亓翠玲， 周鑫磊， 葉 杰， 楊 揚， 章倩倩， 李江超， 蘭 天， 何曉東， 王麗京

(廣東藥學(xué)院血管生物學(xué)研究所，廣東廣州 510006)

穿心蓮內(nèi)酯對口腔癌生長的影響*

亓翠玲， 周鑫磊， 葉 杰， 楊 揚， 章倩倩， 李江超， 蘭 天， 何曉東， 王麗京△

(廣東藥學(xué)院血管生物學(xué)研究所，廣東廣州 510006)

目的：探討穿心蓮內(nèi)酯對口腔癌的作用及其機制。方法：用穿心蓮內(nèi)酯及其對照藥物治療金黃地鼠頰囊癌，通過測量腫瘤體積觀察治療效果。用免疫組化檢測穿心蓮內(nèi)酯對腫瘤血管和腫瘤細胞增殖的作用，用TUNEL法檢測穿心蓮內(nèi)酯對腫瘤細胞凋亡的作用，用免疫組化檢測凋亡信號分子caspase-3的表達情況。結(jié)果：穿心蓮內(nèi)酯治療組頰囊癌的腫瘤體積明顯比對照組小，腫瘤微血管密度和增殖的腫瘤細胞也明顯低于對照組，腫瘤細胞的凋亡率明顯高于對照組，而且治療組中caspase-3明顯被活化。結(jié)論：穿心蓮內(nèi)酯通過抑制腫瘤血管生成和腫瘤細胞增殖以及促進腫瘤細胞凋亡，抑制了金黃地鼠頰囊癌的生長。穿心蓮內(nèi)酯通過caspase-3途徑誘導(dǎo)了腫瘤細胞的凋亡。

穿心蓮內(nèi)酯;細胞凋亡;血管生成;口腔腫瘤

穿心蓮是爵床科穿心蓮屬植物，是一種天然的抗炎植物藥。穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide，Andro)是其主要有效成分之一，是一種二環(huán)雙萜內(nèi)酯類化合物。Andro是一種傳統(tǒng)的抗炎藥物，而且研究報道Andro還對動脈粥樣硬化及高血壓有一定療效以及具有免疫調(diào)節(jié)等作用［1-2］。許多研究報道 Andro對腫瘤具有明顯的抑制作用。體外研究表明Andro對MCF-7乳腺癌細胞及HCT-116直腸癌細胞有顯著的抑制作用［3］，Andro還可以提高腫瘤壞死因子 α (tumor necrosis factor alpha，TNF-α)的表達及細胞周期蛋白標志物的表達，使得淋巴細胞抗腫瘤細胞的細胞毒活性增加，這可能起到間接的抗腫瘤作用。Andro可以通過阻滯細胞周期影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究報道Andro使MCF-7細胞滯留在G0/G1期，主要是通過半合成一個 Andro的類似物 DRF3188，DRF3188使細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶和細胞周期蛋白D1等細胞周期因子表達量明顯減少［4］。Andro還可誘導(dǎo)HL-60細胞周期阻滯［5］，Andro可以通過激活caspase-3及caspase-8誘導(dǎo)前列腺癌PC3細胞凋亡［6］。研究報道Andro還具有抗血管生成的作用。通過主動脈環(huán)實驗發(fā)現(xiàn)Andro可以阻抑微血管的生長。Andro治療黑色素瘤后，發(fā)現(xiàn)腫瘤的微血管數(shù)與對照組相比有顯著差異［1］。本研究用二甲基苯并蒽［7，12-dimethylbenz(a)anthracene，DMBA］誘導(dǎo)金黃地鼠頰囊癌模型，發(fā)現(xiàn)Andro可以抑制地鼠頰囊癌的增殖，誘導(dǎo)頰囊癌細胞凋亡，抑制腫瘤誘發(fā)的新生血管的生成，從而發(fā)揮抑制頰囊癌生長的作用。

材料和方法

1 材料

1.1 動物 敘利亞金黃地鼠80只，6～8周齡，體重80～100 g，雌雄各半，購于中山大學(xué)實驗動物中心。

1.1 試劑 DMBA購自 Sigma。工作液濃度: 0.5%;配制量:100 mL。配制方法:DMBA粉末5 mg溶解于100 mL丙酮中，-20℃保存。BrdU粉末及rabbit anti-mouse BrdU抗體購自北京中杉金橋有限公司。Rabbit anti-mouse vWF(von Willebrand factor)抗體購自Santa Cruz，rabbit anti-mouse caspase-3抗體購自Cell Signaling Technology。TUNEL試劑盒購自Roche。

2 方法

2.1 金黃地鼠頰囊癌模型的構(gòu)建 每周一、三、五下午以4號水彩筆在地鼠單側(cè)頰囊(右側(cè))涂致癌劑DMBA，沿同一方向刷3次，涂抹劑量相當于0.1 mL，至9周時停止涂藥。至第14周時用Andro治療地鼠頰囊癌模型。測量每只動物的腫瘤體積(計算公式:0.52×長徑×短徑2)，將腫瘤體積過大和過小的動物剔除后，還剩余52只腫瘤模型動物，然后將實驗動物用單純隨機數(shù)字法分組，隨機分為3組，分組情況為Andro治療組22只，對照組分別為4H-Andro(Andro經(jīng)過化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾后藥物活性消失的化合物)組16只和Blank組14只。圖1為金黃地鼠頰囊癌模型的建立。

Figure 1. Chemical-induced hamsterbuccalpouch cancer model.A:hamster;B:the fixing device of hamster;C:hamster buccal pouch;D:chemical-induced hamster buccal pouch cancer.圖1 金黃地鼠頰囊癌模型的建立

2.2 治療方案 各組動物均以腹腔注射方式給藥，治療劑量為6.2 μg/g體重，每周治療2次，共治療5周，每次治療前都要觀察腫瘤體積、體重并做記錄。

2.3 免疫組化 將金黃地鼠腫瘤組織用甲醛固定后，石蠟包埋，切片。切片脫蠟后，用PBS洗3次，每次5 min。高壓修復(fù)10 min。PBS洗后，用3%H2O2甲醇37℃孵育30 min。10%BSA封閉后，加rabbit anti-mouse vWF抗體、rabbit anti-mouse BrdU抗體或rabbit anti-mouse caspase-3抗體，4℃過夜。第2天，復(fù)溫后，PBS洗，滴加anti-rabbitⅡ抗，37℃ 50 min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染后，脫水、透明、封片。

2.4 TUNEL 組織切片脫蠟至水，沸熱修復(fù)7 min。PBS洗后，用3%H2O2甲醇37℃孵育30 min。加TUNEL反應(yīng)液，37℃孵育90 min。PBS洗后，加Converter-POD，37℃孵育30 min。DAB顯色后蘇木素復(fù)染，脫水，封片。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件包和SigmaPlot軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 Andro抑制了金黃地鼠頰囊癌腫瘤體積的增長

Andro治療組與實驗對照組相比，治療組金黃地鼠頰囊癌腫瘤體積的增長速度明顯減慢，而對照組腫瘤體積增長速度快，瘤體易破，易出血，說明Andro可以抑制腫瘤的生長，見圖2。

2 Andro對腫瘤細胞增殖的影響

BrdU抗體免疫染色陽性結(jié)果為增殖程度高的腫瘤細胞核區(qū)棕黃色著色。BrdU表達結(jié)果表明實驗組和對照組有顯著差異(P＜0.01)，見圖3。

3 Andro對腫瘤組織中微血管密度(microvascular density，MVD)的影響

Andro治療組內(nèi)MVD比對照組明顯降低，見圖4，說明Andro抑制了腫瘤組織內(nèi)新生血管的形成。

4 Andro對腫瘤組織中細胞凋亡的影響

4.1 Andro促進了腫瘤組織中細胞凋亡 Andro治療組內(nèi)凋亡細胞明顯比空白對照組和4H-Andro組多，見圖5，說明Andro促進腫瘤組織內(nèi)細胞的凋亡。

4.2 Andro通過活化caspase-3而誘導(dǎo)腫瘤組織內(nèi)細胞凋亡 Andro可顯著誘導(dǎo)caspase-3活化，從而促進凋亡的發(fā)生，見圖6。

Figure 2.The effect of Andro on hamster buccal pouch cancer growth.Mean±SD.n=22 in Andro group;n=16 in 4H-Andro group;n=14 in blank group.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs Andro.圖2 Andro抑制了金黃地鼠頰囊癌腫瘤體積的增長

Figure 3.The effect of Andro on hamster buccal pouch cancer cell proliferation.Mean±SD.n=5.＊＊P＜0.01 vs blank or 4H-Andro.圖3 Andro抑制了腫瘤細胞增殖

Figure 4.MVD in hamster buccal pouch cancer tissues was investigated by vWF immunohistochemicalstaining.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs blank or 4H-Andro.圖4 Andro抑制腫瘤組織內(nèi)新生血管的形成

Figure 5.Tumor cell apoptosis in hamster buccal pouch cancer tissues was detected by TUNEL.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs blank or 4H-Andro.圖5 Andro促進腫瘤組織內(nèi)細胞凋亡

討論

口腔癌是人體常見的腫瘤之一［7］。近年來口腔癌的發(fā)病率有明顯的上升趨勢，特別是發(fā)病年齡趨向年輕化?？谇击[癌不僅發(fā)病率高，且惡性程度較高;往往造成語音、咀嚼、吞咽、面容等功能障礙和嚴重的面容毀損，并威脅到患者的生命;五年生存率只有60%左右。盡管近來口腔癌手術(shù)方法的不斷改進以及放療、化療的廣泛應(yīng)用，但口腔癌的五年生存率并沒有明顯提高［8］。

地鼠頰囊癌是Salley［9］在1954年建立的一種化學(xué)誘導(dǎo)的自發(fā)性腫瘤模型，是目前公認的研究口腔癌的良好動物模型。地鼠口腔特有的頰囊結(jié)構(gòu)是較為理想的誘癌部位，利用化學(xué)致癌劑二甲基苯并蒽誘發(fā)頰囊口腔癌，它與人體自然成癌過程極為相似，能夠動態(tài)、直觀地觀察腫瘤形成中單純增生、異常增生、原位癌、浸潤癌各階段的病理變化和檢測成癌過程中相關(guān)分子標志物的動態(tài)改變［10-11］，因此它廣泛地應(yīng)用于口腔鱗狀細胞癌病理學(xué)、細胞動力學(xué)、癌變潛力、抗癌藥物篩選和腫瘤早期預(yù)防的研究中［12-13］。

Figure 6.The activation of caspase-3 in hamster buccal pouch cancer tissues.Mean±SD.n=5.*P＜0.05 vs blank or 4H-Andro.圖6 Andro活化了caspase-3

近年來，文獻報道Andro對多種腫瘤細胞有殺傷作用［3］，但Andro對化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)的口腔腫瘤形成有何種作用目前國內(nèi)還未見報道。為回答上述第一個問題，即穿心蓮內(nèi)酯是否對腫瘤的生長有抑制作用，我們首先構(gòu)建了金黃地鼠頰囊模型，在誘癌成功后用Andro進行治療，通過觀察腫瘤體積來考察Andro對口腔癌生長的抑制作用。結(jié)果顯示An dro治療組腫瘤體積的增長較blank組及4H-Andro組明顯減緩，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析組間有顯著差異，說明Andro可以抑制口腔癌生長。為進一步研究Andro對口腔癌的作用機制，我們?nèi)〉厥竽[瘤組織，用免疫組織化學(xué)的方法探討Andro作用后地鼠頰囊癌組織中其增殖、凋亡及血管等生物學(xué)特性變化的情況。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與諸多因素相關(guān)，如細胞增殖的增強、凋亡的抑制、新生血管形成等方面，而具有高增殖活性是腫瘤細胞的生物學(xué)特性之一。因此我們檢測了地鼠頰囊癌組織中細胞的增殖活性。BrdU是一種可以與胸腺嘧啶競爭性參與細胞S期合成的藥物，又因為其帶有溴標記物，因此可以檢測細胞的增殖情況［14-15］。通過BrdU實驗我們發(fā)現(xiàn)，用Andro治療實驗動物后，其腫瘤組織內(nèi)細胞的增殖活性受到明顯抑制。腫瘤的增殖與凋亡存在平衡關(guān)系。腫瘤的發(fā)展通常是增殖加強與凋亡受阻共同作用的結(jié)果。我們通過TUNEL實驗發(fā)現(xiàn)Andro可以顯著促進頰囊癌腫瘤組織中細胞凋亡。同時Andro可以顯著誘導(dǎo)地鼠頰囊組織caspase-3活化水平增加。Zhou等［5］在體外實驗研究中證實，Andro可以通過Bcl-2家族蛋白誘導(dǎo)caspase-3及caspase-9活化從而促進腫瘤細胞的凋亡，這與我們的研究結(jié)果相一致。還發(fā)現(xiàn) Andro作用于地鼠頰囊癌后，腫瘤組織內(nèi)的MVD水平顯著降低，說明Andro可以抑制腫瘤誘發(fā)的新生血管生成。同時有文獻報道，在C57BL/6鼠中，腹腔注射Andro可顯著抑制接種B16F10黑色素瘤細胞誘導(dǎo)的新生血管形成，治療組微血管數(shù)與對照組相比有顯著差異［1］。

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Effect of andrographolide on oral squamous cell carcinogenesis

QI Cui-ling，ZHOU Xin-lei，YE Jie，YANG Yang，ZHANG Qian-qian，LI Jiang-chao，LAN Tian，HE Xiao-dong，WANG Li-jing
(Vascular Biology Institute，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China.E-mail:wanglijing62@ 163.com)

AIM:To study the effect of andrographolide(Andro)on oral squamous cell carcinogenesis.METHODS:Chemical-induced hamster buccal pouch cancer model was used.The tumor cell proliferation，apoptosis and microvessel density(MVD)were detected by immunohistochemical staining.RESULTS:Compared with control group，the tumor volume，MVD and tumor cell proliferation in Andro group were significantly decreased.The cell apoptotic cell number in Andro group was higher than that in control group.Caspase-3 was also activated in Andro group.CONCLUSION:Andro inhibits tumor growth by suppressing proliferation，decreasing MVD and promoting apoptosis in the hamster buccal pouch.Furthermore，Andro promotes tumor cell apoptosis through caspase-3 pathway.

Andrographolide;Apoptosis;Angiogenesis;Mouth neoplasms

R739.8

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.003

1000-4718(2014)03-0400-04

2013-09-23

2013-12-23

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.31271455)

△通訊作者Tel:020-39352126;E-mail:wanglijing62@163.com