畢仁兵,郭德良,潘定宇,劉志蘇,胡守國

(1.湖北省荊門市第一人民醫(yī)院膽胰血管外科,荊門 448000;2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院肝膽胰外科,武漢 430071)

白藜蘆醇對肝癌Bel-7404細(xì)胞體外放射治療的影響

畢仁兵1,郭德良1,潘定宇2,劉志蘇2,胡守國1

(1.湖北省荊門市第一人民醫(yī)院膽胰血管外科,荊門 448000;2.武漢大學(xué)中南醫(yī)院肝膽胰外科,武漢 430071)

目的 探討白藜蘆醇(Res)聯(lián)合體外放射治療(放療)對肝癌Bel-7404細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡的影響。方法25 μmol·L-1Res聯(lián)合放療處理肝癌Bel-7404細(xì)胞,并將細(xì)胞分為4組:對照組,2 Gy放療組,4 Gy放療組,6 Gy放療組,噻唑藍(lán)(MTT)法檢測腫瘤細(xì)胞的增殖及運(yùn)動侵襲能力,熒光顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡,Western-blot法檢測細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶2 (MMP-2)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果與對照組比較,2 Gy放療組、4 Gy放療組、6 Gy放療組肝癌Bel-7404細(xì)胞增殖能力及侵襲能力均下降,凋亡細(xì)胞增多(P＜0.05)。結(jié)論Res能增強(qiáng)肝癌Bel-7404細(xì)胞對放療的敏感性,放療聯(lián)合Res可使肝癌細(xì)胞增殖受抑,侵襲減弱,凋亡增加,其原因與降低MMP-2、VEGF蛋白表達(dá)有關(guān)。

白藜蘆醇;細(xì)胞凋亡;Bel-7404細(xì)胞;放療增敏

原發(fā)性肝癌是最常見的實(shí)體器官惡性腫瘤之一,該病早期無明顯典型癥狀,近90%的患者檢出疾病時已屬中晚期,喪失手術(shù)機(jī)會,僅15%～25%的肝癌患者有機(jī)會接受手術(shù)治療[1-3]。因此放射治療(放療)、化學(xué)治療(化療)及術(shù)后綜合治療成為肝臟腫瘤學(xué)的研究熱點(diǎn)。肝癌放療的理論基礎(chǔ)是肝癌組織在放療中是早反應(yīng)組織,即對放療敏感,而正常肝組織屬晚反應(yīng)組織,數(shù)月后才表現(xiàn)出放射損傷。肝細(xì)胞對放射照射的耐受量低于肝癌細(xì)胞根治量,故常規(guī)放療過程中不能兼顧正常組織并發(fā)癥概率和腫瘤控制概率。聯(lián)合應(yīng)用放療增敏藥可以使低劑量放療達(dá)到高劑量放療的效果,間接降低肝損傷。白藜蘆醇(resveratrol,Res)作為植物抵抗外界刺激如紫外線、真菌和病毒感染或機(jī)械損傷產(chǎn)生的一種多酚化合物,在花生、藜蘆、葡萄等植物廣泛存在[4-5]。20世紀(jì)90年代,JAYAFILAKE等研究認(rèn)為,反式白藜蘆醇和順式白藜蘆醇均可通過抑制蛋白質(zhì)-酪氨酸激酶的活性發(fā)揮抗癌作用。后期研究發(fā)現(xiàn),Res在腫瘤的啟動、促進(jìn)及發(fā)展階段均表現(xiàn)出抑制甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤作用[6-7]。因此Res可能在肝癌的放療中有增敏作用。筆者在本研究中觀察Res對肝癌Bel-7404細(xì)胞體外放療的影響,以期揭示該作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 肝癌Bel-7404細(xì)胞株(購自武漢大學(xué)典型生物保藏中心,批號:100662-200401,傳至第4代)。

1.2 藥物與試劑 Res(購自美國Sigma公司,純度> 95%,批號:111535,以無血清1640培養(yǎng)液稀釋至0.01 mol·L-1,密封保存于4℃冰箱,使用前取適量以無血清1640培養(yǎng)液調(diào)配至所需濃度);兔抗人β-actin抗體(購自美國Sigma公司,批號:A5316);辣根過氧化物酶(Goat anti-chicken igh/HRP,HRP)標(biāo)記的羊抗兔抗體(購自北京博奧森生物技術(shù)公司,批號: BSE-0310G);兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2,MMP-2)抗體(批號:sc-205389)及兔抗人血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)抗體(批號:sc-7218)購自美國Santacruz公司;Transwell侵襲小室購自美國Costar公司; AnnexinⅤ-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司(批號:20120417);超敏電化學(xué)發(fā)光(electro-chemi-luminescence,ECL)試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司(批號:P0006);蛋白提取試劑盒購自上海生工生物工程公司;Bradford蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司;聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜(0.45 μm)購自美國Millipore公司(批號:k1ma4925uk)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 以噻唑藍(lán)(thiazolyl blue,MTT)比色法及熒光顯微鏡檢測Res對肝癌Bel-7404細(xì)胞增殖及凋亡的影響。25 μmol·L-1Res用于聯(lián)合放療,將細(xì)胞分為4組:對照組、2 Gy放療組、4 Gy放療組、6 Gy放療組。

照射方法:采用Varian 2100C型電子直線加速器,劑量率為400 cGy·min-1的6 MV X線,進(jìn)行一次性照射。射線從細(xì)胞貼壁面垂直入射,并加墊厚度1.0 cm有機(jī)玻璃板。觀察細(xì)胞生長狀況,細(xì)胞處理后按常規(guī)培養(yǎng)方法繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.1 MTT比色法檢測Res聯(lián)合不同劑量放療對肝癌Bel-7404細(xì)胞增殖影響 干預(yù)后按常規(guī)培養(yǎng)方法繼續(xù)培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞,MTT法測定存活率,酶標(biāo)儀波長490 nm處測吸光度(A)值,重復(fù)3次。計(jì)算平均值,根據(jù)A值測定肝癌Bel-7404細(xì)胞存活率。存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值×100%。

1.3.2 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測Res對肝癌Bel-7404細(xì)胞趨化運(yùn)動性影響 取干預(yù)后按常規(guī)培養(yǎng)方法繼續(xù)培養(yǎng)24 h的細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105·mL-1,將各組細(xì)胞接種于96孔板,吸取細(xì)胞懸液200 μL加入Transwell小室上室。檢測Res對Bel-7404細(xì)胞趨化運(yùn)動性影響,100倍倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)5個不同視野穿膜細(xì)胞數(shù),取平均值,每組重復(fù)3次。

1.3.3 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測各組肝癌Bel-7404細(xì)胞侵襲能力 制備Transwell小室成功后,用移液槍吸取5×105·mL-1細(xì)胞懸液200 μL,加入Transwell小室上室,檢測Bel-7404細(xì)胞侵襲能力,100倍倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)5個不同視野穿膜細(xì)胞數(shù),取平均值,每組重復(fù)3次。

1.3.4 熒光顯微鏡檢測Res誘導(dǎo)肝癌Bel-7404細(xì)胞凋亡 取干預(yù)后按常規(guī)培養(yǎng)方法繼續(xù)培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞,冷磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS)洗滌蓋玻片上細(xì)胞2次;在500 μL Binding Buffer中加入AnnexinⅤ-FITC/PI各5 μL;避光孵育后在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察,AnnexinⅤ-FITC熒光信號呈綠色,PI熒光信號呈紅色。

1.3.5 Western blot法檢測MMP-2、VEGF蛋白表達(dá)變化 收集干預(yù)后按常規(guī)培養(yǎng)方法繼續(xù)培養(yǎng)24 h的各組細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,變性后取40 μg,經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上, 5%脫脂牛奶封閉1 h,加MMP-2(1∶200)、VEGF(1∶400)一抗4℃孵育過夜。用TBST洗4次,每次5 min。加二抗(1∶3 000),37℃孵育60 min。ECL化學(xué)發(fā)光檢測目的蛋白信號。以β-actin為內(nèi)參,利用灰度分析法檢測蛋白條帶的相對蛋白含量。

2 結(jié)果

2.1 Res聯(lián)合放療對肝癌Bel-7404細(xì)胞增殖的影響MTT比色法檢測各組肝癌Bel-7404細(xì)胞增殖能力,對照組、2 Gy放療組、4 Gy放療組、6 Gy放療組的A值分別為(0.451±0.018),(0.315±0.016),(0.227±0.009), (0.154±0.012)。與對照組比較,2 Gy放療組、4 Gy放療組、6 Gy放療組肝癌Bel-7404細(xì)胞增殖能力明顯降低(P＜0.05),Res聯(lián)合放療對肝癌Bel-7404細(xì)胞增殖的抑制作用隨放療劑量的增加逐漸增強(qiáng)。

2.2 Res聯(lián)合放療對肝癌Bel-7404細(xì)胞趨化運(yùn)動性影響 Res聯(lián)合放療能夠抑制肝癌Bel-7404細(xì)胞的趨化運(yùn)動性,對照組、2 Gy放療組、4 Gy放療組、6 Gy放療組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(188.33±24.51),(163.00± 15.57),(147.67±12.51),(139.67±9.69)。與對照組比較,2 Gy放療組、4 Gy放療組、6 Gy放療組肝癌Bel-7404細(xì)胞趨化運(yùn)動性明顯降低(P＜0.05)。Res對肝癌Bel-7404細(xì)胞趨化運(yùn)動性的抑制作用隨放療劑量的增加逐漸增強(qiáng)。

2.3 Res聯(lián)合放療對肝癌Bel-7404細(xì)胞侵襲能力的影響 Res聯(lián)合放療能夠抑制肝癌Bel-7404細(xì)胞的侵襲能力,對照組、2 Gy放療組、4 Gy放療組、6 Gy放療組的穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(136.62±8.25),(121.50± 12.15),(99.25±14.02),(54.25±6.50)。與對照組比較,2 Gy放療組、4 Gy放療組、6 Gy放療組肝癌Bel-7404細(xì)胞的侵襲能力明顯降低(P＜0.05)。Res對肝癌Bel-7404細(xì)胞侵襲能力的抑制隨放療劑量的增加逐漸增強(qiáng)。

2.4 Western blot法檢測MMP-2、VEGF蛋白表達(dá)變化 與對照組比較,隨著放療劑量逐漸增加,肝癌Bel-7404細(xì)胞內(nèi)MMP-2蛋白表達(dá)逐漸降低(圖1),呈放療劑量依賴性。VEGF蛋白表達(dá)量(圖2)隨放療劑量增加也逐漸降低,呈放療劑量依賴性。

A.對照組;B.2 Gy放療組;C.4 Gy放療組;D.6 Gy放療組圖1 Western blot檢測各組干預(yù)后對肝癌Bel-7404細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)的影響A.control group;B.2 Gy radiation group;C.4 Gy radiation group;D.6 Gy radiation groupFig.1 Effect of treatment on MMP-2 protein expression in Bel-7404 cells detected by Western blotting

A.對照組;B.2 Gy放療組;C.4 Gy放療組;D.6 Gy放療組圖2 Western blot檢測各組干預(yù)后對肝癌Bel-7404細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)的影響A.control group;B.2 Gy radiation group;C.4 Gy radiation group;D.6 Gy radiation groupFig.2 Effect of treatment on VEGF protein expression in Bel-7404 cells detected by Western blotting

2.5 熒光顯微鏡檢測Res誘導(dǎo)肝癌Bel-7404細(xì)胞凋亡 AnnexinⅤ-FITC熒光信號呈綠色,PI熒光信號呈紅色。因此,細(xì)胞染色呈單純的綠色表明為早期凋亡,綠色和紅色兼有表明為晚期凋亡,呈單純的紅色為死亡。見圖3。

3 討論

現(xiàn)代放射生物學(xué)認(rèn)為,鑒別腫瘤細(xì)胞存活的標(biāo)準(zhǔn)不再是單個細(xì)胞的存活,而是其是否喪失了無限增殖的能力。不同細(xì)胞周期的細(xì)胞對電離輻射的敏感性不同,處于S期和G0期細(xì)胞對放射不敏感,M期和G2后期細(xì)胞最敏感[6]。因此通過外部因素調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的長短以期獲得較長的敏感窗口期可以增強(qiáng)放射治療的效果。白藜蘆醇可活化Caspasea,釋放細(xì)胞色素C,抑制DNA聚合酶活性,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,將細(xì)胞周期阻滯于S期和G2期[8]。

DELMAS等[8]進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)表明,Res對人HepG2及鼠Fao細(xì)胞的增殖均有抑制作用,Res可以促使更多的細(xì)胞滯留于G2/M期。同時,荷瘤大鼠實(shí)驗(yàn)[9]發(fā)現(xiàn),其對腫瘤的抑制作用與G2/M時相細(xì)胞數(shù)增多及腫瘤細(xì)胞凋亡數(shù)增多有很大關(guān)系。

以Res作為放療增敏藥,觀察其聯(lián)合放療對肝癌Bel-7404細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡的影響,結(jié)果顯示放療聯(lián)合Res可以有效增強(qiáng)對肝癌Bel-7404細(xì)胞放射治療的效果,肝癌Bel-7404細(xì)胞的增殖受抑,侵襲減弱,凋亡增加。這可能與Res促使更多的腫瘤細(xì)胞滯留于G2/M期,而此期的放療敏感性較高有關(guān)。

MMP-2及VEGF均與腫瘤血管的生成、腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10-12],它們通過調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附的作用,建立新的細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的粘附關(guān)系,促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[13],通過增加血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,促進(jìn)新生血管的形成,加速腫瘤的生長[14-15]。研究已經(jīng)證實(shí),在肺癌、胃癌、宮頸癌等惡性腫瘤組織中均有MMPs及VEGF過表達(dá)現(xiàn)象[16]。

A.對照組;B.2 Gy放療組;C.4 Gy放療組;D.6 Gy放療組圖3 熒光顯微鏡檢測Res聯(lián)合放療誘導(dǎo)肝癌Bel-7404細(xì)胞凋亡(×100)A.control group;B.2 Gy radiation group;C.4 Gy radiation group;D.6 Gy radiation groupFig.3 Cell apoptosis induced by Res combined with Radiation detected by Flurecenee Microscope(×100)

運(yùn)用Western blot檢測Res聯(lián)合放療對肝癌Bel-7404細(xì)胞MMP-2、VEGF蛋白的表達(dá)變化,MMP-2、VEGF蛋白的表達(dá)隨放療劑量的增加受抑制。以熒光顯微鏡檢測Res聯(lián)合放療誘導(dǎo)肝癌Bel-7404細(xì)胞凋亡顯示,隨著放療劑量的增加,凋亡細(xì)胞數(shù)量增加。因此,其對肝癌Bel-7404細(xì)胞的增殖能力、侵襲性的抑制及凋亡的誘導(dǎo)促進(jìn)與MMP-2、VEGF蛋白的表達(dá)受抑相關(guān)。

綜上所述,Res能促使更多的腫瘤細(xì)胞滯留于G2/ M期,增強(qiáng)肝癌Bel-7404細(xì)胞對放療的敏感性。放療聯(lián)合Res可使肝癌細(xì)胞增殖受抑,侵襲減弱,凋亡增加,可能與MMP-2和VEGF蛋白的表達(dá)被抑制相關(guān)。

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DOI 10.3870/yydb.2014.11.011

Effects of Resveratrol Combined with Radiotherapy on Human Hepatoma Cell Line Bel-7404 in Vitro

BIRen-bing1,GUODe-liang1,PANDing-yu2,LIUZhi-su2,HUShou-guo1
(1.Departmentof Hepatopancreatobiliary Surgery,the First People's Hospital of Jingmen City,Hubei Province,Jingmen 448000, China;2.Department of Hepatopancreatobiliary Surgery,Zhongnan Hospital,Wuhan University,Wuhan 430071, China)

ObjectiveTo investigate the effects of radiotherapy combined with resveratrol(Res)on proliferation, invasion and apoptosis of hepatoma cell line Bel-7404.MethodsBel-7404 cell line was treated with Res(25 μmol·L-1) combined with radiotherapy,then divided into four groups(group 1:the control;group 2:radiation at dose of 2 Gy;group 3: radiation at dose of 4 Gy;group 4:radiation at dose of 6 Gy).Cell proliferation and invasion were detected by MTT assay.Cell apoptosis were observed by fluorescence microscopy.Expressions of MMP-2 and VEGF proteins were determined by Western blotting.ResultsCompared with the control group,cell proliferation and invasion were significantly inhibited,while cell apoptosis was increased in all radiation groups(P＜0.05).ConclusionThe sensitivity of hepatoma Bel-7404 cells to radiation can be enhanced by resveratrol.Radiation therapy combined with resveratrol can inhibit proliferation and invasion of hepatoma cells and increase the cell apoptosis,which may be related with the down-regulation of MMP-2 and VEGF proteins.

Resveratrol;Apoptosis;Hepatoma cells Bel-7404;Radiotherapy sensitization

R286;R965

A

1004-0781(2014)11-1442-04

2013-08-18

2013-09-20

畢仁兵(1979-),男,湖北石首人,主治醫(yī)師,碩士,研究方向:肝膽胰惡性腫瘤綜合治療。電話:0724-2305775,E-mail:4346193@qq.com。

胡守國(1963-),男,湖北荊州人,主任醫(yī)師,學(xué)士,研究方向:肝膽胰惡性腫瘤綜合治療。電話:0724-2305771,E-mail:guoxueshi@gmail.com。