來控制pro-B向pre-B細胞分化的［8］。本課題組前期實驗結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)hsa-miR-150可以通過調(diào)控c-Myb誘導(dǎo)人類EB病毒陽性伯基特淋巴瘤細胞向末端B細胞方向分化［5］。那么在本實驗中hsa-miR-150是否是通過下調(diào)其靶基因c-myb從而打開分化開關(guān)蛋白PRDM1、誘導(dǎo)DLBCL細胞系OCI-Ly10細胞再分化的呢?本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)c-Myb在OCI-Ly10細胞過表達hsa-miR-150后無論在mRNA水平還是蛋白水平，其表達水平都明顯下調(diào)。那么OCI-Ly10細胞分化基因的明顯改變是否由于c-Myb下調(diào)引起的呢?因此，我們利用干擾片段干擾了OCI-Ly10細胞中c-myb的表達，然后在mRNA和蛋白水平分別檢測了2個最重要的分化免疫標記BCL6和PRDM1的表達。在cmyb干擾48 h后的OCI-Ly10細胞，BCL6的表達顯著下調(diào)，同時分化開關(guān)蛋白PRDM1的表達顯著上調(diào)，呈現(xiàn)了與過表達hsa-miR-150相似的結(jié)果。這表明過表達hsa-miR-150可以誘導(dǎo)OCI-Ly10細胞朝末端B細胞方向再分化，其機制可能與下調(diào)其靶基因c-myb的表達有關(guān)。

綜上所述，hsa-miR-150對DLBCL細胞系OCILy10細胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用非常顯著，過表達hsa-miR-150可以誘導(dǎo)該瘤細胞朝末端B細胞方向再分化，其機制可能與下調(diào)其靶基因c-myb的表達有關(guān)。本研究結(jié)果為后續(xù)探究hsa-miR-150在侵襲性B細胞淋巴瘤分化中的作用機制提供了更多的信息。

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Over-expression of hsa-miR-150 induces re-differentiation of diffuse large B-cell lymphoma cell line OCI-Ly10

YAN Jin-hai，WANG Zhi-qiang，HAN Xi-qun，CHEN Shao-hong，ZHOU Xin-hua，JIAN Wen-jing，GE Juan，ZHAO Tong
(Department of Pathology，Nanfang Hospital，Department of Pathology，School of Basic Medical Science，Southern Medical University，Guangzhou 510515，China.E-mail:zhaotongketizu@126.com)

AIM:To investigate the mechanism that over-expression of hsa-miR-150 induces the re-differentiation of diffuse large B-cell lymphoma cell line OCI-Ly10.METHODS:The expression level of hsa-miR-150 in CD19+B and OCI-Ly10 cell lines was detected by real-time PCR.The expression level of c-Myb was detected by Western blotting and immunofluorescence cytochemistry methods.Lentiviral supernatant containing recombinant plasmids was transfected into OCI-Ly10 cells by LipofectamineTM2000 and named Ly10-control and Ly10-miR-150.The biological functions of the 2 cell sublines were identified by MTT assay.The cell cycle and apoptotic rates were detected by flow cytometry.The expression levels of B-lymphocyte differentiation-related genes and c-myb in Ly10-control and Ly10-miR-150 cells were detected by real-time PCR and Western blotting.When c-myb was interfered in by interference fragment in OCI-Ly10 cells，the interference efficiency and the expression levels of BCL6 and PRDM1 were detected by real-time PCR and Western blotting.RESULTS:The expression level of hsa-miR-150 in CD19+B cells was significantly higher than that in OCI-Ly10 cells.The expression level of c-Myb in OCI-Ly10 cells was higher than that in CD19+B cells.The expression levels of B-lymphocyte differentiation-related genes were changed significantly in OCI-Ly10 cells after transfected with hsa-miR-150.The expression levels of PAX5，BCL6 and c-Myb in Ly10-miR-150 cells were lower than those in Ly10-control cells，but the expression levels of IRF4，PRDM1 and XBP1 were higher than those in Ly10-control cells.The expression level of BCL6 waslower and PRDM1 was higher after interference.CONCLUSION:Hsa-miR-150 plays a significant role in inhibiting proliferation and inducing apoptosis of OCI-Ly10 cells.The mechanism that over-expression of hsa-miR-150 induces OCI-Ly10 cell differentiation toward terminal B cells may be related to the down-regulation of c-myb.

Diffuse large B-cell lymphoma;Differentiation;Hsa-miR-150;Genes，c-myb

R329.21

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.006

1000-4718(2014)02-0226-07

2013-10-11

2013-12-23

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81272634)

△通訊作者Tel:020-61648228;E-mail:zhaotongketizu@126.com