白靜,胡雷,張麗,田春雨,龐得全,薄海美,韓淑英

(1.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理系,唐山 063000;2.河北省唐山市工人醫(yī)院麻醉科,唐山 063000)

艾葉發(fā)酵物治療系統(tǒng)性白念珠菌感染*

白靜1,胡雷1,張麗2,田春雨1,龐得全1,薄海美1,韓淑英1

(1.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理系,唐山 063000;2.河北省唐山市工人醫(yī)院麻醉科,唐山 063000)

目的 觀察艾葉發(fā)酵物對(duì)系統(tǒng)性白念珠菌感染的治療作用,并探討其可能機(jī)制。方法建立免疫抑制小鼠系統(tǒng)性白念珠菌感染模型。將模型小鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組,艾葉發(fā)酵物小、中、大劑量組(100,200,400 mg·kg-1)及氟康唑組(20 mg·kg-1),每組30只。小鼠灌胃給予相應(yīng)治療藥物,bid,連續(xù)給藥5 d。計(jì)算模型建立后21 d各組小鼠生存率,酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法測(cè)定小鼠血清γ-干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素2(IL-2)水平,噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖活性,平板計(jì)數(shù)法測(cè)定小鼠肝、腎組織活菌數(shù)目。結(jié)果與模型對(duì)照組比較,艾葉發(fā)酵物中、大劑量組和氟康唑組小鼠存活率,血清IFN-γ、IL-2水平及脾臟T淋巴細(xì)胞增殖活性均較高,而肝、腎組織白念珠菌數(shù)目較低(P＜0.01);與艾葉發(fā)酵物小劑量組比較,中、大劑量組和氟康唑組上述各指標(biāo)變化更顯著(P＜0.05或P＜0.01),但中、大劑量組與氟康唑組間比較,各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論艾葉發(fā)酵物200～400 mg·kg-1對(duì)系統(tǒng)性白念珠菌感染有一定治療作用,其機(jī)制可能與其提高T淋巴細(xì)胞增殖活性及IFN-γ、IL-2水平相關(guān)。

艾葉發(fā)酵物;感染白念珠菌

艾葉為我國(guó)傳統(tǒng)中藥,具有除濕止癢、抗菌消炎、抗腫瘤等功效[1-2],為提高艾葉抗菌作用,筆者在本研究采用中藥發(fā)酵技術(shù),將艾葉制成艾葉發(fā)酵物,通過(guò)測(cè)定白念珠菌感染小鼠生存率及小鼠肝、腎組織中白念珠菌數(shù)目,考察艾葉發(fā)酵物對(duì)小鼠系統(tǒng)性念珠菌感染是否具有治療作用。并通過(guò)測(cè)定小鼠脾臟T細(xì)胞增殖活性及血清γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)和白細(xì)胞介素-2(interleukin-2,IL-2)水平,考察該發(fā)酵物作用機(jī)制是否與增強(qiáng)免疫力相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明小鼠,體質(zhì)量18～22 g,雌性,購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(京)2009-0008。飼養(yǎng)環(huán)境:溫度25～26℃,相對(duì)濕度50%～60%,全新風(fēng)單向流動(dòng),空氣潔凈度達(dá)1萬(wàn)級(jí)。

1.2 受試藥物的制備 艾葉采自內(nèi)蒙古通遼,經(jīng)河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院韓淑英教授鑒定為菊科植物艾(Folium ArtemisiaeArgyi.)的干燥葉。艾葉水提物:將艾葉研碎,水浴加熱煮沸2 h后,4層紗布過(guò)濾,濾渣繼續(xù)浸煮2 h,將兩次濾液合并,濃縮至每100 mL含生藥100 g。艾葉發(fā)酵物:取高壓滅菌后的增菌液體培養(yǎng)液(蛋白胨40 g,酵母浸粉20 g,葡萄糖40 g于1 000 mL純化水中)于無(wú)菌容器內(nèi),無(wú)菌環(huán)境下加安琪干酵母100 g,置37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h。將活化增殖的酵母菌液加入等體積上述艾葉水提物、6%蛋白胨、6%葡萄糖,混合均勻后繼續(xù)發(fā)酵。發(fā)酵條件:培養(yǎng)溫度37℃,培養(yǎng)時(shí)間72 h。發(fā)酵結(jié)束后,將發(fā)酵物加入無(wú)水乙醇,使乙醇終濃度達(dá)到70%,在70℃萃取4 h,將提取液離心15 min,2 500 r·min-1(r=15 cm)。取上清液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上回收乙醇,回收乙醇后的剩余液即為醇提后的艾葉發(fā)酵物。每100 mL艾葉發(fā)酵物含生藥50 g。

1.3 試劑 氟康唑注射液(安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn),規(guī)格:100 mL含氟康唑0.2 g,氯化鈉0.9 g,批號(hào):1109184A)。注射用環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn),規(guī)格:0.2 g,批號(hào):11021821)。沙氏培養(yǎng)液(北京博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司,批號(hào): 20110826)。IFN-γ(批號(hào):0706127)、IL-2(批號(hào): 0706125)試劑盒由上海森雄科技實(shí)驗(yàn)有限公司提供。

1.4 菌株 白念珠菌臨床新分離菌株,由開灤醫(yī)院檢驗(yàn)科提供并由河北聯(lián)合大學(xué)微生物系李靜副教授鑒定為白念珠菌株。經(jīng)沙氏培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h,置4℃冰箱保存?zhèn)溆?。挑取新培養(yǎng)白念珠菌菌落混懸于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)液中,震蕩使之充分混勻,應(yīng)用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)節(jié)濃度至2× 106·mL-1。

1.5 儀器 MLS-3750高壓滅菌器(日本SANYO產(chǎn)), HR40-IIA2生物安全柜(青島海爾公司產(chǎn)),Coic倒置顯微鏡XDS-1B(重慶光電儀器有限公司產(chǎn)),二氧化碳(CO2)恒溫培養(yǎng)箱2123TC(美國(guó)SHEL-LAB產(chǎn))。

1.6 模型建立、分組給藥及各組小鼠存活率測(cè)定 小鼠腹腔內(nèi)一次性注射環(huán)磷酰胺200 mg·kg-1,每只0.2 mL,制備免疫抑制小鼠模型。4 d后經(jīng)小鼠尾靜脈注射2×106·mL-1白念珠菌菌液,每只0.2 mL[3]。將成模小鼠隨機(jī)分為5組,即模型對(duì)照組,陽(yáng)性對(duì)照組(氟康唑20 mg·kg-1),艾葉發(fā)酵物小、中、大劑量組(艾葉發(fā)酵物100,200,400 mg·kg-1),每組30只,其中10只用于測(cè)定存活率,20只用于測(cè)定其他各指標(biāo)。各組小鼠灌胃給予相應(yīng)藥物0.2 mL·kg-1;模型對(duì)照組灌胃等體積純化水。各組均連續(xù)給藥5 d,bid。于給藥第1天開始觀察,計(jì)算各組小鼠在21 d內(nèi)的存活率,并繪成曲線。

1.7 ELISA法測(cè)定各組小鼠血清IFN-γ與IL-2水平 于給藥第6天將每組存活小鼠取8只,經(jīng)眼球取血,離心得血清。采用酶標(biāo)儀按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定血清IFN-γ、IL-2水平。

1.8 MTT法檢測(cè)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖活性 將小鼠頸椎脫臼處死,無(wú)菌取出小鼠脾臟,加入Hank's液研磨,以200目不銹鋼網(wǎng)濾過(guò),1 500 r·min-1離心(r=15 cm)5 min,棄去上清液,加Hank's液重復(fù)洗滌2次,收集脾細(xì)胞,加入RPMI1640培養(yǎng)液混懸,用血球計(jì)數(shù)板調(diào)細(xì)胞濃度至5×106·mL-1。將脾細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板中,每孔100 μL,同時(shí)每孔加入刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA,終濃度為4 μg·mL-1) 100 μL,并設(shè)不加ConA的孔,均設(shè)3個(gè)復(fù)孔,置37℃、5%CO2中培養(yǎng)72 h,加入2 mg·mL-1MTT50 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,離心棄上清液,每孔加入酸性二甲亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)150 μL。振蕩,于室溫暗處放置15 min,酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)578 nm測(cè)定吸光度(A)值,計(jì)算細(xì)胞增殖活性。增殖活性=加ConAA值/無(wú)ConAA值[4]。

1.9 平板計(jì)數(shù)法測(cè)定各組小鼠肝、腎組織活菌數(shù)目無(wú)菌取出各組小鼠肝臟、腎臟,加入Hank's液研磨,稀釋1 000倍,取1 mL加入沙氏培養(yǎng)液,于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每份臟器設(shè)3塊平板。臟器總活菌數(shù)/mL=同一臟器3個(gè)平板中菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各組樣本均數(shù)組間比較采用單因素方差分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)系統(tǒng)性白念珠菌感染小鼠存活率的影響 見圖1。模型對(duì)照組小鼠于第8天全部死亡。艾葉發(fā)酵物小劑量組于第13天全部死亡,而艾葉發(fā)酵物中、大劑量組第21天存活率仍可達(dá)20%和40%。陽(yáng)性對(duì)照組第21天存活率為30%。

2.2 對(duì)小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖活性的影響 見圖2。與模型對(duì)照組比較,艾葉發(fā)酵物小、中、大劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組T淋巴細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)(P＜0.05,P＜0.01)。

2.3 ELISA法測(cè)定各組小鼠血清中IFN-γ、IL-2水平 見表1。與模型對(duì)照組比較,艾葉發(fā)酵物小劑量組血清IFN-γ水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,IL-2水平顯著升高(P＜0.05);艾葉發(fā)酵物中、大劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組血清IFN-γ、IL-2水平顯著提高(P＜0.01)。

圖1 5組小鼠存活率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Results of survival ratio in five groups of mice

與模型對(duì)照組比較*1P＜0.05,*2P＜0.01圖2 5組小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Compared with the model control group,*1P＜0.01,*2P＜0.05Fig.2 Proliferation activity of splenic T lymphocyte in five groups of mice

2.4 5組小鼠肝腎組織活菌數(shù) 見表2。與模型對(duì)照組比較,艾葉發(fā)酵物小劑量組肝、腎組織活菌數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,艾葉發(fā)酵物中、大劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組肝、腎組織活菌數(shù)量顯著降低(P＜0.01)。

3 討論

中藥發(fā)酵是以中藥為反應(yīng)底物,通過(guò)微生物發(fā)酵過(guò)程對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾、轉(zhuǎn)化從而達(dá)到提高中藥藥效、降低毒性、促進(jìn)吸收、改善口味等目的[5-6]。目前該技術(shù)已成為一種新型的中藥研究技術(shù),并取得了一定的成果。本研究以艾葉為反應(yīng)底物,通過(guò)酵母菌發(fā)酵過(guò)程對(duì)艾葉中成分進(jìn)行修飾,以期得到更有效的抗白念珠菌治療藥物。

表1 5組小鼠血清IFN-γ與IL-2水平測(cè)定結(jié)果Tab.1 Serum levels of IFN-γ and IL-2 in five groups of mice ±s,n=8

表1 5組小鼠血清IFN-γ與IL-2水平測(cè)定結(jié)果Tab.1 Serum levels of IFN-γ and IL-2 in five groups of mice ±s,n=8

與模型對(duì)照組比較,*1P＜0.05,*2P＜0.01;與艾葉發(fā)酵物小劑量組比較,*3P＜0.05Compared with model control group,*1P＜0.05,*2P＜0.01; Compared with Artemisia argyi ferment substance group,*3P＜0.05

組別劑量/ (mg·kg-1) IFN-γ/ (ng·L-1) IL-2/ (μg·L-1)模型對(duì)照組…136.56±26.595.23±0.61艾葉發(fā)酵物組小劑量組100147.28±31.646.12±0.95*1中劑量組200156.25±34.26*211.56±1.59*2*3大劑量組400164.23±32.55*2*315.52±2.65*2*3陽(yáng)性對(duì)照組20149.53±33.11*214.26±2.49*2*3

表2 5組小鼠肝與腎組織活菌數(shù)測(cè)定結(jié)果Tab.2 Viable count of liver and kidney tissues in five groups of mice x±s,n=8

本研究通過(guò)注射環(huán)磷酰胺造成小鼠免疫功能低下,再尾靜脈注射白念珠菌,建立系統(tǒng)性白念珠菌小鼠模型。結(jié)果顯示,模型對(duì)照組小鼠在給藥后第8天已全部死亡,而艾葉發(fā)酵物組中、大劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組可明顯提高模型小鼠生存率。模型對(duì)照組小鼠肝臟、腎臟白念珠菌活菌數(shù)量也明顯高于艾葉發(fā)酵物中、大劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組。提示艾葉發(fā)酵物中、大劑量對(duì)系統(tǒng)性白念珠菌感染具有一定治療作用。

既往研究表明,CD+4亞群(Th細(xì)胞),主要是Th1細(xì)胞在宿主與白念珠菌的相互作用過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用[7],Th1細(xì)胞有利于機(jī)體對(duì)真菌感染的免疫防護(hù)。而Th1細(xì)胞所發(fā)揮的大部分效應(yīng)是通過(guò)其所分泌的細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ等來(lái)實(shí)現(xiàn)的。IL-2和IFN-γ不僅能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的殺菌活性,而且能使靜止的T細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化,活化,介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答[8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與模型對(duì)照組比較,艾葉發(fā)酵物不同劑量組可明顯增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞增殖活性,其血清中IL-2、IFN-γ含量也顯著增高。提示艾葉發(fā)酵物可能通過(guò)提高T淋巴細(xì)胞增殖活性,及增加體內(nèi)IL-2、IFN-γ的含量來(lái)發(fā)揮抗白念珠菌作用。

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DOI 10.3870/yydb.2014.11.010

Therapeutic Effects of Artemisia Argyi Ferment Substance on Systemic Candida Albicans Infection

BAI Jing1,HU Lei1,ZHANG Li2,TIAN Chun-yu1,PANG De-quan1,BO Hai-mei1,HAN Shu-ying1
(1. Department of Pharmacology,School of Basic Medicine,Hebei United University,Tangshan 063000,China;2.Department of Anesthesiology,Tangshan Gongren Hospital,Hebei Province,Tangshan 063000,China)

ObjectiveTo investigate the therapeutic effects and mechanism ofArtemisia argyiferment substance on systemicCandida albicansinfection.MethodsThe model of systemicCandida albicansinfection was established in immunosuppressed mice.The model mice were randomly divided into the model control,Artemisia argyiferment substance(AAFS) at different doses(100,200,and 400 mg·kg-1)and fluconazole group(20 mg·kg-1),30 mice in each.Mice in each treatment group were given therapeutic drugs by gavage for 5 consecutive days,twice daily.The survival of mice was determined 21 days after the model was set up.The serum levels of IFN-γ and IL-2 were determined by ELISA.The proliferation activity of T lymphocyte in the spleen was detected by MTT assay.The number of living fungi in liver and kidney tissues was counted.ResultsCompared with the model control,AAFS at middle and high doses and fluconazole significantly increased the survival rate of mice,the serum levels of IFN-γ and IL-2,and the proliferation activity of T lymphocyte in the spleen,but decreased the number of living fungi in tissues(P＜0.01).Compared with low dose AAFS,middle and high doses of AAFS and fluconazole showed significantly different effect on each index(P＜0.05 orP＜0.01),but there was no difference among these groups(P>0.05).ConclusionAAFS at 200-400 mg·kg-1has inhibitory effects on systemicCandida albicansinfection in mice,the mechanism of which is related to increasing the proliferation of T lymphocyte in spleen and the levels of IFN-γ and IL-2 in serum.

Artemisia argyiferment substance;Infection,candida albicans

R286;R965

A

1004-0781(2014)11-1438-04

2013-11-06

2013-12-11

*唐山市科技計(jì)劃項(xiàng)目(12130208A-2)

白靜(1978-),女,遼寧葫蘆島人,副教授,碩士,主要研究方向:中藥藥理。電話:0315-3725870,E-mail:13513259511@sina.com。

韓淑英(1959-),女,內(nèi)蒙古通遼人,教授,碩士,主要研究方向:中藥藥理。電話:0315-3725870,E-mail:shuyinghan59@163.com。