陳 鯤， 陳永順， 王雪君， 陳韻帆， 劉軻莉， 陳鳳佳， 魯建軍△

(1廣州大學(xué)基因干擾研究所，廣東廣州 510006;2中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科，廣東廣州 510080)

·論 著·

Et-DHA通過激活線粒體途徑和T細(xì)胞granzyme B誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡*

陳 鯤1， 陳永順1， 王雪君1， 陳韻帆1， 劉軻莉1， 陳鳳佳2， 魯建軍2△

(1廣州大學(xué)基因干擾研究所，廣東廣州 510006;2中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科，廣東廣州 510080)

目的：本研究探討了二十二碳六烯酸乙酯(Et-DHA)對人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響。方法：HepG2細(xì)胞用于檢測Et-DHA的抑癌活性，MTT法檢測Et-DHA對HepG2細(xì)胞的直接抑制作用，Hoechst 33258熒光染色觀察細(xì)胞的形態(tài)特征，ELISA法檢測Et-DHA處理后HepG2細(xì)胞的活性氧簇(ROS)釋放量、總超氧化物歧化酶(SOD)和caspase-9活性，Western blotting法檢測胞質(zhì)和線粒體中Bax、Bak、Bid、Bcl-2、Smac和細(xì)胞色素C(Cyt C)，以及胞質(zhì)中cleaved caspase-8、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的水平;T細(xì)胞與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)，進(jìn)一步觀察Et-DHA處理后T細(xì)胞的增殖對HepG2細(xì)胞活性的影響，并檢測了顆粒酶(granzyme)B的水平。結(jié)果：Et-DHA顯著抑制HepG2細(xì)胞的生長(P＜0.05)，這種抑制作用具濃度效應(yīng)和時(shí)程效應(yīng);Et-DHA處理后HepG2細(xì)胞的ROS釋放量增加，但總SOD活性無明顯變化，caspase-9活性顯著上升(P＜0.05);線粒體上的促凋亡蛋白Bax、Bak和Bid水平增加，而抑凋亡蛋白Bcl-2以及線粒體中Cyt C和Smac的水平降低，胞質(zhì)中的Cyt C、Smac、cleaved caspase-8、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3以及cleaved Bid水平呈劑量性升高。另外T細(xì)胞和HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)組在Et-DHA的誘導(dǎo)下，HepG2細(xì)胞的凋亡程度與Et-DHA單獨(dú)作用時(shí)相比進(jìn)一步增加。在Et-DHA刺激下，T細(xì)胞內(nèi)granzyme B上調(diào)，釋放到HepG2細(xì)胞內(nèi)的granzyme B明顯增多。結(jié)論：Et-DHA可能主要通過線粒體內(nèi)源性途徑以及caspase-8途徑，激活caspase-3，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，以及通過間接活化T細(xì)胞，促使 granzyme B增多，從而增強(qiáng)對HepG2細(xì)胞的毒性作用。

二十二碳六烯酸;HepG2細(xì)胞;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9;顆粒酶B;細(xì)胞色素C;Smac蛋白

二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA，22:6 n-3)是一種n-3多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)，在海洋動(dòng)物體內(nèi)含量豐富。近年來作為一種保健食品，具有較好的預(yù)防和治療癌癥、降低腫瘤的發(fā)生及抗炎等功效，備受廣泛關(guān)注［1］。n-3多不飽和脂肪酸［二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和DHA］可通過調(diào)節(jié)肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞的凋亡蛋白如Bax的活性和表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對腫瘤細(xì)胞的異常增殖具有一定的抑制作用［2-6］。n-3多不飽和脂肪酸還可提高腫瘤化療藥物的療效。離體實(shí)驗(yàn)表明，EPA和DHA可提高許多常用抑癌藥物(阿霉素、三氧化二砷、絲裂霉素、紫杉醇、表阿霉素、5-氟尿嘧啶和阿糖胞苷)對結(jié)腸癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、乳腺癌、膀胱癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等細(xì)胞株的抑制作用［2，7-9］。在體實(shí)驗(yàn)表明，飼料中添加DHA并聯(lián)合應(yīng)用5-氟尿嘧啶可減少荷瘤動(dòng)物腫瘤塊的大?。?0］。臨床實(shí)驗(yàn)表明，EPA和DHA可增加結(jié)腸癌對依立替康的敏感性［1］，給非小細(xì)胞肺癌患者每天添加2.5 g EPA和DHA，化療效果可提高約2倍，平均延長3周的化療時(shí)程，從而增加患者的存活率［11］。

人類肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的五大癌癥之一，目前對于肝癌還沒有有效的二級預(yù)防或系統(tǒng)性治療，肝癌患者的整體存活率較低。相對于DHA對其它惡性腫瘤抑制作用的報(bào)道，目前DHA對原發(fā)性肝癌作用的報(bào)道較少［2-3］。一項(xiàng)超過9萬多人的統(tǒng)計(jì)表明多食魚類和含量高的n-3 PUFAs的食物可以顯著降低肝癌的發(fā)生率［1］。有研究揭示不飽和脂肪酸可調(diào)節(jié)肝細(xì)胞(HepG2細(xì)胞)纖溶酶原激活劑抑制物1的基因轉(zhuǎn)錄。雖然已有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明n-3 PUFA可預(yù)防癌變，DHA可通過影響轉(zhuǎn)錄因子和基因表達(dá)、增強(qiáng)脂質(zhì)過氧化作用、抑制類花生酸的生物合成等方面誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［1，12］，但是對n-3 PUFAs的抑癌分子機(jī)制仍然沒有完全闡明，特別是關(guān)于DHA對人肝癌HepG2細(xì)胞抑制作用的分子機(jī)制仍不十分清楚。本研究觀察二十二碳六烯酸乙酯(ethyl DHA，Et-DHA)對HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并探討Et-DHA對T細(xì)胞和HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)的作用的分子機(jī)制，為肝癌病防治提供新的靶點(diǎn)和策略。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康成年SPF清潔級BALB/c小鼠，18～22 g，8周齡，購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有實(shí)驗(yàn)操作以及動(dòng)物使用都嚴(yán)格遵守《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)意見》(中國科技部2006)以及廣州大學(xué)及中山大學(xué)動(dòng)物倫理法規(guī)。

1.2 材料 人肝癌HepG2細(xì)胞由南京大學(xué)劉暢教授惠贈(zèng);Et-DHA(22:6Δ4，7，10，13，16，19)購自東京化成工業(yè)株式會(huì)社(Tokyo)，純度高于98%，-20℃保存;胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和DMEM(Dulbecco’s modified Eagle medium)購自Gibco;總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力測定試劑盒和活性氧簇(reactire oxygen species，ROS)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所;caspase-9活性檢測試劑盒購自上海貝博;所有其它的試劑盒均購自Sigma。

2 細(xì)胞培養(yǎng)和處理

2.1 脾淋巴細(xì)胞的制備和培養(yǎng) 頸椎脫臼處死小鼠，75%乙醇浸泡2 min，無菌條件下切取小鼠脾臟。機(jī)械分離脾細(xì)胞，用200目濾網(wǎng)過濾，離心后用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，再用 PBS清洗2次，4℃、3 000×g離心1×10 min，離心后加入培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液，先用培養(yǎng)瓶培養(yǎng)12 h，然后吸取細(xì)胞懸液，純化T細(xì)胞，分到6孔板上，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/L。進(jìn)行藥物處理2 d后觀察并拍照。

2.2 HepG2細(xì)胞培養(yǎng) 使用包含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)條件5% CO2、37℃飽和濕度的培養(yǎng)箱，細(xì)胞貼壁生長。細(xì)胞分到培養(yǎng)皿時(shí)密度大約為 1×108/L。實(shí)驗(yàn)組在DMEM培養(yǎng)液內(nèi)加入Et-DHA(終濃度為0 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L、100 μmol/L和300 μmol/L)培養(yǎng)24 h，對照組加等體積的DMEM。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定本實(shí)驗(yàn)的Et-DHA濃度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3 T細(xì)胞和HepG2細(xì)胞共培養(yǎng) 在已經(jīng)貼壁的HepG2細(xì)胞中按T細(xì)胞與刺激細(xì)胞10∶1的比例加入T細(xì)胞懸液培養(yǎng)24 h和48 h作為實(shí)驗(yàn)組，對照組加入相同體積的10 μmol/L Et-DHA。

3 主要方法

3.1 MTT比色法測定細(xì)胞活性 將HepG2細(xì)胞以1×108/L的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24 h，向培養(yǎng)液中各加入不同濃度的Et-DHA(終濃度為0 μmol/L、10 μmol/L、30 μmol/L、100 μmol/L和300 μmol/L)，培養(yǎng)24 h和48 h后，用MTT比色法測定細(xì)胞活性。

按照1×108/L細(xì)胞接種密度對HepG2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，依據(jù)之前設(shè)計(jì)的試劑濃度加入Et-DHA連續(xù)培養(yǎng)48 h，獲得實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞。用裂解液裂解HepG2細(xì)胞，按說明書內(nèi)的規(guī)定操作程序來測定SOD，采用酶標(biāo)儀(Spectra MAX 340)在波長為550 nm處檢測SOD吸收值。

3.2 細(xì)胞形態(tài)分析 為了觀察HepG2細(xì)胞在凋亡過程中發(fā)生的形態(tài)變化，用 Hoechst 33258處理HepG2細(xì)胞。在室溫下將HepG2細(xì)胞用4%多聚甲醛固定20 min后，用0.02 mol/L PBS洗滌3次，避光條件下添加10 g/L Hoechst 33258染色10 min，在熒光顯微鏡下(Nikon)用×100和×200的放大倍數(shù)觀察細(xì)胞。在倒置相差顯微鏡(×100和×400)下觀察T細(xì)胞。

3.3 ROS含量的測定 按照1×108/L細(xì)胞接種密度對HepG2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，依據(jù)之前設(shè)計(jì)的試劑濃度加入Et-DHA連續(xù)培養(yǎng)48 h，獲得實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞。使用DCFH-DA熒光染色法測定細(xì)胞內(nèi)的活性氧簇的含量。DCFH-DA本身沒有熒光，可自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，細(xì)胞內(nèi)的H2O2等小分子量的過氧化物，即在有ROS的情況下DCFH-DA能夠被氧化為生成熒光的二氯熒光素(dichlorofluorescein，DCF)，其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)的ROS的水平成正比。Et-DHA處理過的HepG2細(xì)胞用10 mmol/L的DCFH-DA孵育30 min，PBS清洗2遍，最后DCF的生成量通過酶標(biāo)儀讀數(shù)得到，其激發(fā)波長為500 nm，發(fā)射波長為530 nm。

3.4 總SOD活性測定 按照1×108/L接種密度對HepG2細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，依據(jù)之前設(shè)計(jì)的試劑濃度加入Et-DHA連續(xù)培養(yǎng)48 h，獲得實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞。用裂解液裂解HepG2細(xì)胞。按說明書內(nèi)的規(guī)定操作程序來測定SOD，采用酶標(biāo)儀在波長為550 nm處來檢測SOD吸收值。重復(fù)3次，計(jì)算出平均值。總SOD活性(103U/L)=(對照管吸光度-測定管吸光度) ÷50% ×(反應(yīng)液總量÷所取樣品量)。

3.5 Caspase-9活性的測定 以1×108/L細(xì)胞接種密度培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，按照設(shè)計(jì)的濃度添加Et-DHA繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，用裂解液裂解HepG2細(xì)胞。用考馬氏亮藍(lán)法測定蛋白濃度，然后按試劑盒說明書操作測定caspase-9活性，使用酶標(biāo)儀在405 nm波長處測定caspase-9的吸收值。計(jì)算各Et-DHA實(shí)驗(yàn)組caspase-9與對照組細(xì)胞caspase-9的相對活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

3.6 Western blotting檢測蛋白的表達(dá) 細(xì)胞接種于6孔板，進(jìn)行藥物處理，終止培養(yǎng)后細(xì)胞溶解于lysis buffer［10 mmol/L HEPES(pH 7.9)，1.5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L KCl，和0.5%NP-40］中，而后收集細(xì)胞至離心管中13 200 r/min離心10 min。選用Folin-酚法測定蛋白酶濃度，以每泳道40 μg蛋白等量上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h，Ⅰ抗(1∶1 000)孵育;Ⅱ抗使用羊抗兔IgG(1∶5 000)孵育后，進(jìn)行ECL檢測顯影、定影、洗印膠片。Caspase-3 antibody(rabbit，1∶1 000)、caspase-9 antibody(human specific，1∶1 000)、caspase-8 (1C12) antibody (mouse，1∶1 000)、Smac/Diablo antibody(mouse，1∶1 000)、Bid antibody(human specific，1∶1 000)、Bcl-2 antibody(rabbit，1 ∶1 000)、Bax antibody(rabbit，1∶1 000)、細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)antibody(rabbit;1∶1 000)、Bak antibody(rabbit，1∶1 000)和顆粒酶(granzyme)B antibody(rabbit，1∶1 000)均購自 Cell Signaling Technologies，其它抗體購自Santa Cruz Biotechnology。電泳條帶的強(qiáng)度用 Lab-Works Image Analysis software進(jìn)行定量分析。

3.7 線粒體和胞漿蛋白分離提取 根據(jù)線粒體分離試劑盒(Pierce)使用說明手冊操作。細(xì)胞接種于6孔板，DHA處理，終止培養(yǎng)后收集細(xì)胞至1.5 mL離心管中，在冰浴預(yù)冷的Mito-Cyto緩沖液中吹打重懸，移入Wheaten Dounce玻璃勻漿器冰浴中勻漿5 min。勻漿液于4℃、800×g離心10 min，取上清液進(jìn)一步于4℃、10 000×g離心30 min，收集上清液即得到的胞漿成分(不含細(xì)胞核和線粒體)。下面部分即為線粒體部分，用 Mito-Cyto緩沖液 (0.2 mL)重懸，600×g離心5 min，以去除一些顆粒物，再12 000×g離心15 min，懸浮在Mito-Cyto Buffer中的即為線粒體蛋白［13］。測定蛋白含量后進(jìn)行Western blotting分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。差異顯著性用單因素方差分析(ANOVA)與進(jìn)行多組樣本間差異顯著性分析或用Origin 7.0來進(jìn)行Fisher確切概率檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 Et-DHA對HepG2細(xì)胞數(shù)量的影響

HepG2細(xì)胞(1.0×108/L)在 10 μmol/L、30 μmol/L、100 μmol/L和300 μmol/L的Et-DHA培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后，隨著Et-DHA濃度上升，HepG2細(xì)胞的密度和數(shù)量顯著下降，與對照組相比分別為98%、90%、80%和70%，見圖1。

Figure 1. EffectofEt-DHA on numberofHepG2 cells (×100).A:control group;B:10 μmol/L Et-DHA;C:30 μmol/L Et-DHA;D:100 μmol/L Et-DHA;E:300 μmol/L Et-DHA.圖1 不同濃度Et-DHA處理對HepG2細(xì)胞數(shù)量的影響

2 Et-DHA對HepG2細(xì)胞活性的抑制作用

用MTT比色法檢測Et-DHA是否對HepG2細(xì)胞的活性具有抑制作用。Et-DHA作用24 h和48 h后，HepG2細(xì)胞的活性顯著降低。抑制作用隨著Et-DHA濃度(10、30、100和300 μmol/L)的增加以及時(shí)間的延長而增強(qiáng)，與對照組(0 μmol/L Et-DHA)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見圖2。

Figure 2.MTT assay was performed at 24 h and 48 h after the cells were exposed to Et-DHA.*P＜0.05 vs 0 μmol/L.圖2 不同濃度Et-DHA處理HepG2細(xì)胞24 h和48 h后的細(xì)胞生長抑制曲線

3 Et-DHA對HepG2細(xì)胞核形態(tài)的影響

如圖3所示，對照組細(xì)胞核發(fā)淡藍(lán)色，較大較圓，色澤均一，形態(tài)規(guī)則，表面光滑。100 μmol/L Et-DHA處理后，HepG2細(xì)胞核呈高染色密度，核濃縮，細(xì)胞膜出泡，核仁裂解，染色體在核膜周邊凝聚，凋亡小體形成，這些都呈現(xiàn)程序性細(xì)胞凋亡的特征。

Figure 3.Effect of Et-DHA on the morphology of HepG2 cell nucleus(×400).A:control group cells were pale blue and round;B:after treated with 100 μmol/L Et-DHA，the HepG2 cells revealed a marked nuclear condensation，membrane blebbing，nuclear fragmentation and apoptotic bodies，all of which were the characteristics of apoptotic programmed cell death.圖3 Et-DHA對HepG2細(xì)胞核形態(tài)的影響

4 Et-DHA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的機(jī)制

4.1 Et-DHA對HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS的影響 如圖4所示，與對照組比較，Et-DHA誘導(dǎo)HepG2的細(xì)胞ROS含量均明顯增加，且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。經(jīng)10、30、100和300 μmol/L Et-DHA處理后，DCF出現(xiàn)了近1.3、1.8、2.2和2.5倍的增加。研究表明ROS會(huì)導(dǎo)致線粒體膜通透性以及結(jié)構(gòu)的改變［14］，因而上述結(jié)果提示Et-DHA導(dǎo)致HepG2細(xì)胞ROS的大量產(chǎn)生，可能是誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的原因。

Figure 4.Effect of Et-DHA on the level of ROS in HepG2 cells.*P＜0.05 vs control group.圖4 Et-DHA對ROS量的影響

4.2 Et-DHA對HepG2細(xì)胞總SOD活性的影響Et-DHA作用48 h對HepG2細(xì)胞的總SOD活性并無顯著影響，提示Et-DHA處理后HepG2細(xì)胞的抗氧化能力水平?jīng)]有顯著改變，見表1。

表1 Et-DHA對HepG2細(xì)胞總SOD活性的影響Table 1.Effect of Et-DHA on total superoxide dismutase(SOD) activity in HepG2 cells(Mean±SD.n=3)

4.3 Et-DHA對HepG2細(xì)胞Bax、Bak和Bid線粒體轉(zhuǎn)位、Bid活化及Bcl-2表達(dá)的影響 不同濃度的Et-DHA作用HepG2細(xì)胞48 h后，線粒體上的Bax、Bak和Bid的水平均顯著高于對照組(P＜0.05);Bcl-2水平較對照組下調(diào)(P＜0.05)，表明Et-DHA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡可能主要激活了線粒體凋亡通路。而細(xì)胞質(zhì)中cleaved Bid上調(diào)，提示Et-DHA可能也激活了caspase-8凋亡途徑，從而活化Bid，見圖5。

4.4 Et-DHA對HepG2細(xì)胞Cyt C和Smac釋放的影響 Et-DHA作用HepG2細(xì)胞48 h后，胞漿中Cyt C和Smac水平呈劑量依賴性增加，而線粒體內(nèi)Cyt C和Smac呈劑量依賴性降低，見圖6。

Figure 5.Western blotting analysis of Bid activation，Bcl-2 expression，and Bax，Bak and Bid mitochondrial translocation during Et-DHA-induced apoptosis in HepG2 cells.圖5 Et-DHA對Bid活化、Bcl-2表達(dá)及Bax、Bak和Bid線粒體轉(zhuǎn)位的影響

Figure 6.Effects of Et-DHA on the release of Cyt C and Smac in HepG2 cells during apoptosis.圖6 Et-DHA對Cyt C和Smac釋放的影響

4.5 Et-DHA對HepG2細(xì)胞caspase-8、caspase-9和caspase-3的影響 如圖7所示 10 μmol/L以及30 μmol/L Et-DHA處理HepG2細(xì)胞48 h后，caspase-8和caspase-9酶原被同性活化，被切割成有活性的cleaved caspase-8和 cleaved caspase-9，其中 cleavedcaspase-9水平顯著增加，并具劑量-效應(yīng)關(guān)系。我們繼而檢測了下游的效應(yīng)分子 caspase-3，結(jié)果表明caspase-3酶原也被劑量依賴性切割成 cleaved caspase-3。以上結(jié)果表明Et-DHA主要通過線粒體內(nèi)源途徑以及部分caspase-8外源途徑交互作用，激活caspase-3，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。

Figure 7.Effects of Et-DHA on the activation of caspase-8，caspase-9 and caspase-3 in HepG2 cells.圖7 Et-DHA對caspase-8、caspase-9和caspase-3活化的影響

4.6 Et-DHA對HepG2細(xì)胞caspase-9活性的影響

Et-DHA作用HepG2細(xì)胞48 h后，HepG2細(xì)胞caspase-9活性增加，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，與對照組相比，P＜0.05，見圖8。此結(jié)果進(jìn)一步表明線粒體內(nèi)源途徑參與了Et-DHA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。

Figure 8.Effect of Et-DHA on caspase-9 activity in HepG2 cells after 48 h of exposure.*P＜0.05 vs control group.圖8 不同濃度 Et-DHA處理 HepG2細(xì)胞 48 h后對caspase-9活性的影響

4.7 Et-DHA對T細(xì)胞殺傷HepG2細(xì)胞的影響 10 μmol/L Et-DHA促使 T細(xì)胞增殖約70% ～90% (P＜0.05)，見圖9A。當(dāng)10 μmol/L Et-DHA與T細(xì)胞共同培養(yǎng)24 h后，HepG2細(xì)胞比單獨(dú)使用Et-DHA時(shí)顯著減少，并且具有時(shí)程-效應(yīng)關(guān)系(P＜0.05);當(dāng)培養(yǎng)48 h時(shí)，在Et-DHA和T細(xì)胞的共同作用下，HepG2細(xì)胞數(shù)量比Et-DHA單獨(dú)作用時(shí)顯著減少，見圖9B。以上結(jié)果表明Et-DHA可能通過活化T細(xì)胞，促進(jìn)HepG2凋亡。

4.8 Et-DHA對T細(xì)胞granzyme B蛋白表達(dá)的影響不同濃度的Et-DHA作用T細(xì)胞48 h后，granzyme B較對照組表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)，見圖10A;在Et-DHA作用于HepG2細(xì)胞或T細(xì)胞和HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，移去T細(xì)胞，共培養(yǎng)組HepG2細(xì)胞內(nèi)granzyme B水平較空白對照組以及HepG2組上調(diào)，granzyme B釋放到HepG2細(xì)胞內(nèi)較明顯，見圖10B。而空白對照組以及 Et-DHA組 HepG2內(nèi)granzyme B的水平很低(第1、2條帶)，在與T細(xì)胞共培養(yǎng)后，HepG2內(nèi)granzyme B的水平顯著增加(第3條帶)，而共培養(yǎng)體系中從HepG2細(xì)胞中洗脫的T細(xì)胞granzyme B較明顯(第4條帶)。以上結(jié)果表明Et-DHA可能通過誘導(dǎo)T細(xì)胞釋放granzyme B，殺傷HepG2細(xì)胞，從而間接誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。

討論

在近來研究中，EPA和DHA因其具有的預(yù)防、抑癌能力及改善心血管功能等功效而倍獲關(guān)注［1，15］。目前國內(nèi)外已有許多關(guān)于EPA和DHA抗癌機(jī)制的研究，主要集中在以下幾方面:(1)改變腫瘤細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，(2)破壞機(jī)體脂肪酸的形成，(3)阻斷腫瘤細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，(4)改變體內(nèi)的脂類代謝［16］。本研究旨在探究Et-DHA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡是否依賴于脂質(zhì)過氧化物的過度積累觸發(fā)凋亡效應(yīng)，以及Et-DHA激活T細(xì)胞后抑癌作用的分子機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Et-DHA作用于HepG2細(xì)胞24 h后，均可觀察到各濃度實(shí)驗(yàn)組的HepG2細(xì)胞的密度呈劑量依賴性下降，非貼壁的漂浮細(xì)胞增多。這與Araseki等［17］的研究顯示HepG2細(xì)胞經(jīng)油酸、花生四烯酸和DHA聯(lián)合處理后，HepG2細(xì)胞存活率呈濃度依賴性下降的結(jié)果較一致。MTT檢測結(jié)果顯示，Et-DHA對HepG2細(xì)胞的存活率有顯著抑制作用，隨著Et-DHA的濃度和給藥持續(xù)時(shí)間的增加，抑制率顯著增強(qiáng)。在Hochest 33258熒光染色實(shí)驗(yàn)中，Et-DHA各濃度組細(xì)胞核呈高染色密度，染色體呈強(qiáng)藍(lán)色熒光，核仁裂解，染色體在核膜周邊凝聚，碎裂等在細(xì)胞程序性凋亡過程中的特征，而對照組細(xì)胞不呈現(xiàn)以上特征，暗示Et-DHA可能通過脂質(zhì)過氧化等途徑誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡［14，16］。

Figure 9.Effect of Et-DHA on HepG2 cells during co-cultured with T cells(×100).A:T cells treated with Et-DHA;B:HepG2 cells treated with Et-DHA and co-cultured with T cells.圖9 HepG2細(xì)胞與T細(xì)胞共培養(yǎng)24 h和48 h后，Et-DHA對HepG2細(xì)胞的影響

DHA作為一種長鏈多不飽和脂肪酸，富集于細(xì)胞膜上，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，容易受到其他離子的攻擊，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。DHA可通過氧化應(yīng)激，增強(qiáng)細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化作用、抑制類花生酸的生物合成等方面誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［1，14］。盡管本實(shí)驗(yàn)檢測Et-DHA處理HepG2細(xì)胞后，各濃度組總SOD活力并無明顯變化，HepG2腫瘤細(xì)胞的抗氧化水平即清除ROS水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的改變，但檢測出ROS呈劑量性顯著升高，提示這可能與Et-DHA處理HepG2細(xì)胞后，膜上含有大量的易被氧化的DHA，氧化應(yīng)激引起脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)有關(guān)，與DHA通過影響ROS代謝從而調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞生長和死亡機(jī)理類似［5］，也與乳腺癌病人每天補(bǔ)充DHA血液循環(huán)磷脂增加后，其化療效果明顯改善的機(jī)制類似［12］。而過量累積的ROS會(huì)導(dǎo)致線粒體DNA損傷、以及線粒體膜通透性以及結(jié)構(gòu)的改變，繼而引發(fā)凋亡效應(yīng)［14］。結(jié)果與直接暴露HepG2細(xì)胞于2 mmol/L過氧化氫，產(chǎn)生氧化應(yīng)激能誘導(dǎo) HepG2肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制類似［17］

細(xì)胞接受凋亡信號(hào)(ROS、不可修復(fù)DNA損傷等)后，胞內(nèi)凋亡信號(hào)“感受器”(Bid、Bad等)被活化的caspase-8切割后，也被活化，從而對Bcl-2家族包括凋亡抑制因子(Bcl-2、Bcl-xL)等起拮抗作用。從而使處于抑制狀態(tài)的凋亡促進(jìn)因子(Bax、Bak等)釋放出來，從細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移到線粒體外膜上，并發(fā)生寡聚化，并與膜上電壓依賴性陰離子通道相互作用，改變膜的通透性，使線粒體內(nèi)的凋亡因子 Cyt C和Smac等釋放到細(xì)胞質(zhì)中，引發(fā)細(xì)胞凋亡［18］。本研究通過Western blotting測定Et-DHA處理HepG2細(xì)胞后，線粒體上的Bax、Bak以及Bid水平上調(diào)，胞漿中的Bid被切割，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，而Bax/Bcl-2比值的改變可影響細(xì)胞對誘發(fā)凋亡的敏感性，揭示Et-DHA可能通過激活線粒體途徑，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡。我們進(jìn)一步檢測到胞漿中的Cyt C和Smac水平升高，而線粒體中的 Cyt C和 Smac水平下降，提示HepG2細(xì)胞接收凋亡信號(hào)后，在Bax和Bak等凋亡因子的作用下，通透性增加，Cyt C和Smac從線粒體中釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而激活下游的 caspase-9及caspase-8家族等凋亡因子。本結(jié)果與DHA通過選擇性調(diào)節(jié)凋亡蛋白和通路，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞生長和死亡的機(jī)制類似［5］。

Figure 10.Western blotting analysis of granzyme B secreted by T cells(TC)and penetrated into HepG2 cells during co-culture and Et-DHA(DHA)treatment for 24 h.A:effect of DHA on granzyme B protein expression in TC;B:granzyme B protein in HepG2 cells without treatment(HepG2)，DHA-treatedHepG2 cells (DHA+HepG2)，DHA-treated HepG2 cells co-cultured with TC(TC were removed;DHA+HepG2/ TC)，and TC washed from DHA-treated HepG2 cell co-culture(DHA+TC).圖10 Et-DHA對T細(xì)胞和HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)體系中g(shù)ranzyme B表達(dá)的影響

Caspases家族是驅(qū)動(dòng)凋亡的分子開關(guān)，起始caspase以及效應(yīng)caspase具有同性活化和異性活化的特征。被活化的 caspase-9和caspase-8則接著激活位于級聯(lián)反應(yīng)下游的效應(yīng)caspase-3，使級聯(lián)反應(yīng)快速地?cái)U(kuò)大。而caspase-9是線粒體的凋亡程序中不可或缺的起始因子，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HepG2細(xì)胞經(jīng)Et-DHA處理后，caspase-9和 caspase-3被切割成cleaved caspase-9和cleaved caspase-3，caspase-9的活性大大提高，且與其濃度呈正相關(guān)，提示caspase-9是Et-DHA抑制HepG2細(xì)胞生長的重要參與者。凋亡程序的開始信號(hào)到達(dá)線粒體以后，誘導(dǎo)線粒體排放出Cyt C，之后Cyt C與凋亡蛋白酶活化因子1反應(yīng)，并使其空間結(jié)構(gòu)改變成為八聚體，后者和caspase-9反應(yīng)并導(dǎo)致它開始活化自身，進(jìn)而切割下游的caspase-3?；罨男?yīng) cleaved caspase-3可活化caspase激活的脫氧核糖核酸酶，切割DNA成200 bp的DNA片段，誘發(fā)HepG2細(xì)胞凋亡。根據(jù)以上結(jié)果推測，Et-DHA處理后HepG2細(xì)胞的凋亡方式，與白細(xì)胞介素4誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡類似，主要與線粒體凋亡途徑相關(guān)［13］。

此外，我們的結(jié)果還顯示細(xì)胞質(zhì)中caspase-8和Bid也微弱地被切割，并且Smac的水平升高。以上結(jié)果提示，Et-DHA抑制HepG2細(xì)胞生長，也可能部分通過激活caspase-8內(nèi)源凋亡途徑。這與EPA通過ROS堆積、caspase-8活化以及自噬誘導(dǎo)胰腺癌凋亡的機(jī)制類似［13］。

先前的研究表明自然殺傷細(xì)胞對不同肝癌細(xì)胞株(K562、BEL-7402、SMMC-7721和HepG2)具有一定的殺傷作用［19］，那么Et-DHA在機(jī)體內(nèi)是否可通過活化T淋巴細(xì)胞perforin-granzyme B途徑來誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡呢?為了驗(yàn)證以上設(shè)想，我們采用淋巴細(xì)胞和HepG2共培養(yǎng)體系，模擬了機(jī)體內(nèi)細(xì)胞生存環(huán)境，觀察Et-DHA是否間接通過激活T細(xì)胞，從而增加 T細(xì)胞殺傷 HepG2效應(yīng)。結(jié)果表明Et-DHA誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖，當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)，與Et-DHA單獨(dú)處理HepG2細(xì)胞相比，其凋亡率更顯著。以上結(jié)果暗示Et-DHA通過活化T淋巴細(xì)胞，促使增殖，并釋放細(xì)胞因子，對HepG2細(xì)胞的毒性增強(qiáng)，從而間接抑制HepG2細(xì)胞的生長［20］。

當(dāng)激活的細(xì)胞毒性T細(xì)胞與靶細(xì)胞結(jié)合后，經(jīng)顆粒胞吐方式，效應(yīng)細(xì)胞釋放致密的胞質(zhì)顆粒及其內(nèi)容物到達(dá)靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)處，對靶細(xì)胞進(jìn)行致死性的攻擊。在脫顆粒過程中釋放許多大分子物質(zhì)，其中最主要的為granzyme B，檢測T細(xì)胞granzyme B分子的表達(dá)可以直接反映T細(xì)胞的殺傷力［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，DHA作用后，T細(xì)胞內(nèi)以及HepG2細(xì)胞內(nèi)granzyme B均較對照組明顯升高(P＜0.05)，表明DHA通過活化T細(xì)胞，上調(diào)granzyme B的表達(dá)，從而在機(jī)體內(nèi)間接增強(qiáng)誘導(dǎo)HepG2凋亡。而在T細(xì)胞的增殖活化過程中，ERK1/2信號(hào)通路扮演著重要角色。DHA是否通過抑制ERK1/2信號(hào)通路，有待進(jìn)一步研究。

總之，在Et-DHA誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的過程中，caspase-9以及granzyme B扮演了重要角色。本研究的結(jié)果將為臨床上利用n-3多不飽和脂肪酸預(yù)防及輔助治療人類肝癌提供一定依據(jù)，無論單獨(dú)使用或是結(jié)合化療藥物聯(lián)合輔助使用都可能是一種高效、對正常細(xì)胞無毒性、安全的肝癌病人的生物預(yù)防和治療策略。

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Et-DHA induces apoptosis of HepG2 cells through activation of mitochondrial pathway and induction of granzyme B expression in T cells

CHEN Kun1，CHEN Yong-shun1，WANG Xue-jun1，CHEN Yun-fan1，LIU Ke-li1，CHEN Feng-jia2，LU Jian-jun2

(1Institute of Gene Interference，Guangzhou University，Guangzhou 510006，China;2Department of Thoracic Surgery，the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China.E-mail:kchennju@hotmail.com)

AIM:To investigate the effect of ethyl docosahexaenoate(Et-DHA)on the apoptosis of human hepatocarcinoma HepG2 cells.METHODS:HepG2 cells were used to test the anticarcinogenicity of Et-DHA.The direct inhibition of HepG2 cells by Et-DHA was detected by MTT.Nuclear morphological features of the HepG2 cells were observed under fluorescence microscope after staining with Hochest 33258.The levels of Bax，Bak，Bid，Bcl-2，Smac and cytochrome C(Cyt C)in mitochondria and cytosol，the cleaved caspase-8，cleaved caspase-9，and cleaved caspase-3 in cytosol，as well as the release of reactive oxygen species(ROS)，total superoxide dismutase(SOD)and caspase-9 activity in the Et-DHA-treated HepG2 cells were determined by Western blotting and ELISA.Furthermore，by co-culturing the HepG2 cells with T cells，the effects of proliferation of Et-DHA-treated T cells on the activity of HepG2 cells were observed，and the level of granzyme B was detected.RESULTS:Et-DHA significantly inhibited the growth of HepG2 cells ina concentration-and time-dependent manner.The ROS release and caspase-9 activity increased markedly in Et-DHA-treated HepG2 cells，and no significant change of the total SOD activity was observed.The levels of the pro-apoptotic proteins Bax，Bak and Bid in mitochondria increased，the anti-apoptotic protein Bcl-2 as well as mitochondrial Cyt C and Smac levels decreased，and the cytoplasmic Cyt C，Smac，cleaved caspase-8，cleaved caspase-9，cleaved caspase-3 and cleaved Bid levels showed dose-dependent increases.Additionally，the degree of Et-DHA-induced apoptosis in HepG2 cells in the co-culture group(T cells+HepG2 cells)showed a further increase as compared with the HepG2 cells treated with Et-DHA alone.Due to Et-DHA inducing elevation of granzyme B level in the T cells，the granzyme B released into HepG2 cells was significantly increased.CONCLUSION:Et-DHA might induce the apoptosis of HepG2 cells through activation of caspase-3 mainly via a mitochondrial intrinsic pathway and a caspase-8 pathway，and promote the increase in granzyme B indirectly by activating T cells，thus enhancing the cytotoxic effect on HepG2 cells.

Docosahexaenoic acids;HepG2 cells;Caspase-9;Granzyme B;Cytochrome C;Smac protein

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.03.001

1000-4718(2014)03-0385-09

2013-11-15

2014-01-20

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.31171281);廣州市教育局科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.10A044)

△通訊作者Tel:020-87755766;E-mail:kchennju@hotmail.com