蔡金艷，朱恩，趙林，張鐵，祝晨蔯

(1．廣東藥學院藥科學院，廣州 510006；2．廣東藥學院生命科學與生物制藥學院，廣州 510006；3．文山學院，文山 663000；4．廣州中醫(yī)藥大學臨床藥理研究所，廣州 510006)

開唇蘭屬3種植物總膏的降血糖活性研究*

蔡金艷1，朱恩1，趙林2，張鐵3，祝晨蔯4

(1．廣東藥學院藥科學院，廣州 510006；2．廣東藥學院生命科學與生物制藥學院，廣州 510006；3．文山學院，文山 663000；4．廣州中醫(yī)藥大學臨床藥理研究所，廣州 510006)

目的研究開唇蘭屬3種藥用植物齒唇蘭、艷麗齒唇蘭和西南齒唇蘭的總膏對高糖高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)誘導的大鼠模型血糖相關指標的影響。方法高血糖實驗組大鼠分別灌胃給予3種總膏,測定給藥后大鼠血糖、胰島素敏感性、抗氧化活性及一氧化氮(NO)水平等相關指標。胰腺切片,進行病理學檢查。結果與模型組比較,西南齒唇蘭總膏組的隨機血糖明顯降低,由給藥前19.3降至8.5 mmol·L-1(P<0.05),而且該組大鼠的體質量明顯高于模型組,同時能提高胰島素敏感性,改善高糖負荷以后的糖耐量。開唇蘭屬3種植物提取物給藥組的超氧化物歧化酶(SOD)活性增加,NO含量均顯著降低。結論西南齒唇蘭總膏具有良好的降血糖作用,其作用機制可能與改善胰島素抵抗、增強機體抗氧化活性和降低血漿NO等機制有關。

齒唇蘭；艷麗齒唇蘭；西南齒唇蘭；降血糖；胰島素敏感指數(shù)

云南省文山州常見5種開唇蘭屬藥用植物:花葉開唇蘭［Anoectochilus roχburghii(Wall.)Lindl］、滇越金線蘭(Anoectochilus chapaensisGagnep.)、齒唇蘭(Anoectochilus lanceolatusLindl.)、艷麗齒唇蘭［Anoectochilus moulmeinensis(Par.et Rchb.f.) Seidenf.］和西南齒唇蘭［Anoectochiluselwesii(Clarke ex Hook.f.)King et Pantl.］。前兩種又叫“金線蓮”,目前野生資源日漸匱乏,價格昂貴,市場混亂,急切需要科學方法對相關品種進行藥用研究［1-4］。齒唇蘭、艷麗齒唇蘭和西南齒唇蘭在民間也常用于治療糖尿病、腎病等。對金線蓮的化學成分和藥理活性有較多研究［5-12］,但是齒唇蘭、艷麗齒唇蘭和西南齒唇蘭的報道僅限于物種鑒定［4］、資源調查［13］、組織培養(yǎng)［14］等方面,筆者未見對其降血糖藥理活性方面的報道。筆者在本研究考察齒唇蘭、艷麗齒唇蘭和西南齒唇蘭3種植物提取物對2型糖尿病動物模型血糖、胰島素敏感性、抗氧化能力和一氧化氮(nitrogen monoxidum,NO)的影響,為民間草藥資源的綜合利用和治療糖尿病的藥物開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼養(yǎng) 健康4～5周SPF級雄性SD大鼠60只,體質量80～110 g,購于廣東省醫(yī)學實驗動物中心,許可證號:SCXK(粵)2008-0002。飼養(yǎng)環(huán)境:室溫18～25℃,相對濕度50%～80%,每籠6只,共分10籠,自由采食、飲水,適應飼養(yǎng)10 d。高糖高脂飼料(配方:蛋黃2.5%、蔗糖20%、豬油10%、基礎飼料67.5%)喂養(yǎng)4周后,腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)35 mg·kg-1造模?；A料的營養(yǎng)成分符合國標《GB1492413-2001·實驗動物·小鼠大鼠配合飼料》的營養(yǎng)標準。

1.2 材料與試劑 西南齒唇蘭25 kg、齒唇蘭19.75 kg、艷麗齒唇蘭全草鮮品12.6 kg,購于云南省文山州。經廣東藥學院中藥學院馬鴻雁老師鑒定分別為蘭科開唇蘭屬西南齒唇蘭(A.elwesii)、齒唇蘭(A. lanceolatus)和艷麗齒唇蘭(A.moulmeinensis),原植物憑證標本分別為No.2010-XN1002、2010-CC1003、2010-YL1004,保存于廣東藥學院藥科學院。將藥材自然晾干,分別得干品2.6,2.25和1.5 kg,經剪碎后用95%乙醇加熱回流提取4次,每次4 h,過濾,回收溶劑,得總膏493.8,622.6和394.5 g。STZ,美國Sigma公司,批號:S0130,臨用前用0.1 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液(pH4.4)配成濃度為1%的溶液(10 mg·mL-1)；總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活力(批號:20110712)、總抗氧化能力測定試劑盒(批號:20110712)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)測定試劑盒(批號:20110712)購于南京建成生物工程研究所。大鼠胰島素測試盒購自上海藍基生物試劑公司。陽性藥鹽酸二甲雙胍緩釋片(購于雙鶴藥業(yè)有限公司),取3 g溶于去離子水100 mL中,配成30 mg·mL-1備用。怡成超越系列JPS-6型手持式全血葡萄糖測定儀(購于北京怡成生物電子技術有限公司)及專用試紙。尿糖試紙購于廣州市花都高爾寶生物技術有限公司。

1.3 高血糖實驗大鼠模型的建立 大鼠高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周,禁食12 h后,將STZ用0.1 mmol·L-1, pH4.2的無菌檸檬酸緩沖液配制成1%STZ溶液,且避光,冰浴,即用。按35 mg·kg-1腹腔注射STZ造模,繼續(xù)高糖高脂飲食,觀察大鼠飲食量、飲水量、尿量、毛色等情況,2周后測隨機血糖,選取血糖>11.1 mmol·L-1者(即成功造模)作為高血糖實驗大鼠。

1.4 大鼠分組與給藥方法 將高血糖模型大鼠隨機分成5組,模型組、陽性藥對照組、齒唇蘭總膏、艷麗齒唇蘭總膏和西南齒唇蘭總膏組,每組8只。所有總膏給藥劑量折算為生藥材均為4 g·kg-1體質量,模型組給予等體積0.9%氯化鈉溶液,陽性對照組每日給予鹽酸二甲雙胍60 mg·kg-1。連續(xù)14 d,每日觀察記錄體質量、飲食、飲水、墊料,隔日檢測尿糖水平,每周檢測血糖值(取尾靜脈血)。

1.5 觀察指標 給藥2周后,所有動物禁食過夜,測定空腹血糖值(fasting blood glucose,FBG)。40%葡萄糖溶液灌胃2.5 g·kg-1,給糖負荷后間隔時間0,30, 60,90,120 min,尾靜脈采血測定血糖值,并計算血糖-時間曲線下面積。將所有SD大鼠禁食過夜,3%戊巴比妥(30 mg·kg-1)麻醉大鼠,將鼠仰臥固定于鼠固定板上,剪去胸腹部位的被毛,用75%乙醇消毒皮膚,剪開腹腔,腹主動脈采血,血樣置入肝素-鋰抗凝真空管中,3 000 r·min-1離心10min(離心機半徑15 cm),分離血漿。分別采用相應試劑盒測定血漿胰島素水平、SOD活力、總抗氧化能力、MDA含量、NO含量。剪開腹腔,位于胃和十二指腸的彎曲處,取胰腺,呈淡紅色,形狀不規(guī)則,似脂肪,用10%甲醛浸泡,固定、染色、鏡檢,蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色觀察病理組織學變化。胰島素水平測定采用雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent serologic assay,ELISA),結合空腹血糖值評價胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index,ISI):ISI＝1/(空腹血糖值×空腹胰島素值)。

2 結果

2.1 血糖相關指標

2.1.1 血糖和體質量 造模前,各實驗組大鼠的血糖值平均為(6.5±3.3)mmol·L-1。造模成功后糖尿病大鼠逐漸出現(xiàn)消瘦、精神萎靡、毛色松散灰暗、動作反應遲鈍、多飲、多食、多尿等癥狀。各給藥組大鼠隨機血糖和體質量的實驗結果見表1。給藥14 d后,與模型組比較,二甲雙胍、西南齒唇蘭總膏和齒唇蘭總膏組大鼠血糖值降低差異有統(tǒng)計學意義,且西南齒唇蘭總膏組大鼠毛色和精神狀態(tài)都有明顯好轉,運動量增加,多飲、多食、多尿癥狀也明顯減輕,后期體質量有明顯回升。但齒唇蘭總膏組體質量明顯減輕。

2.1.2 血漿胰島素敏感指數(shù) 開唇蘭屬3種植物粗提物及二甲雙胍均能使模型大鼠的胰島素敏感指數(shù)顯著升高,對模型大鼠胰島素抵抗的改善效果較好。見表2。

2.1.3 糖耐量試驗(oral glucose tolerance test,OGTT) 糖耐量可由血糖-時間曲線評價,結果見圖1。

表1 5組大鼠血糖和體質量檢測值Tab.1 Determination results of blood glucose and body weight in five groups of rats n＝8,±s

表1 5組大鼠血糖和體質量檢測值Tab.1 Determination results of blood glucose and body weight in five groups of rats n＝8,±s

與模型組比較,*1P<0.05Compared withmodel group,*1P<0.05

組別血糖/(mmol·L-1)給藥前給藥后體質量/g給藥前給藥后模型組22.8±3.2 19.1±1.4 255.3±42.7 224.9±40.5二甲雙胍組18.0±4.5 7.6±1.1*1258.3±35.5 262.5±41.7*1艷麗齒唇蘭總膏組19.9±6.3 17.2±5.9 305.6±21.8 336.0±28.7西南齒唇蘭總膏組19.3±6.0 8.5±1.4*1297.8±18.7 295.1±32.8*1齒唇蘭總膏組22.9±5.4 13.3±6.4*1301.1±17.7 266.9±20.9*1

表2 5組胰島素敏感指數(shù)檢測值Tab.2 Determination results of insulin sensitivity index in five groups of rats n＝8，±s

表2 5組胰島素敏感指數(shù)檢測值Tab.2 Determination results of insulin sensitivity index in five groups of rats n＝8，±s

與模型組比較,*1P<0.05Compared with model group,*1P<0.05

組別禁食血糖/ (mmol·L-1)血漿胰島素/ (ng·mL-1)胰島素敏感指數(shù)模型組8.00±0.67 2.233±0.456 0.052±0.012二甲雙胍組7.40±0.30 1.637±0.737 0.081±0.014*1艷麗齒唇蘭總膏組8.83±1.36 1.487±0.992 0.076±0.034*1西南齒唇蘭總膏組7.40±0.47 1.732±0.447 0.078±0.007*1齒唇蘭總膏組9.37±1.62 1.010±0.251 0.106±0.023*1

圖1 5組大鼠糖耐量試驗的血糖-時間曲線

血糖峰值和達峰時間是其中最直觀的評價指標。與模型組比較,各給藥組對糖耐量均有所改善,其中影響較大的依次是西南齒唇蘭總膏組和艷麗齒唇蘭總膏組。西南齒唇蘭總膏組大鼠在給予糖負荷后血糖約1 h達到峰值,其他組均在0.5 h達到峰值。艷麗齒唇蘭總膏組的血糖在0.5 h達到峰值后以較快的速度降低,至1.5 h就基本恢復到糖負荷前的水平。而模型組在0.5 h達到血糖峰值后,血糖值一直處于較高水平。齒唇蘭總膏組對模型大鼠的糖耐量未見明顯改善。

2.1.4 胰腺組織學檢查 各給藥組大鼠胰腺組織HE染色的切片圖見圖2。模型組胰島細胞團有慢性重度炎癥,β細胞可見廣泛不可逆性核溶解,灶性細胞壞死,及少量淋巴細胞浸潤和廣泛小血管充血。開唇蘭屬3種植物粗提物給藥組的胰腺細胞形態(tài)較模型組有明顯改善。艷麗齒唇蘭總膏組細胞核染色較深,可見少量細胞分裂,細胞界限不清,排列無極性；胰島β細胞有廣泛的空泡變性,輕度血管充血,有少量核固縮,未見核溶解(未出現(xiàn)點狀壞死及灶性壞死),未見胰島纖維化,未見淋巴細胞。西南齒唇蘭和齒唇蘭總膏組胰島形狀飽滿,細胞形態(tài)較好,細胞核染色較好。細胞數(shù)量密集,界限清楚,細胞核較好,核形狀正常,有點狀壞死(核溶解),有少量分裂增殖,輕度血管充血,未見淋巴細胞浸潤。二甲雙胍組胰島細胞團體積明顯較大,細胞數(shù)量較多,細胞形狀不規(guī)則,較少見細胞空泡變性,胰島有輕度血管充血,未見纖維化；胰腺大血管可見有明顯充血。

2.2 血漿SOD活性、總抗氧化能力和MDA含量 開唇蘭屬3種植物提取物給藥組的SOD活性顯著增加,對總抗氧化活性影響不顯著(表3),齒唇蘭總膏組的MDA含量顯著降低。

2.3 血漿NO含量 如圖3所示,開唇蘭屬3種植物總膏組的NO含量與模型組和二甲雙胍組相比均顯著降低。

3 討論

圖2 5組大鼠胰腺組織HE染色的切片圖(×400)A.艷麗齒唇蘭總膏組；B.西南齒唇蘭總膏組；C.齒唇蘭總膏組；D.二甲雙胍組；E.模型組Fig.2 H-E dyeing on pancreas slices of each group of rats(×400)A.total extracts fromA.moulmeinensis；B.total extracts fromA.elwesii；C.total extracts fromA.lanceolatus；D.metformin group；E. model group

表3 5組SOD活性、總抗氧化能力和MDA含量的檢測值Tab.3 Determination results of SOD activity,total antioxidant capacity and MDA content in five groups of rats n＝8,±s

表3 5組SOD活性、總抗氧化能力和MDA含量的檢測值Tab.3 Determination results of SOD activity,total antioxidant capacity and MDA content in five groups of rats n＝8,±s

與模型組比較,*1P<0.05Compared withmodel group,*1P<0.05

組別SOD 活性總抗氧化能力(U·mL-1) MDA含量/ (nmol·mL-1)模型組453.35±22.00 16.77±9.23 5.00±0.51二甲雙胍組463.63±17.21 27.38±2.25*14.84±1.21艷麗齒唇蘭總膏組581.43±49.98*118.47±6.37 4.53±0.54西南齒唇蘭總膏組535.24±30.15*117.17±6.11 5.90±1.37齒唇蘭總膏組629.13±35.47*18.45±0.94 2.73±0.58*1

圖3 開唇蘭屬3種植物總膏對血漿NO含量的影響(n= 8,±s)A.艷麗齒唇蘭總膏組;B.西南齒唇蘭總膏組;C.齒唇蘭總膏組;D.二甲雙胍組;E.模型組Fig.3 Effect of three different extracts fromAnoectiochilus on p lasma NO content(n=8,±s)A.total extracts fromA.moulmeinensis;B.total extracts fromA.elwesii;C.total extracts fromA.lanceolatus;D.metformin group; E.model group

本研究采用高糖高脂飲食聯(lián)合STZ誘導的糖尿病大鼠模型對開唇蘭屬3種植物總膏進行活性篩選,發(fā)現(xiàn)西南齒唇蘭總膏顯著降低模型大鼠血糖,提高胰島素敏感性,改善糖耐量,其次是齒唇蘭和艷麗齒唇蘭總膏。西南齒唇蘭中可能含有一些具有良好的降血糖作用的化學成分,有必要對其進行降血糖活性物質基礎的進一步研究。從胰島素敏感性考察結果來看,預示該降血糖作用的發(fā)揮可能與改善胰島素抵抗密切相關。

開唇蘭屬3種植物提取物給藥組的SOD活性顯著增加,提示該植物含有增強體內抗氧化活力的成分,而抗氧化作用與高血糖模型的發(fā)生和發(fā)展有一定的相關性。

HE染色技術檢查胰腺組織病理切片鏡檢實驗結果表明,開唇蘭屬3種植物粗提物給藥組的胰腺細胞形態(tài)較模型組均有明顯改善。造模試劑STZ含有亞硝基,能通過釋放NO和增加自由基損傷胰島β細胞或誘導β細胞凋亡?；钚砸蜃覰O的測試結果顯示給藥組對高血糖的改善作用可能與NO含量減少,減輕β細胞損傷有著密切關系,各給藥組均能降低模型大鼠血漿NO含量,保護β細胞免受損傷。因此,各給藥組NO含量降低有非常重要的生物學意義。關于NO指標的評價與探索藥物降血糖的活性機制值得進一步深入研究。NO在脊椎動物中有信號分子的作用,是疏水性較強的胞外小信號分子,很容易通過擴散越過靶細胞質膜,一旦進入胞內就直接調節(jié)細胞質中特異蛋白質的活性。有實驗證實,小鼠血管平滑肌細胞中的NO可增加蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)的活性［15］。NO可通過PTP1B對胰島素信號傳導下調機制減弱胰島素刺激細胞的能動性,因此降低NO有助于改善胰島素抵抗。

［1］中國科學院昆明植物研究所.云南植物志(第十四卷)[M].北京:科學出版社,2003:204.

［2］中國科學院中國植物志編委.中國植物志(第十七卷)[M].北京:科學出版社,2000:220.

［3］張鐵,李洪超,劉偉.文山野生金線蓮的RAPD鑒別[J].中藥材,2009,32(3):347-348.

［4］福建中醫(yī)藥研究所.福建藥物志(第二卷)[M].福州:福建科學技術出版社,1982:215.

［5］DU X,SUN N,TAMURA T,et al.Higher yielding isolation of kinsenoside inAnoectochilusand its antihyperliposis effect［J］.Biol PharmBull,2001,24(1):65-69.

［6］何春年,王春蘭,郭順星,等.福建金線蓮的化學成分研究[J].中國藥學雜志,2005,40(8):581-583.

［7］關憬,王春蘭,郭順星,等.高效液相色譜法測定金線蓮中黃酮含量[J].藥物分析雜志,2008,28(1):9-11.

［8］何春年,王春蘭,郭順星,等.福建金線蓮的化學成分研究I[J].中國中藥雜志,2005,30(10):761-763.

［9］關璟,王春蘭,郭順星.福建產金線蓮中黃酮苷成分的研究[J].中草藥,2005,36(10):1450-1453.

［10］WANG X X,HE JM,WANG C L,et al.Simultaneous structural identification of natural products in fractions of crude extract of the rare endangered plant Anoectochilus roxburghii using H NMR/RRLC-MS[J].Int J Mol Sci, 2011,12(4):2556-2571.

［11］關璟,王春蘭,郭順星,等.福建金線蓮總黃酮提取工藝的研究[J].中國藥學雜志,2008,43(21):1615-1617.

［12］唐菲,張小瓊,徐江濤,等.金線蓮降血糖活性部位的篩選[J].中草藥,2011,42(2):340-342.

［13］張鐵,萬京,沐建華.文山地區(qū)金線蓮種質資源初步調查[J].文山師范高等?？茖W校學報,2005,18(1):26-28.

［14］張鐵,李洪超.西南齒唇蘭的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].文山學院學報,2010,23(1):143-144.

［15］SREEIAYAN N,LIN Y,HASSID A.NO attenuate insulin signaling and motility in aortic smooth muscle cells via tyrosine phosphatase1B-mediated mechanism[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2002,22(7):1086-1092.

DOI 10.3870/yydb.2014.02.002

Hypoglycemic Effect of Three Different Extracts fromAnoectochilus Genus

CAI Jin-yan1,ZHU En1,ZHAO lin2,ZHANG Tie3,ZHU Chen-chen4
(1.School of Pharmacy,Guangdong Pharmaceutical College,Guangzhou 510006,China;2.School of Life Science and Bio-Pharmaceutical, Guangdong Pharmaceutical College,Guangzhou 510006,China;3.Wenshan University,Wenshan 663000, China;4.Institute of Clinical Pharmacology,Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510006, China)

Objective To investigate the hypoglycemic effect of 3 different extracts fromAnoectiochilusin diabetic rats induced by high lipid diet plus streptozotocin(STZ).MethodsThe total EtOH extracts were prepared fromA.lanceolatus,A.moulmeinensisandA.elwesii,yielding 3 extracts.Blood glucose(BG),insulin sensitivity index(ISI)and antioxidant activity was assayed.Morphological examination of the pancreas was performed.ResultsThe total extract fromA.elwesiishowed the best profile in hypoglycemic effect and improving insulin sensitivity with a fall of BG from19.3 to 8.5 mmol·L-1(P<0.05).A significant raise in SOD activity and a reduction in plasma NO were observed after the treatment of 3 extracts fromAnoectochilus.ConclusionThe total extract fromA.elwesii shows a good activity in improving glucosemetabolism,whichmay be attributed to increased insulin sensitivity and SOD activity and reduced plasma NO level.

A.lanceolatus;A.moulmeinensis;A.elwesii;Hypoglycemic;Insulin sensitivity index

R282.71;R285.5

A

1004-0781(2014)02-0140-05

2013-07-10

2013-09-10

*廣東省醫(yī)學科研基金項目(B2011150)；國家自然科學基金資助項目(81001628)；廣東省自然科學基金資助項目(S2013010014771)

蔡金艷(1981-),女,湖北枝江人,副教授,博士,主要從事天然藥物活性成分和創(chuàng)新藥物研究。電話:(0) 15920107845,E-mail：caijy928@163.com。

趙林(1979-),男,湖北十堰人,講師,博士,研究方向:生物制藥學。電話:020-39352151,E-mail：biozhl@126.com。