孫艷香， 袁 勇， 馮 力， 廖玉華， 朱 峰

(1中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東中山 528400;

2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北武漢 430022)

·短篇論著·

原發(fā)性高血壓患者中抗α1腎上腺素受體自身抗體激活大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)NF-κB*

孫艷香1△， 袁 勇1， 馮 力1， 廖玉華2， 朱 峰2

(1中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東中山 528400;

2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管內(nèi)科，湖北武漢 430022)

目的：探討高血壓患者血清中抗α1腎上腺素受體自身抗體(autoantibodies against α1-adrenergic receptor，α1-AAs)擬去甲腎上腺素的激動(dòng)樣效應(yīng)及胞內(nèi)信號(hào)分子活化機(jī)制。方法：培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞。將收集的原發(fā)性高血壓病人血清進(jìn)行免疫親和層析法純化，ELISA檢測(cè)其滴度后以1∶80刺激細(xì)胞，并設(shè)立不同的處理組。將α1-AAs刺激大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞后，經(jīng)Western blotting及免疫熒光方法分析胞內(nèi)核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)信號(hào)分子激活及表達(dá)狀況。結(jié)果：Western bltting顯示α1-AAs刺激組中胞內(nèi)核因子NF-κB (p50)表達(dá)較空白對(duì)照組明顯增強(qiáng)，且可被α1受體阻滯劑哌唑嗪和NF-κB拮抗劑PDTC明顯抑制(P＜0.05)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，α1-AAs組熒光強(qiáng)度顯著高于空白對(duì)照組和α1-AAs+哌唑嗪組(P＜0.01)。結(jié)論：高血壓患者血清中α1-AAs能夠致大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞NF-κB活化。

高血壓;α1腎上腺素受體;自身抗體;NF-κB

α1腎上腺素受體(α1-adrenergic receptor)在人體許多生理調(diào)控過程中起到重要的作用，尤其是在心血管活動(dòng)中，其中包括對(duì)平滑肌收縮、心肌變時(shí)和變力以及血壓的調(diào)節(jié)［1］。同時(shí)，已有報(bào)道在原發(fā)性高血壓、惡性高血壓及難治性高血壓患者血清中發(fā)現(xiàn)抗 α1腎上腺素受體自身抗體(autoantibodiesagainst α1-adrenergic receptor，α1-AAs)的存在［2-3］。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該自身抗體可導(dǎo)致動(dòng)物心肌細(xì)胞肥厚和細(xì)胞間質(zhì)的增加［4］，且后來的臨床統(tǒng)計(jì)也發(fā)現(xiàn)高血壓患者中 α1-AAs參與了高血壓患者左心室重構(gòu)［5］。而眾多研究并未闡明α1-AAs介導(dǎo)的胞內(nèi)分子機(jī)制，因此本研究主要探討該自身抗體對(duì)血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子及炎癥因子NF-κB的激活情況。

材料和方法

1 病例及試劑

參照2010年中國高血壓防治指南高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)。血標(biāo)本抗凝后離心取上清，選取經(jīng)檢測(cè)后α1-AAs陽性的原發(fā)性高血壓患者(24例)血清。培養(yǎng)基DMEM及新生牛血清購自 Gibco;BSA、CNBr-Sepharose、HRP-IgG及NC膜購自武漢凌飛公司;抗NF-κB(p50)抗體及 β-actin均購自 Cell Signaling;哌唑嗪 (prasozin，PN)和吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)購自Sigma。

2 α1-AAs的檢測(cè)及純化

用ELISA［6］檢測(cè)自身抗體滴度，即:多肽合成儀人工合成人α1腎上腺素受體胞外第2肽段(192～218 aa)［6］，將合成的α1腎上腺素受體抗原肽包被96孔酶聯(lián)板，純化后的α1-AAs為I抗并以不同稀釋倍數(shù)(1∶40、1∶80和1∶160)稀釋，IgG-HRP為酶標(biāo)II抗，TMB/H2O2顯色，于450 nm波長測(cè)定吸光度(A)。實(shí)驗(yàn)中設(shè)立空白對(duì)照和陰性對(duì)照，測(cè)A值時(shí)以空白對(duì)照調(diào)零。抗體定性判斷以P/N≥2.1為陽性［P/N=(標(biāo)本血清組A值-空白對(duì)照A值)/(陰性對(duì)照組A值-空白對(duì)照A值)］。以親和層析法純化血清中的自身抗體，具體步驟可參考本課題組以前的相關(guān)文獻(xiàn)資料［7］。

3 細(xì)胞培養(yǎng)及免疫印跡檢測(cè)

Wistar雄性大鼠經(jīng)頸總動(dòng)脈放血后，在無菌條件下迅速取出胸主動(dòng)脈行組織塊法培養(yǎng);原代細(xì)胞經(jīng)α2-actin鑒定呈陽性染色。細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后用α1-AAs 1∶80滴度進(jìn)行刺激并分組，后提取蛋白，并按BCA法測(cè)定各樣本蛋白濃度。將樣品加入上樣緩沖液煮沸10 min后上樣。以200 V、10%的SDS-PAGE分離膠電泳40 min，100 V轉(zhuǎn)膜45 min。用5%脫脂奶粉封閉1 h后洗膜15 min×3，加I抗4℃孵育過夜。再洗膜15 min×3，II抗室溫孵育1 h。洗膜15 min×3后ECL發(fā)光。

4 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞爬片后在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后分3組進(jìn)行刺激，分別為空白對(duì)照組、α1-AAs刺激組及先PN抑制后加用α1-AAs刺激組。取出細(xì)胞爬片后用PBS洗細(xì)胞2次并吸干，用丙酮在冰上固定10～15 min，然后用0.1%Triton X-100透化固定細(xì)胞1 min，PBS洗3次;以1∶100加入抗NF-κB(p50)I抗(用5%BSA/PBS稀釋)室溫孵育2 h，再用PBS洗細(xì)胞3次加入熒光標(biāo)記的II抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育1 h，在熒光顯微鏡下照相。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 10.0軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間比較采用ANOVA分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 血管平滑肌細(xì)胞鑒定結(jié)果

顯微鏡下可見細(xì)胞呈典型的“峰-谷”樣生長，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示細(xì)胞內(nèi) α2-actin呈陽性，見圖1。

Figure 1.The identification of rat VSMCs by immunocytochemistry(×400).圖1 大鼠血管平滑肌細(xì)胞的鑒定

2 α1-AAs刺激平滑肌細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子NF-κB的激活及核轉(zhuǎn)移

不同處理組細(xì)胞的裂解蛋白經(jīng)Western blotting，結(jié)合圖形灰度分析可看出:α1-AAs刺激組NF-κB較α1-AAs+PN、α1-AAs+PDTC及空白對(duì)照組表達(dá)明顯增高(P＜0.05)，而稍弱于去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)組(P＞0.05)，見圖2。這表明在α1-AAs可導(dǎo)致胞內(nèi)分子NF-κB的激活，并被α1受體拮抗劑PN和NF-κB特異性阻滯劑PDTC所抑制。

進(jìn)一步用抗NF-κB抗體通過細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)其在不同處理組間細(xì)胞核內(nèi)分子的表達(dá)情況:對(duì)照組細(xì)胞中NF-κB主要存在于胞漿及很少一部分位于胞核周邊;α1-AAs刺激30 min后，NF-κB表達(dá)逐漸趨于核周間隙，核內(nèi)表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組(P＜0.01);而先用α1受體拮抗劑PN作用后再加α1-AAs刺激則核內(nèi)NF-κB分子表達(dá)量顯著下降(P＜0.01)，見圖3。上述結(jié)果表明α1-AAs能促進(jìn)胞內(nèi)NF-κB p50向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，且被α1受體拮抗劑所拮抗。

Figure 2.The activation of NF-κB(p50)in response to α1-AAs.PN:prazosin(1 μmol/L);PDTC:pyrrolidine dithiocarbamate(0.1 mmol/L);NE:norepinephrine (100 μmol/L).Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs control，α1-AAs+PN and α1-AAs+PDTC.圖2 NF-κB分子在平滑肌細(xì)胞內(nèi)的激活情況

Figure 3.The expression of NF-κB(p50)in VSMCs in different groups detected by immunofluorescence(×400).MFI:mean fluorescence intensity.Mean±SD.n= 5.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs α1-AAs.圖3 免疫熒光細(xì)胞染色顯示NF-κB(p50)在胞核內(nèi)的表達(dá)

討論

近年來，免疫因素在高血壓的發(fā)病中起到越來越重要的作用，其中自身抗體在高血壓患者中的研究較多。Fu等［2］首先在惡性高血壓患者血清中發(fā)現(xiàn)α1-AAs的存在;后在原發(fā)性高血壓患者血清中也檢測(cè)到該抗體［3］。α1受體屬G蛋白偶聯(lián)受體超家族，在機(jī)體心血管的調(diào)節(jié)中起著十分重要的作用。α1-AAs具有類似去甲腎上腺素樣激動(dòng)性作用，可能參與高血壓的發(fā)生發(fā)展及其所致靶器官的損害，且由于該抗體在惡性高血壓及難治性高血壓病人血清中的檢出率可達(dá)到25.3%［8］，所以闡明該抗體作用于血管平滑肌細(xì)胞胞內(nèi)信號(hào)分子機(jī)制的激活情況很有必要。

NF-κB分子是大多數(shù)炎癥因子及活性物質(zhì)發(fā)揮生物作用的通路，由p50和p65兩個(gè)亞基組成，靜止?fàn)顟B(tài)下與抑制性蛋白IκB結(jié)合，當(dāng)細(xì)胞在受某些刺激后則與 IκB分離而轉(zhuǎn)入胞核從而調(diào)控基因表達(dá)［9-10］。NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路常見且已有研究報(bào)道該分子參與多種細(xì)胞增殖及抗凋亡的調(diào)控［11］?；罨腘F-κB可單獨(dú)或與其它轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同，對(duì)眾多基因尤其是涉及炎癥和免疫反應(yīng)等方面的基因表達(dá)起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用［12］，從而誘導(dǎo)許多因子的轉(zhuǎn)錄。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示α1-AAs刺激大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞后可致胞內(nèi)NF-κB分子活化且向核內(nèi)轉(zhuǎn)移及表達(dá)量增加，顯著高于哌唑嗪或PDTC拮抗組及空白對(duì)照組，而稍低于去甲腎上腺素刺激組，表明NF-κB信號(hào)分子途徑的激活參與了α1-AAs所致的激動(dòng)樣效應(yīng)，從而可能介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖、血管炎性反應(yīng)及心血管重構(gòu)等。但從結(jié)果中也可看到，NF-κB特異性受體拮抗劑PDTC和α1受體拮抗劑哌唑嗪并不能完全抑制該自身抗體刺激后細(xì)胞內(nèi)NF-κB分子的表達(dá)，從而可以推測(cè)NF-κB分子的激活可能只是該激動(dòng)性自身抗體作用于自身受體后介導(dǎo)的胞內(nèi)活化信號(hào)分子通路之一。

至于α1-AAs的產(chǎn)生機(jī)制，推測(cè)該抗體可能產(chǎn)生于高血壓引起血管損傷后的免疫反應(yīng)，由于血管損傷，內(nèi)源性抗原暴露，使α1受體的抗原性發(fā)生改變，激活自身反應(yīng)性T細(xì)胞，從而產(chǎn)生自身抗體;我們課題組也報(bào)道其產(chǎn)生與其受體基因多態(tài)性相關(guān)，可能是環(huán)境與遺傳因素共同作用的結(jié)果［13-14］。

總之，本實(shí)驗(yàn)顯示原發(fā)性高血壓患者血清中激動(dòng)性α1-AAs可能通過激活血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)NF-κB分子而調(diào)節(jié)下游信號(hào)分子的表達(dá)，結(jié)合前述的其它信號(hào)途徑如該自身抗體與受體結(jié)合后促使AP-1激活并誘導(dǎo)原癌基因c-jun和c-fos表達(dá)［6］，從而一起介導(dǎo)細(xì)胞增殖和血管炎癥反應(yīng)的發(fā)生。對(duì)該信號(hào)機(jī)制的研究進(jìn)一步在分子水平上奠定了免疫機(jī)制在高血壓病中的作用，并為α1-AAs所致的類似NE激動(dòng)樣效應(yīng)提供了理論依據(jù);同時(shí)我們可以通過對(duì)NF-κB通路的調(diào)節(jié)為臨床抗血管炎癥及其所致的血管重塑、靶器官重構(gòu)提供新的治療思路。

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Activation of NF-κB in rat vascular smooth muscle cells by autoantibodies against α1-adrenergic receptor from hypertensive patients

SUN Yan-xiang1，YUAN Yong1，F(xiàn)ENG Li1，LIAO Yu-hua2，ZHU Feng2
(1Department of Cardiovascular Medicine，Zhongshan Hospital，Sun Yat-sen University，Zhongshan 528400，China;2Department of Cardiology，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China.E-mail:syx1298509@163.com)

AIM:To study the effects of autoantibodies against α1-adrenergic receptor(α1-AAs)isolated from the hypertensive patients，which showed the agonist-like activity similar to norepinephrine，on the signal mechanism of vascular smooth muscle cells(VSMCs)isolated from rat thoracic aorta.METHODS:Rat VSMCs were cultured and identified.The serum of hypertensive patients was purified by immunoaffinity chromatography.The autoantibodies were detected by ELISA and used to activate the cells with the titer of 1∶80.The total protein was extracted and the expression of NF-κB in different treatment groups was detected by Western blotting.Meanwhile，the activation of NF-κB in the nucleus was analyzed by immunofluorescence method.RESULTS:The expression of NF-κB in VSMCs was obviously higher in α1-AAs group than that in control group.Meanwhile，the expression of NF-κB was inhibited by prasozin and PDTC.The autoantibodies caused a significant increase in NF-κB expression in the nucleus.The fluorescence intensity in α1-AAs group was high than that in control group and α1-AAs+prasozin group(P＜0.01).CONCLUSION:The α1-AAs from hypertensive patients increase NF-κB expression in rat VSMCs.

Hypertension;α1-adrenergic receptors;Autoantibody;NF-kappa B

R543

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.022

1000-4718(2014)03-0514-04

2013-09-18

2013-12-24

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.C03030201);中國博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.20100470982)

△通訊作者Tel:0760-89880246;E-mail:syx1298509@163.com