劉付貞， 陳景福， 潘德茂， 田麗紅， 郭潤民， 游 瓊， 吳 鏗△

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1內(nèi)分泌科，2心內(nèi)科，廣東湛江524001;3中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)內(nèi)科，廣東廣州 510700)

柚皮苷通過抑制瘦素通路對(duì)抗高糖引起的心肌細(xì)胞損傷*

劉付貞1， 陳景福2， 潘德茂3， 田麗紅2， 郭潤民2， 游 瓊2， 吳 鏗2△

(廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院1內(nèi)分泌科，2心內(nèi)科，廣東湛江524001;3中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院黃埔院區(qū)內(nèi)科，廣東廣州 510700)

目的：探討柚皮苷能否通過抑制瘦素通路保護(hù)H9c2心肌細(xì)胞，對(duì)抗高糖HG引起的損傷。方法：應(yīng)用Western blotting法檢測(cè)瘦素及瘦素受體(LEPR)的表達(dá)水平;細(xì)胞計(jì)數(shù)盒(CCK-8)測(cè)定細(xì)胞存活率;Hoechst 33258核染色熒光顯微鏡照相測(cè)定凋亡細(xì)胞的形態(tài)及數(shù)量的變化;雙氯熒光素(DCFH-DA)染色熒光顯微鏡照相法檢測(cè)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平;羅丹明123染色法測(cè)定線粒體膜電位(MMP)。結(jié)果：應(yīng)用35 mmol/L葡萄糖(HG)處理H9c2心肌細(xì)胞6～24 h能上調(diào)瘦素表達(dá)，其中9 h時(shí)表達(dá)最多;HG處理心肌細(xì)胞1～24 h也能促進(jìn)LEPR表達(dá)，其中12 h時(shí)表達(dá)最多;在HG處理心肌細(xì)胞前，80 μmol/L柚皮苷預(yù)處理2 h能明顯抑制HG對(duì)瘦素及LEPR表達(dá)的上調(diào)作用;柚皮苷預(yù)處理2 h、瘦素拮抗劑預(yù)處理24 h或瘦素受體拮抗劑預(yù)處理2 h均能抑制HG引起的心肌細(xì)胞損傷，使細(xì)胞存活率增多，凋亡細(xì)胞數(shù)量和胞內(nèi)ROS生成減少，MMP回升。結(jié)論：柚皮苷可通過抑制瘦素通路保護(hù)H9c2心肌細(xì)胞，對(duì)抗HG引起的損傷。

柚皮苷;瘦素;受體，瘦素;高血糖;心肌細(xì)胞

柚皮苷(naringin，NRG)，又稱柚甙、柑橘甙、異橙皮甙，是一種雙氫黃酮類化合物，主要存在于葡萄柚和酸橙等的果皮和果實(shí)中。此外，柚皮苷也是中藥化橘紅、骨碎補(bǔ)等的主要有效成份。越來越多的研究證實(shí)，柚皮苷具有涉及面較廣的藥理和治療作用，例如，抗氧化［1-2］、抗凋亡［3］、抗炎癥［1-2，4］和降血脂［2］等。此外，柚皮苷還具有心肌保護(hù)作用［3］及降血糖作用［5］。最近，我們證實(shí)，柚皮苷可通過抑制p38絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路保護(hù)心肌細(xì)胞對(duì)抗高糖引起的損傷［3］。另方面，有報(bào)道指出，p38 MAPK的上游信號(hào)分子瘦素(leptin)參與糖尿病引起的心肌細(xì)胞肥厚的發(fā)生［6］。但是，瘦素是否參與高糖引起的心肌細(xì)胞損傷(包括細(xì)胞毒性、凋亡、氧化應(yīng)激、線粒體損傷)以及柚皮苷能否通過調(diào)控瘦素通路對(duì)抗高糖引起的心肌細(xì)胞損傷尚未明了。

瘦素是一種由脂肪細(xì)胞和其它細(xì)胞(如心肌細(xì)胞)釋放的分子量為16 kD的多肽，參與食欲與能量代謝的調(diào)節(jié)［7-8］。近年，不少的報(bào)道指出，瘦素也參與高血壓內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)及心血管病患的發(fā)生［6，9-10］。瘦素是通過瘦素受體而產(chǎn)生生理與病理生理作用。瘦素受體有廣泛的組織分布，包括腎、胰腺、肺和心臟等［6，11］。但是，高糖及柚皮苷對(duì)瘦素受體表達(dá)有何影響迄今未見報(bào)道。

為了探討上述問題，本研究應(yīng)用35 mmol/L葡萄糖處理H9c2心肌細(xì)胞以建立高糖損傷心肌細(xì)胞模型［12］，旨在探討:(1)高糖處理心肌細(xì)胞不同時(shí)間對(duì)瘦素及其受體表達(dá)的影響;(2)柚皮苷對(duì)高糖誘導(dǎo)瘦素及其受體表達(dá)改變的影響;(3)柚皮苷能否通過調(diào)控瘦素-瘦素受體通路對(duì)抗高糖引起的心肌細(xì)胞損傷，為深入闡明高糖的心肌細(xì)胞損傷機(jī)制及柚皮苷的心肌保護(hù)機(jī)制提供新穎的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 材料

Naringin、DCFH-DA、Hoechst 33258、羅丹明123 (rhodamine 123，Rh123)、瘦素拮抗劑(leptin antagonist，LA)和瘦素受體拮抗劑［leptin receptor(LEPR) antagonist，ObRa］購自Sigma-Aldrich;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(cell counter kit-8，CCK-8)購自Dojindo Lab(日本);DMEM-F12培養(yǎng)基購于Hyclone;特級(jí)胎牛血清(FBS)購自Gibco;抗leptin抗體和抗LEPR抗體購自Cell Signaling technology Inc;H9c2心肌細(xì)胞由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) H9c2心肌細(xì)胞來源于大鼠胚胎期心臟組織，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)基，置于5%CO2、37℃的溫箱中培養(yǎng)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為8組:(1)正常對(duì)照(control)組;(2)高糖(high glucose，HG)損傷組;(3) NRG預(yù)處理+高糖損傷組:80 μmol/L NRG作用于H9c2心肌細(xì)胞2 h，撤去，用PBS洗2次，接著用35 mmol/L葡萄糖作用24 h;(4)LA預(yù)處理+高糖損傷組:50 μg/L LA作用于H9c2心肌細(xì)胞24 h，撤去，用PBS洗2次，接著35 mmol/L葡萄糖作用24 h;(5) ObRa預(yù)處理+高糖損傷組:25 μg/L ObRa作用于H9c2心肌細(xì)胞2 h，撤去，用PBS洗2次，接著用35 mmol/L葡萄糖作用24 h;(6)NRG組:80 μmol/L NRG作用于H9c2心肌細(xì)胞2 h;(7)LA組:50 μg/L的LA作用于H9c2心肌細(xì)胞24 h;(8)ObRa組:25 μg/L ObRa作用于H9c2心肌細(xì)胞2 h。

2.3 Western blotting法檢測(cè)瘦素和瘦素受體蛋白的表達(dá)水平 將H9c2心肌細(xì)胞接種于35 mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)至80%面積時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組給予不同的處理因素后，用預(yù)冷的PBS洗3次，加入裂解液，4℃靜置30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清，然后采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。總蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉60 min，隨后分別加入抗 p-瘦素抗體(1∶1 000)和抗瘦素受體抗體(1∶1 000)，4℃過夜，然后用TBST洗3次(每次5 min)。將PVDF膜用發(fā)光試劑ECL顯色，暗室曝光到X線片上，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2.4 細(xì)胞存活率的測(cè)定 將H9c2心肌細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，心肌細(xì)胞生長到占培養(yǎng)孔面積大約80%時(shí)，上述各實(shí)驗(yàn)組經(jīng)不同的處理因素作用后，于每孔中加入10 μL CCK-8和90 μL DMEM-F12，輕搖，37℃孵育2.5 h，用酶標(biāo)儀(λ=450 nm)記錄各孔吸光度(A)。取5孔A值的平均數(shù)，按下列公式計(jì)算細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率(%)=處理組A/對(duì)照組A×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2.5 Hoechst 33258核染色法測(cè)定細(xì)胞凋亡 將H9c2心肌細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，在細(xì)胞生長到占培養(yǎng)孔面積大約80%時(shí)，上述各實(shí)驗(yàn)組經(jīng)不同的處理因素作用后，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，然后用4%多聚甲醛于4℃環(huán)境中固定10 min，PBS沖洗3次，加入含5 mg/L Hoechst 33258試劑，于37℃溫箱孵育30 min，然后用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下(TE-2000;Nikon)攝片，染色質(zhì)呈均勻分布，核被染成均勻藍(lán)色的細(xì)胞被認(rèn)為是正常的心肌細(xì)胞，如細(xì)胞核呈濃縮、碎裂的明亮藍(lán)色，細(xì)胞則被認(rèn)為是凋亡的心肌細(xì)胞，隨機(jī)選取視野在熒光顯微鏡下攝片。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2.6 細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)的檢測(cè) 將H9c2心肌細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞生長到培養(yǎng)孔面積大約80%時(shí)，上述各實(shí)驗(yàn)組經(jīng)不同的處理因素后，PBS沖洗 3次，用含 10 μmol/L的DCFH-DA染液于37℃溫箱中孵育30 min，然后用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)區(qū)攝片，用ImageJ 1.41軟件分析5個(gè)視野綠色熒光強(qiáng)度的平均值，再對(duì)每組的各樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

2.7 線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，MMP)的測(cè)定 Rh123是一種能夠被線粒體所吸收的熒光染料，線粒體對(duì)其攝取能力取決于其跨膜電位。根據(jù)熒光強(qiáng)度可以間接反映MMP的高低。將H9c2心肌細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞生長到培養(yǎng)孔面積大約80%時(shí)，上述各實(shí)驗(yàn)組經(jīng)不同的處理因素作用后，用PBS沖洗3次，用10 μg/L Rh123的無血清培養(yǎng)基于37℃溫箱中孵育45 min，然后用PBS沖洗3次。在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)區(qū)攝片，細(xì)胞核周圍綠色的亮點(diǎn)即為攝取了Rh123的線粒體。用ImageJ 1.41軟件分析5個(gè)視野綠色熒光強(qiáng)度的平均值，再對(duì)每組的各樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 高糖上調(diào)心肌細(xì)胞瘦素及其受體的表達(dá)水平

圖1A顯示，應(yīng)用35 mmol/L葡萄糖(高糖，high glucose，HG)處理6～24 h均能明顯促進(jìn)H9c2心肌細(xì)胞瘦素的表達(dá)(P＜0.01)，其中處理9 h時(shí)，瘦素的表達(dá)達(dá)到最高峰。

圖1B顯示，應(yīng)用HG處理H9c2心肌細(xì)胞1～24 h也能明顯促進(jìn)瘦素受體的表達(dá)(均P＜0.01)，其中處理12 h時(shí)，瘦素受體的表達(dá)增加最多。

Figure 1.High glucose(35 mmol/L，HG)up-regulated the expression levels of leptin(A) and leptin receptor (LEPR;B)in H9c2 cardiac cells.Mean±SEM.n= 5.＊＊P＜0.01 vs control group.圖1 高糖促進(jìn)H9c2心肌細(xì)胞瘦素及其受體的表達(dá)水平

2 柚皮苷抑制高糖對(duì)心肌細(xì)胞瘦素及其受體表達(dá)的上調(diào)作用

圖2A顯示，應(yīng)用HG處理H9c2心肌細(xì)胞9 h能促進(jìn)瘦素的表達(dá)水平，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。在HG處理心肌細(xì)胞前，應(yīng)用80 μmol/L柚皮苷預(yù)處理2 h能明顯地抑制HG對(duì)瘦素表達(dá)的促進(jìn)作用，與HG處理組比較，差異非常顯著(P＜0.01)。單獨(dú)應(yīng)用80 μmol/L柚皮苷處理心肌細(xì)胞2 h，對(duì)瘦素的基礎(chǔ)表達(dá)無明顯影響(P＞0.05)。

另外，由圖2B可見，HG處理H9c2心肌細(xì)胞12 h能顯著促進(jìn)瘦素受體的表達(dá)(P＜0.01)，應(yīng)用80 μmol/L柚皮苷預(yù)處理2 h也能明顯阻斷HG對(duì)瘦素表達(dá)的上調(diào)作用，與HG處理組比較，差異非常顯著(P＜0.01)。柚皮苷處理本身對(duì)H9c2心肌細(xì)胞對(duì)瘦素的基礎(chǔ)表達(dá)無明顯作用(P＞0.05)。

Figure 2.Naringin(NRG)inhibited high glucose(HG)-induced up-regulation of expression of leptin(A)and leptin receptor(LEPR;B)in H9c2 cardiac cells.Mean±SEM.n=5.＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs HG group.圖2 柚皮苷抑制高糖對(duì)心肌細(xì)胞瘦素及其受體表達(dá)的促進(jìn)作用

3 柚皮苷和瘦素通路抑制劑抑制高糖引起的心肌細(xì)胞毒性

圖3顯示，HG處理H9c2心肌細(xì)胞24 h產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性，使細(xì)胞存活率降低至(51.60± 0.23)%，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。但是，在HG處理心肌細(xì)胞前，應(yīng)用80 μmol/L柚皮苷預(yù)處理2 h能顯著對(duì)抗HG引起的細(xì)胞毒性，使細(xì)胞存活率升高至(72.50±1.20)%，與HG處理組比較，差異明顯(P＜0.05)。另一方面，與柚皮苷的抗HG心肌細(xì)胞毒性的作用相似，在HG處理心肌細(xì)胞前，分別應(yīng)用50 μg/L LA預(yù)處理24 h或25 μg/L ObRa預(yù)處理2 h也能抑制HG引起的細(xì)胞毒性，使心肌細(xì)胞存活率分別升高(78.50±1.90)%和(81.60±2.10)%，與HG處理組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。單獨(dú)LA或ObRa預(yù)處理本身對(duì)H9c2心肌細(xì)胞不產(chǎn)生細(xì)胞毒性(P＞0.05)。

Figure 3.Both naringin(NRG)and the inhibitors of leptin pathway attenuated high glucose(HG)-induced cytotoxicity in H9c2 cardiac cells.LA:leptin antagonist; ObRa:leptin receptor antagonist.Mean±SEM.n=5.＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs HG-treat group.圖3 柚皮苷及瘦素通路抑制劑對(duì)抗高糖引起的心肌細(xì)胞毒性

4 柚皮苷和瘦素通路抑制劑抑制高糖的致心肌細(xì)胞凋亡作用

Hoechst 33258核染色的測(cè)定結(jié)果(圖4)顯示，正常的H9c2心肌細(xì)胞染色質(zhì)均勻分布，表現(xiàn)為彌散均勻的低密度熒光。然而，應(yīng)用HG處理H9c2心肌細(xì)胞24 h后，細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的凋亡特征，即細(xì)胞核呈現(xiàn)濃縮致密的固縮形態(tài)或顆粒熒光。但是，在HG處理心肌細(xì)胞前，應(yīng)用80 μmol/L柚皮苷預(yù)處理2 h則能明顯抑制HG對(duì)心肌細(xì)胞的致凋亡作用，使細(xì)胞凋亡率從(42.2±1.1)%(HG處理組)降低至(18.1±1.2)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與柚皮苷的抗凋亡作用相似，50 μg/L LA預(yù)處理24 h或25 μg/L ObRa預(yù)處理2 h也分別使心肌細(xì)胞凋亡率降低至(17.3±0.9)%和(19.5±1.7)%(P＜0.01)。單獨(dú)用柚皮苷、LA或ObRa預(yù)處理本身不引起H9c2心肌細(xì)胞凋亡。

Figure 4.Both naringin(NRG)and the inhibitors of leptin pathway antagonized high glucose(HG)-induced apoptosis of H9c2 cardiac cells.LA:leptin antagonist;ObRa: leptin receptor antagonist.Mean±SEM.n=5.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HG group.圖4 柚皮苷及瘦素通路抑制劑減輕高糖引起的心肌細(xì)胞凋亡

5 柚皮苷和瘦素通路抑制劑減輕高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧堆積

圖5顯示，HG作用于H9c2心肌細(xì)胞24 h可使胞內(nèi)DCFH的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI;能間接反映ROS水平)明顯增強(qiáng)，與正常對(duì)照組相比，差異顯著(P＜0.01)。但是，80 μmol/L柚皮苷預(yù)處理2 h可使胞內(nèi)ROS堆積減少，MFI從(31.9± 1.0)%(HG處理組)減少至(14.3±1.5)%(P＜0.01)。與柚皮苷對(duì)ROS生成的抑制作用相似，50 μg/L LA預(yù)處理24 h或25 μg/L ObRa預(yù)處理2 h也能分別使 MFI減少至(15.7±2.1)%和(12.9± 1.8)%(均P＜0.01)。單獨(dú)柚皮苷、LA或ObRa預(yù)處理本身對(duì)胞內(nèi)ROS生成無明顯作用(P＞0.05)。

6 柚皮苷和瘦素通路抑制劑減輕高糖引起的心肌細(xì)胞線粒體膜電位下降

圖6顯示，HG作用H9c2心肌細(xì)胞24 h使胞內(nèi)Rh123的MFI(反映MMP大小的指標(biāo))從(18.5± 2.2)%(正常對(duì)照組)降低至(4.8±0.9)%，2組差異非常顯著(P＜0.01)。然而，80 μmol/L柚皮苷預(yù)處理2 h可使MFI升高至(9.2±2.1)%，與HG處理組比較，差異非常顯著(P＜0.01)。與柚皮苷對(duì)MMP保護(hù)作用相似，50 μg/L LA預(yù)處理24 h或25 μg/L ObRa預(yù)處理2 h也能分別對(duì)抗HG對(duì)心肌細(xì)胞線粒體的損傷，使MFI分別增加至(8.7±1.7)%和(9.5±1.1)%(均P＜0.01)。單獨(dú)柚皮苷、LA或ObRa預(yù)處理本身對(duì)H9c2心肌細(xì)胞的MMP大小無顯著作用。

Figure 6.Both naringin(NRG)and the inhibitors of leptin pathway attenuated high glucose(HG)-induced decline in mitochondrial member potential(MMP)in H9c2 cardiac cells.LA:leptin antagonist;ObRa:leptin receptor antagonist.Mean±SEM.n=5.＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HG group.圖6 柚皮苷和瘦素通路抑制劑減輕高糖引起的心肌細(xì)胞線粒體膜電位下降

討論

高血糖被認(rèn)為是糖尿病的一個(gè)重要特征，是導(dǎo)致糖尿病慢性并發(fā)癥的關(guān)鍵因素之一，如糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy)。但是，迄今有關(guān)高糖引起心肌細(xì)胞損傷的病理生理機(jī)制尚未明了。本研究利用高糖損傷H9c2心肌細(xì)胞模型［12］再次證實(shí)，高糖對(duì)心肌細(xì)胞有明顯損傷作用，表現(xiàn)為使細(xì)胞存活率降低、凋亡細(xì)胞增多、ROS生成增多及線粒體損傷(MMP丟失)，這與前文的報(bào)道［3，12］相一致。

值得注意的是，本研究證實(shí)，高糖能明顯促進(jìn)心肌細(xì)胞瘦素的表達(dá)。瘦素最初主要被認(rèn)為調(diào)節(jié)肥胖或體重。但是，近年有研究報(bào)道，瘦素參與心血管疾病的發(fā)生，如心肌細(xì)胞肥大［6］。Majumdar等［6］證實(shí)，高糖能增加新生大鼠心肌細(xì)胞表達(dá)瘦素和內(nèi)皮素1，支持本研究的結(jié)果。由于瘦素的功能通過激活瘦素受體實(shí)現(xiàn)，本研究進(jìn)一步觀察高糖對(duì)H9c2心肌細(xì)胞瘦素受體表達(dá)的影響。研究結(jié)果表明，高糖在促進(jìn)心肌細(xì)胞瘦素表達(dá)的同時(shí)，也能上調(diào)瘦素受體的表達(dá)，提示高糖能激活瘦素-瘦素受體通路。

為了證實(shí)瘦素-瘦素受體通路在高糖損傷心肌細(xì)胞中的作用，本研究觀察了LA和ObRa對(duì)高糖損傷心肌細(xì)胞作用的影響，結(jié)果表明，瘦素拮抗劑和瘦素受體抑制劑均能明顯抑制高糖引起的損傷，使細(xì)胞存活率升高，凋亡細(xì)胞數(shù)量和ROS生成減少，MMP回升，提示瘦素-瘦素受體通路的激活可能是高糖引起心肌細(xì)胞損傷的重要機(jī)制之一，這條通路的激活可能參與高糖引起的細(xì)胞毒性、凋亡、氧化應(yīng)激及線粒體損傷等多種損傷作用。本研究為深入闡明高糖對(duì)心肌細(xì)胞的損傷機(jī)制提供了新穎的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

柚皮苷是一種雙氫黃酮類化合物，除存在葡萄、葡萄柚等果實(shí)及果皮中外，還是中藥化橘紅、骨碎補(bǔ)等的主要有效成分，已被證實(shí)具有多方面的藥理學(xué)作用，如抗凋亡［3］、抗氧化［1-2］、降血脂［2］和降血糖［5］等。最近，我們證實(shí)，柚皮苷可通過抑制p38 MAPK通路對(duì)抗高糖引起的心肌細(xì)胞損傷作用［3，12］。本研究進(jìn)一步證實(shí)柚皮柑也能明顯抑制高糖對(duì)心肌細(xì)胞瘦素和瘦素受體表達(dá)的上調(diào)作用，這為闡明柚皮苷抗高糖引起的心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)材料，也為應(yīng)用食療法或中藥防治糖尿病引起的心血管損傷提供了新思路。由于p38 MAPK通路已被證實(shí)參與糖尿病的發(fā)生發(fā)展［13-15］，在多種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，瘦素可激活p38 MAPK通路［16］，因此，深入探討瘦素-p38 MAPK通路在高糖損傷心肌細(xì)胞中的作用及柚皮苷的心肌保護(hù)作用有待今后進(jìn)一步研究。

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Naringin protects against high glucose-induced injury by inhibiting leptin pathway in H9c2 cardiac cells

LIU Fu-zhen1，CHEN Jing-fu2，PAN De-mao3，TIAN Li-hong2，GUO Run-min2，YOU Qiong2，WU Keng2
(1Department of Endocrinology，2Department of Cardiology，Affiliated Hospital，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524001，China;3Department of Internal Medicine，Region of Huangpu，The First Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510700，China.E-mail:wukeng1245@hotmail.com)

AIM:To study whether naringin protects H9c2 cardiac cells against high glucose(HG)-induced injury by inhibiting the leptin pathway.METHODS:The expression levels of leptin and leptin receptor(LEPR)were detected by Western blotting.The cell viability was analyzed by CCK-8 assay.The changes of the morphology and the number of apoptotic cells were tested by Hoechst 33258 nuclear staining.The intracellular levels of reactive oxygen species(ROS) were measured by DCFH-DA staining.Mitochondrial membrane potential(MMP)was determined by rhodamine 123 staining.RESULTS:Treatment of the cells with 35 mmol/L glucose(HG)for 6～24 h up-regulated the expression of leptin in H9c2 cardiac cells with the peak value at 9 h.Treatment of the cells with HG for 1～24 h also enhanced the expression of LEPR，peaking at 12 h.Pretreatment with 80 μmol/L naringin for 2 h before exposure of the H9c2 cardiac cells to HG significantly inhibited the up-regulation of both leptin and LEPR induced by HG.Pretreatment of the cells with naringin for 2 h，leptin antagonist for 24 h，or leptin receptor antagonist for 2 h attenuated HG-induced injury in the cardiomyocytes，evidenced by an increase in cell viability，decreases in the number of apoptotic cells and intracellular ROS production as well as a recovery of MMP.CONCLUSION:Naringin may protect the cardiomyocytes against the HG-induced injury by inhibition of the leptin pathway.

Naringin;Leptin;Receptors，leptin;Hyperglycemia;Cardiomyocytes

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.008

1000-4718(2014)03-0423-07

2013-12-12

2014-01-28

湛江市財(cái)政資金科技專項(xiàng)競(jìng)爭(zhēng)性分配項(xiàng)目(No.湛科［2011］79號(hào));廣東省重大科技專項(xiàng)(No.2012A080202020)

△通訊作者Tel:0759-2387412;E-mail:wukeng1245@hotmail.com