王 巖， 郭永川， 梁前壘， 李朝暉， 董志恒△

(1北華大學(xué)病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，吉林吉林 132021;2吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)外二科，吉林長(zhǎng)春 130031)

參麥注射液對(duì)糖尿病心肌病大鼠心肌纖維化的干預(yù)作用及相關(guān)機(jī)制探討

王 巖1， 郭永川2， 梁前壘2， 李朝暉2， 董志恒1△

(1北華大學(xué)病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，吉林吉林 132021;2吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院神經(jīng)外二科，吉林長(zhǎng)春 130031)

目的：探討參麥注射液對(duì)糖尿病心肌病心肌纖維化的干預(yù)作用并初步探討其機(jī)制。方法：將30只Wistar大鼠分為對(duì)照組、糖尿病組以及治療組，每組各10只。采用鏈脲佐菌素單次腹腔注射的方法制作大鼠糖尿病模型，以枸櫞酸緩沖液腹腔注射為對(duì)照，治療組則采用腹腔注射的方式給予參麥注射液干預(yù)治療。采用心室插管對(duì)大鼠心功能進(jìn)行評(píng)估;Masson染色觀察大鼠心臟組織中膠原水平;二氫乙啶染色觀察大鼠心臟組織中活性氧(ROS)水平;Western blotting觀察大鼠心肌組織中I型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)以及金屬蛋白酶組織抑制劑2(TIMP-2)的表達(dá)水平。結(jié)果：與對(duì)照組相比，糖尿病組心功能顯著下降(P＜0.05);而治療組心功能則顯著恢復(fù)(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，糖尿病組心肌組織ROS及膠原生成水平顯著升高(P＜0.05)，但經(jīng)參麥注射液治療后均顯著降低(P＜0.05)。與對(duì)照組相比，糖尿病組I型膠原及TIMP-2表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)，而MMP-2水平顯著降低(P＜0.05);與糖尿病組相比，治療組I型膠原及TIMP-2水平顯著降低(P＜0.05)，而MMP-2水平則顯著升高(P＜0.05)。結(jié)論：參麥注射液可能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激損傷而減輕糖尿病心肌病心肌纖維化程度。

參麥注射液;糖尿病心肌病;纖維化;氧化性應(yīng)激

心功能不全是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，以心肌肥 厚以及心肌纖維化為病理改變特征，心功能惡化常表現(xiàn)為心臟收縮、舒張功能的全面降低以及各種類型的心律失常。這種糖尿病所伴發(fā)的特異性心肌病被稱為糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)［1］。目前研究表明，在體內(nèi)高糖環(huán)境下，葡萄糖對(duì)線粒體的持續(xù)氧化可導(dǎo)致體內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的大量產(chǎn)生，體內(nèi)氧化-還原平衡被破壞，進(jìn)而激活基質(zhì)金屬蛋白酶類(matrix metalloproteinases，MMPs)，后者在心肌纖維化、心臟重塑等病理變化中扮演重要的角色［2］。參麥注射液的主要成分為紅參及麥冬，具有補(bǔ)心復(fù)脈、養(yǎng)陰生津等功效，研究表明其具有一定的抗氧化活性［3］。本研究采用參麥注射液對(duì)DCM大鼠模型進(jìn)行干預(yù)，探討其對(duì)DCM產(chǎn)生治療效果的機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物分組及動(dòng)物模型制作

選擇30只6周齡雄性Wistar大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行研究，體重190～220 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在22～25℃清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行分籠飼養(yǎng)，人工照明，12 h晝夜交替1次，大鼠均自由進(jìn)食、飲水。將大鼠平均隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為對(duì)照組、糖尿病組及治療組。采用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)腹腔注射法制作糖尿病動(dòng)物模型，STZ(溶解于pH 4.5 0.1 mmol/L枸櫞酸緩沖液中，制成1%STZ溶液)30 mg/kg進(jìn)行單次腹腔注射，72 h后經(jīng)由尾靜脈取血，測(cè)血糖濃度≥16.7 mmol/L視為糖尿病動(dòng)物模型建立成功。對(duì)照組則采用相同劑量的枸櫞酸緩沖液進(jìn)行單次腹腔注射。治療組在糖尿病動(dòng)物模型建立成功后，給予參麥注射液(每支10 mL，四川升和藥業(yè)股份有限公司)8 mL/kg腹腔注射，每天1次，連續(xù)注射40 d。

2 觀察指標(biāo)

2.1 心功能檢測(cè) 本研究心功能檢測(cè)采用左心室插管對(duì)大鼠心功能進(jìn)行評(píng)估。使用器材包括Power-Lab 4/25型生物信息采集系統(tǒng)(AD Instruments);壓力換能器(Miller)。首先向大鼠尾靜脈內(nèi)注射肝素(0.3%，2 mg/kg)進(jìn)行肝素化，然后使用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉，固定大鼠，頸正中切口鈍性分離出右頸總動(dòng)脈，將遠(yuǎn)心端活結(jié)結(jié)扎，鉗夾近心端后，將動(dòng)脈壁剪開一個(gè)小口，插入與壓力換能器相連的導(dǎo)管，松開結(jié)扎線，將導(dǎo)管送入左心室，穩(wěn)定數(shù)分鐘后，測(cè)定大鼠的左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure，LVEDP)、左室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左室壓力最大上升或下降速率(left ventricular pressure maximum rise/fall velocity，LV ±dp/dt)。

2.2 心肌組織ROS產(chǎn)生水平 采用脫頸法將大鼠處死，固定4肢，無(wú)菌打開胸腔，取出心臟，PBS中輕輕沖洗并擠出心腔內(nèi)的殘血，修剪心臟后置入液氮中速凍。速凍的組織使用 OCT冰凍切片包埋劑(Sakura)進(jìn)行包埋后，在-20℃下制成厚度為10 μm的連續(xù)冰凍切片。采用二氫乙啶(dihydroethidium，DHE;10 μmol/L，碧云天生物技術(shù)研究所)對(duì)制成的冰凍切片在37℃下孵育45 min，熒光顯微鏡(Olympus)下進(jìn)行觀察并采集圖片，并使用Image-Pro Plus 5.0軟件進(jìn)行分析。

2.3 心肌組織Masson染色 將收集的心臟標(biāo)本采用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋后制成厚度為4 μm的石蠟切片。脫蠟后蘇木素染色5 min，鹽酸乙醇分化，洗滌后用麗春紅酸性品紅溶液染色5 min，迅速水洗后在1%磷鉬酸中染色3 min，又在甲苯胺藍(lán)中染色5 min后水洗烘干，樹膠封片后觀察。采用顯微鏡(Nikon Eclipse 80i)對(duì)所得切片進(jìn)行觀察并經(jīng)NIS-Elements BR軟件進(jìn)行圖像采集。使用Image-Pro Plus軟件對(duì)獲得的圖片進(jìn)行分析，計(jì)算膠原纖維染色面積占組織切片面積的分?jǐn)?shù)，即膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction，CVF)。

2.4 心肌組織I型膠原、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)和金屬蛋白酶組織抑制劑2(tissue inhibitor of metalloproteinase 2，TIMP-2)表達(dá)水平 用Western blotting對(duì)心肌組織中I型膠原、MMP-2以及TIMP-2蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。在冰上將待測(cè)組織預(yù)冷，將組織剪碎，使用RIPA(Santa Cruz)懸浮組織，在冰上使用勻漿器對(duì)組織進(jìn)行研磨，將勻漿液4℃下82 000 r/min離心45 min，留取上清蛋白，BCA法對(duì)獲得的蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定，向蛋白樣本中加入等量1×loading buffer，100℃變性5 min。將樣本進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將目的條帶電轉(zhuǎn)印法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，10%脫脂牛奶封閉1 h，分別采用兔抗大鼠I型膠原(Abcam)、兔抗大鼠MMP-2 (Santa Cruz)以及兔抗大鼠TIMP-2(Santa Cruz)4℃孵育過(guò)夜。充分洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgGⅡ抗(工作濃度1∶5 000)室溫孵育2 h后進(jìn)行充分洗滌，最后以Super Signal West Pico化學(xué)熒光發(fā)光試劑盒(Thermo)對(duì)檢測(cè)蛋白進(jìn)行顯影，X膠片曝光后采用Image-Pro Plus 5.0軟件分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 18.0軟件包分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異應(yīng)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 各組大鼠心功能比較

與對(duì)照組相比，糖尿病組心功能明顯受損，表現(xiàn)為L(zhǎng)VEDP顯著升高，同時(shí)LVSP和LV+dp/dt顯著降低(P＜0.05);而與糖尿病組相比，治療組心功能得到改善，表現(xiàn)為L(zhǎng)VEDP降低，LVSP和LV±dp/dt顯著升高(P＜0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組左心室插管心功能檢測(cè)結(jié)果Table 1.Cardiac function detection in different groups by left ventricular intubation(Mean±SD.n=10)

2 各組大鼠心肌組織ROS水平比較

與對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠心肌組織內(nèi)ROS生成水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);而經(jīng)過(guò)參麥注射液處理的治療組，心肌組織內(nèi)ROS水平較糖尿病組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.DHE staining of cardiac tissue from each group(×200).Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs diabetes group.圖1 各組大鼠心肌組織ROS生成水平比較

3 各組大鼠心肌組織膠原纖維染色

Masson染色見(jiàn)膠原纖維呈現(xiàn)藍(lán)染，正常細(xì)胞則呈現(xiàn)紅染。對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊、致密，心肌細(xì)胞間少有膠原纖維;糖尿病組心肌細(xì)胞排列松散、紊亂，心肌細(xì)胞肥大、腫脹，心肌細(xì)胞間及血管周圍可見(jiàn)呈堆積狀分布的膠原纖維;治療組心肌細(xì)胞排列趨于整齊，腫脹減輕，且膠原纖維成分較糖尿病組明顯減少，見(jiàn)圖2。

4 各組大鼠心肌組織collagen I、MMP-2及TIMP-2表達(dá)

Western blotting發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，糖尿病組collagen I及TIMP-2表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05)，而MMP-2水平顯著降低(P＜0.05);與糖尿病組相比，治療組collagen I及TIMP-2水平顯著降低(P＜0.05)，而MMP-2水平則顯著升高(P＜0.05)，見(jiàn)圖3。

Figure 2.Masson staining of cardiac tissue in each group(×200).Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs diabetes group.圖2 各組大鼠心肌組織Masson染色

討論

在當(dāng)今社會(huì)，隨著生活水平的提高及生活方式的改變，2型糖尿病的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年顯著升高的趨勢(shì)。糖尿病心肌病是糖尿病的重要慢性并發(fā)癥，其發(fā)病與糖尿病的代謝紊亂相關(guān)，主要病理改變?yōu)樾募〖?xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)堆積、心肌肥厚及心肌間質(zhì)纖維化等。其中心肌纖維化是糖尿病心肌病的重要特征，心肌間質(zhì)中膠原大量沉著，能夠降低心臟順應(yīng)性從而影響心臟的收縮及舒張功能［4］。本研究采用STZ單次腹腔注射的方法制作糖尿病模型，建模成功后采用左心室插管的方法對(duì)大鼠心功能進(jìn)行評(píng)估。發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠LVEDP顯著升高，LVSP和LV ±dp/dt顯著降低，說(shuō)明糖尿病大鼠出現(xiàn)心功能不全，可視為糖尿病心肌病。本研究還通過(guò)Masson染色發(fā)現(xiàn)，糖尿病組大鼠心肌間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量膠原堆積，進(jìn)一步證實(shí)糖尿病心肌病伴隨心肌間質(zhì)的膠原堆積伴發(fā)心肌纖維化。

MMPs對(duì)ECM具有很強(qiáng)的降解作用，MMPs家族中MMP-2與MMP-9屬于明膠酶，在心肌組織中表達(dá)水平較高，是心肌內(nèi)抗纖維化的重要成分［5］。TIMPs也為內(nèi)源性，可對(duì)MMPs產(chǎn)生特異性抑制作用，該抑制活性通過(guò)其與MMPs共價(jià)結(jié)合實(shí)現(xiàn)，在TIMPs家族中，TIMP-2對(duì)MMPs的抑制作用最強(qiáng)。目前研究已經(jīng)證實(shí)，MMP-2表達(dá)水平的降低及TIMP-2表達(dá)水平的升高參與了糖尿病大鼠心肌纖維化的進(jìn)程［6］。研究表明，高血糖狀態(tài)機(jī)體內(nèi)會(huì)堆積大量的ROS，后者會(huì)對(duì)正常組織造成氧化應(yīng)激損傷。過(guò)量產(chǎn)生的ROS在體內(nèi)能夠通過(guò)增加核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)等信號(hào)通路的活化程度，激活TIMPs/抑制MMPs，從而參與糖尿病心肌病纖維化的發(fā)病過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠心肌組織內(nèi)ROS生成水平顯著增加，同時(shí)心肌組織膠原含量增加，MMP-2表達(dá)水平顯著降低，而TIMP-2表達(dá)水平顯著升高，從而說(shuō)明MMP-2、TIMP-2參與糖尿病心肌纖維化的過(guò)程，但其具體機(jī)制仍有待深入探討。

Figure 3.Expression of collagen I，TMIP-2 and MMP-2 in cardiac tissue from each group.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs diabetes group.圖3 各組大鼠心肌組織I型膠原、MMP-2及TIMP-2的表達(dá)

參麥注射液有效成分來(lái)源于紅參及麥冬2味中藥，其有效成分人參皂苷具有清除自由基、抗氧化應(yīng)激損傷的生物學(xué)活性。其中人參皂苷Rg1能夠提高體內(nèi)多種氧化酶的活性，人參皂苷Rb1則能夠通過(guò)改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)皮質(zhì)醇的分泌等維護(hù)體內(nèi)氧化-還原平衡［7］。本研究對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行參麥注射液腹腔注射，能夠顯著改善糖尿病大鼠心功能。心臟DHE染色發(fā)現(xiàn)其心肌組織內(nèi)ROS水平較糖尿病大鼠顯著降低，Masson染色及I型膠原表達(dá)水平降低，表明心肌組織內(nèi)膠原含量顯著下降;同時(shí)發(fā)現(xiàn)與糖尿病大鼠相比，參麥注射液干預(yù)后能使其心肌組織內(nèi)MMP-2表達(dá)水平上升，其抑制劑TIMP-2表達(dá)水平下降。從以上結(jié)果不難看出，參麥注射液可能是通過(guò)其抗氧化活性抑制糖尿病心肌病纖維化的程度，可能通過(guò)激活MMPs/抑制TIMPs降低心肌組織膠原含量，從而發(fā)揮對(duì)糖尿病心臟的保護(hù)作用。

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Effects of Shenmai injection on myocardial fibrosis in rat model of diabetic cardiomyopathy

WANG Yan1，GUO Yong-chuan2，LIANG Qian-lei2，LI Zhao-hui2，DONG Zhi-heng1
(1Department of Pathology and Pathophysiology，Beihua University，Jilin 132021，China;2Department of Neurosurgery，China-Japan Union Hospital，Jilin University，Changchun 130031，China.E-mail:liangqianlei169@sina.com)

AIM:To explore the effects of Shenmai injection on myocardial fibrosis in a rat model of diabetic cardiomyopathy(DCM).METHODS:Wistar rats(n=30)were randomly divided into control group，diabetes group and treatment group.Single intraperitoneal injection of streptozotocin was utilized to establish a rat model of DCM.The rats with DCM in treatment group were intraperitoneally injected with Shenmai injection.Ventricular cannulation was applied to assess the cardiac functions.The formation of collagen in the cardiac tissues was assessed by Masson staining.The generation of reactive oxygen species(ROS)in the cardiac tissues was detected by dihydroethidium staining.The expression levels of matrix metalloproteinase 2(MMP-2)，tissue inhibitor of metalloproteinase 2(TIMP-2)and collagen I in the cardiac tissues were determined by Western blotting.RESULTS:Compared with control group，the cardiac functions were deteriorated in diabetes group(P＜0.05)，which was improved in treatment group as compared with diabetes group(P＜0.05).Compared with control group，the formation of collagen and ROS increased significantly in diabetes group(P＜0.05)，which was decreased in treatment group as compared with diabetes group(P＜0.05).Compared with control group，the expression level of MMP-2 in the cardiac tissues was deceased and TIMP-2 was increased significantly in diabetes group(P＜0.05)，but reversed significantly in treatment group(P＜0.05).CONCLUSION:Shenmai injection attenuates cardiac fibrosis in the rats with DCM by inhibiting the generation of ROS.

Shenmai injection;Diabetic cardiomyopathies;Fibrosis;Oxidative stress

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.012

1000-4718(2014)03-0449-05

2013-08-08

2014-01-14

△通訊作者Tel:0431-84995981;E-mail:liangqianlei169@sina.com