劉 慧，劉貫山，劉 峰，龔達(dá)平，張雪峰，崔萌萌，路鐵剛，王元英

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煙草T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列擴(kuò)增方法的篩選與優(yōu)化

劉 慧1,3，劉貫山1，劉 峰2,3，龔達(dá)平1，張雪峰1,3，崔萌萌1，路鐵剛2，王元英1*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草遺傳改良與生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，青島 266101；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081；3中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081）

煙草T-DNA激活標(biāo)簽插入突變體庫的創(chuàng)制過程中，需要進(jìn)行大量的T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列擴(kuò)增，因此選擇一種適用于煙草T-DNA側(cè)翼序列擴(kuò)增的高效方法尤為必要。本研究比較了TAIL-PCR、PCR-walking、FPNI-PCR三種方法對T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的擴(kuò)增效率、插入位點(diǎn)確定的比例和同源蛋白比對結(jié)果，并對3種方法的PCR程序、體系和引物設(shè)計(jì)等方面進(jìn)行了優(yōu)化，確定TAIL-PCR更適合煙草的側(cè)翼序列擴(kuò)增，通過產(chǎn)率、條帶長度、插入位點(diǎn)和同源蛋白比對結(jié)果的比較，得出TAIL-PCR更適合煙草的側(cè)翼序列擴(kuò)增。這一結(jié)果為應(yīng)用煙草突變體開展煙草基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

煙草；T-DNA；插入位點(diǎn)；側(cè)翼序列；篩選

目前，基因功能的研究已經(jīng)成為分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的重要課題。大規(guī)模突變體庫的建立是基因功能研究直接且行之有效的方法，目前水稻和擬南芥等重要模式植物已經(jīng)成功建立了T-DNA插入突變體庫[1]。煙草作為重要模式植物之一，其基因結(jié)構(gòu)和功能的研究對農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)和分子生物學(xué)研究都具有重要意義。建立煙草突變體庫是克隆和分析煙草重要功能基因的基礎(chǔ)和前提。

T-DNA激活標(biāo)簽插入法是建立突變體庫的重要方法之一[2]，在煙草T-DNA激活標(biāo)簽插入突變體創(chuàng)制過程中，對其側(cè)翼序列的擴(kuò)增與分析就成為非常重要的研究內(nèi)容。由于煙草T-DNA激活標(biāo)簽插入突變體數(shù)量龐大，側(cè)翼序列的分離工作就比較耗時(shí)耗力，因此選擇一種高效的適用于分離煙草T-DNA激活標(biāo)簽插入突變體側(cè)翼序列的方法，就為后面的工作提供了便利的條件。

TAIL-PCR（thermal asymmetric interlaced PCR）、PCR walking和FPNI-PCR（fusion primer and nested integrated PCR）都已經(jīng)在水稻與園藝植物等其他植物中廣泛用于側(cè)翼序列的分離，本研究在比較這3種方法在煙草側(cè)翼序列擴(kuò)增效率、插入位點(diǎn)確定的比例和同源蛋白比對結(jié)果的基礎(chǔ)上，分別對3種方法的程序、體系、引物設(shè)計(jì)進(jìn)行了改進(jìn)，以期獲得更高效的適用于煙草的側(cè)翼序列分離方法。

1 材料與方法

1.1 材料

2012年3月采集煙草T-DNA激活標(biāo)簽插入突變體葉片，提取DNA，對樣品進(jìn)行陽性轉(zhuǎn)化檢測，共得到T0代陽性轉(zhuǎn)化植株葉片DNA180份。

植物基因組提取試劑盒、TAKARA公司rTaq、ExTaq聚合酶、dNTPs、Transgene公司無菌水、DMSO、用于實(shí)驗(yàn)的均為PAGE級合成引物、T4 Ligase、SspI內(nèi)切酶、TBE 緩沖液、 EtBr和瓊脂糖。

1.2 方法

1.2.1 TAIL-PCR 根據(jù)載體pSKI015[3]的LB（left border）設(shè)計(jì)嵌套特異引物序列SP1、SP2、SP3（表1），使用LAD1、LAD3和AC1隨機(jī)簡并引物和載體特異引物SP1、SP2、SP3（表1）[4-5]，按照TAIL-PCR反應(yīng)條件（表2）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.2 PCR–walking 根據(jù)接頭序列設(shè)計(jì)引物AP1，根據(jù)pSKI015載體LB設(shè)計(jì)PCR walking引物WP1，設(shè)計(jì)嵌套引物AP2，WP2（表3），進(jìn)行嵌套PCR反應(yīng)。

使用PCR walking接頭和載體序列特異引物進(jìn)行反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，34個(gè)循環(huán)；67 ℃退火30 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min，34個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。第2輪PCR 反應(yīng)條件同第1輪。

1.2.3 FPNI-PCR 使用簡并引物FP1-9和隨機(jī)引物FSP1與FSP2（表4）以及載體特異性引物（表1），在表5所列的反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。并篩選擴(kuò)增效率最高的FP（fusion primer）引物。第一輪PCR循環(huán)中，高嚴(yán)謹(jǐn)和低嚴(yán)謹(jǐn)性循環(huán)分別重復(fù)6次（經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在第一輪PCR中，在將循環(huán)數(shù)分別設(shè)置為4、5、6、7時(shí)，進(jìn)行6個(gè)重復(fù)的高嚴(yán)謹(jǐn)性和低嚴(yán)謹(jǐn)性反應(yīng)，擴(kuò)增結(jié)果最好）。

表1 根據(jù)載體pSKI015設(shè)計(jì)的特異引物

表2 TAIL-PCR反應(yīng)條件

表3 PCR walking 所用引物

表4 FPNI-PCR反應(yīng)所用引物

注：N代表A/T/G/C；S代表C/G；W代表A/T。

表5 FPNI-PCR反應(yīng)條件

2 結(jié) 果

2.1 優(yōu)化前TAIL-PCR、PCR walking與FPNI-PCR擴(kuò)增方法的比較

2.1.1 TAIL-PCR擴(kuò)增結(jié)果 在本次T0代材料擴(kuò)增中，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖1，擴(kuò)增條帶很少且不清晰，不能進(jìn)行成功測序。

2.1.2 PCR-walking擴(kuò)增結(jié)果 使用PCR walking擴(kuò)增方法和接頭特異引物擴(kuò)增結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳如圖2。擴(kuò)增條帶比較清晰，測序結(jié)果好，擴(kuò)增效率較高，但是條帶較小，很難在煙草基因組數(shù)據(jù)庫中確定插入位點(diǎn)。

圖1 優(yōu)化前的TAIL-PCR擴(kuò)增

注：M為DNA長度Marker；泳道1～16為不同T0側(cè)翼序列擴(kuò)增。圖2、4、5、7同。

圖2 PCR walking結(jié)果

2.1.3 FPNI-PCR擴(kuò)增結(jié)果 挑選4個(gè)DNA樣品（編號306、312、316、318），分別采用不同的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果見圖3。由于引物FP1、FP2、FP7與FP8擴(kuò)增條帶數(shù)量多于其他引物，所以選擇FP7引物對180份煙草突變體材料進(jìn)行FPNI-PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果見圖4。

2.1.4 3種擴(kuò)增方法的比較 將3種PCR方法獲得的陽性擴(kuò)增條帶進(jìn)行擴(kuò)增比例、條帶長度和NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫中比對結(jié)果的比較（表6）。

3種方法的側(cè)翼序列擴(kuò)增比例在35%左右，但是PCR walking擴(kuò)增得到的側(cè)翼序列較短，除去200 bp載體序列，在煙草數(shù)據(jù)庫中比對時(shí)搜索到的大多都是重復(fù)序列區(qū)，而無法準(zhǔn)確判斷T-DNA的插入位點(diǎn)，而且PCR walking操作中的接頭連接與退火是反應(yīng)成功的關(guān)鍵因素，如果接頭處理不好，很容易導(dǎo)致后續(xù)實(shí)驗(yàn)完全失敗。FPNI-PCR擴(kuò)增效率和數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果和TAIL-PCR相似，條帶小于TAIL-PCR的，但是其整個(gè)反應(yīng)過程需要時(shí)間為5~6 h，縮短了反應(yīng)時(shí)間，且第一輪和第二輪之間不需要稀釋產(chǎn)物，大量減少了工作量，因此，在接下來的試驗(yàn)中，需要對FPNI-PCR進(jìn)行引物和反應(yīng)條件的優(yōu)化，以獲得更長的條帶。TAIL-PCR擴(kuò)增條帶長，在煙草數(shù)據(jù)庫中比對后，容易區(qū)分是否插入到非重復(fù)序列區(qū)，因此對TAIL-PCR需要進(jìn)行優(yōu)化的是，要達(dá)到更高的擴(kuò)增效率。

圖3 篩選FP1-FP9引物電泳結(jié)果

注：M為DNA長度Marker；泳道1~4、5~8、9~12、13~16、17~20、21~24、25~28、29~32與33~36分別是由引物FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8與FP9擴(kuò)增的。

圖4 應(yīng)用FP7引物進(jìn)行的FPNI-PCR擴(kuò)增

表6 3種方法的PCR結(jié)果的綜合比較

2.2 對TAIL-PCR和FPNI-PCR的優(yōu)化

2.2.1 TAIL-PCR引物和反應(yīng)條件的優(yōu)化 重新根據(jù)載體pSKI015 LB，設(shè)計(jì)特異引物SP(1)、SP(2)與SP(3)（表1），沿LB向5’端移動150 bp設(shè)計(jì)引物，防止載體在遺傳重組過程中發(fā)生LB丟失，而影響側(cè)翼序列的擴(kuò)增效率。重新選擇AD引物[5-6]，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，二、三輪反應(yīng)中的退火溫度在65 ℃時(shí)擴(kuò)增比例最高，使用上述引物和反應(yīng)條件對煙草突變材料T0進(jìn)行側(cè)翼序列擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果見圖5。TAIL-PCR引物和反應(yīng)條件優(yōu)化后與優(yōu)化前相比，擴(kuò)增條帶數(shù)量更多，測序不易出現(xiàn)雜合等現(xiàn)象，測序結(jié)果更加準(zhǔn)確（見圖1、圖5）。

圖5 優(yōu)化后的TAIL-PCR擴(kuò)增

2.2.2 FPNI-PCR引物的優(yōu)化 重新選擇簡并引物Fad1-7、Fad2-1、Fad2-7、Fad3-1與Fad3-7，使用特異引物SP(1)、SP(2)、SP(3)（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。同樣選用編號306、312、316、318 四個(gè)樣品分別采用不同引物進(jìn)行擴(kuò)增，表2中第三輪第二步循環(huán)數(shù)12設(shè)置為18（實(shí)驗(yàn)證明，循環(huán)數(shù)設(shè)置為12、16、18、20時(shí)，18和20個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增效果相當(dāng)，且高于12和16個(gè)循環(huán)），瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果見圖6。由圖6可見，F(xiàn)ad3-7引物擴(kuò)增效果最好，所以選擇Fad3-7引物對180份T0代煙草突變體材料進(jìn)行FPNI-PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結(jié)果見圖7，優(yōu)化后的條帶長度更大，數(shù)目更多（見圖4、圖7）。

圖6 不同F(xiàn)ad引物擴(kuò)增結(jié)果

注：M為DNA分子量Marker；泳道1~4、5~8、9~12、13~16與17~20分別是由引物Fad1-7、Fad2-1、Fad2-7、Fad3-1與Fad3-7擴(kuò)增的。

圖7 使用 Fad3~7進(jìn)行的FPNI-PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2.3 優(yōu)化后擴(kuò)增方法的比較 對優(yōu)化后的TAIL-PCR和FPNI-PCR擴(kuò)增得到的側(cè)翼序列進(jìn)行擴(kuò)增比例、條帶長度和NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果的比較（表7）。

改進(jìn)后的兩種PCR方法在擴(kuò)增比例上都有了提高，但是FPNI-PCR擴(kuò)增的條帶長度較TAIL-PCR仍然較短。TAIL-PCR擴(kuò)增得到的側(cè)翼序列有90.2%在煙草二倍體數(shù)據(jù)中確定了插入位點(diǎn)，79.7%在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫搜索到同源蛋白序列。優(yōu)化后的TAIL-PCR擴(kuò)增得到的側(cè)翼序列在確定插入位點(diǎn)和比對同源蛋白序列方面都較FPNI-PCR取得更好的結(jié)果。

表7 優(yōu)化后TAIL-PCR和FPNI-PCR結(jié)果比較

3 討 論

TAIL-PCR 解鏈溫度大于65 ℃，任意簡并引物AD（arbitrary degenerate）解鏈溫度45 ℃，這樣可以通過熱不對稱的方法提高目標(biāo)序列和抑制非目標(biāo)序列的產(chǎn)生。TAIL-PCR包括三輪PCR反應(yīng)，第一輪反應(yīng)中，通過SP1對目標(biāo)序列的10個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增后，提高目標(biāo)分子的拷貝數(shù)，再進(jìn)行一個(gè)低退火溫度的單循環(huán)（退火溫度為25 ℃），引物的高度簡并性和低退火溫度讓AD引物和目標(biāo)序列以更高的概率結(jié)合，因此有效地為第二、三輪反應(yīng)產(chǎn)生目標(biāo)序列創(chuàng)造了一個(gè)或更多個(gè)退火位點(diǎn)。然后用嵌套特異引物L(fēng)B2、LB3與AD引物進(jìn)行二、三輪PCR反應(yīng)，高效地產(chǎn)生靶序列[6-7]。而且上一輪PCR產(chǎn)物的稀釋，使得非目標(biāo)序列的產(chǎn)量更低。

PCR-walking是通過已知T-DNA序列探知未知序列的方法，通過平末端限制性內(nèi)切酶在T-DNA插入基因組附近產(chǎn)生平末端，將預(yù)先設(shè)計(jì)好的接頭引物（AP）與其連接，根據(jù)載體序列設(shè)計(jì)嵌套特異引物（WP）進(jìn)行PCR步移，獲得T-DNA插入的側(cè)翼序列。由于接頭序列的應(yīng)用，3’端的氨基封閉抑制非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均在接頭和T-DNA區(qū)域之間[8-10]。

FPNI-PCR需要三輪PCR反應(yīng)，原理與TAIL-PCR相同，根據(jù)載體序列設(shè)計(jì)三個(gè)特異引物，在第一輪中，同樣運(yùn)用熱不對稱原理。包括兩個(gè)高嚴(yán)謹(jǐn)性循環(huán)和一個(gè)低嚴(yán)謹(jǐn)性循環(huán)，高嚴(yán)謹(jǐn)性循環(huán)中產(chǎn)生目標(biāo)序列單鏈DNA，在后面的低嚴(yán)謹(jǐn)性循環(huán)中應(yīng)用FP（fusion primer）引物產(chǎn)生雙鏈DNA。3~6個(gè)上述循環(huán)后，形成部分目標(biāo)序列，同時(shí)伴隨著非目標(biāo)序列的產(chǎn)生，在第二、三輪PCR循環(huán)中，應(yīng)用高嚴(yán)謹(jǐn)性循環(huán)，因此，目標(biāo)特異序列得到選擇性擴(kuò)增。由于特異嵌套引物，非目標(biāo)序列得不到大量擴(kuò)增，而且，非目標(biāo)序列中的發(fā)卡結(jié)構(gòu)抑制其擴(kuò)增。FPNI-PCR中通用引物是在一段15~16個(gè)堿基的簡并序列的5’端連接有一段具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的核苷酸序列，形成融合引物，應(yīng)用于第一輪PCR反應(yīng)中，最大的特點(diǎn)是簡并序列和發(fā)卡結(jié)構(gòu)序列融合在一起，因此，可以抑制在反應(yīng)中產(chǎn)生的非目標(biāo)序列，由于其發(fā)卡結(jié)構(gòu)存在而不能繼續(xù)合成雙鏈DNA[11-12]。FPNI-PCR中區(qū)別于TAIL-PCR的最大特點(diǎn)是融合引物（表3）。

4 結(jié) 論

TAIL-PCR是在1995年發(fā)表的用于擴(kuò)增側(cè)翼序列的有效方法[7]，并在2007年進(jìn)行了PCR溫度條件、通用引物設(shè)計(jì)與應(yīng)用AD引物池等方面的改進(jìn)，使得擴(kuò)增條帶長度和產(chǎn)率有了大幅提高[4]。本實(shí)驗(yàn)在應(yīng)用TAIL-PCR擴(kuò)增側(cè)翼序列時(shí)，得到的片段都在1~3 kb，在煙草基因組數(shù)據(jù)庫中比對時(shí)，由于其條帶長度較大，可以區(qū)別是否插入到重復(fù)序列區(qū)，在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對得到了較多的同源蛋白序列，是比較適合煙草的側(cè)翼序列的擴(kuò)增方法。相比較而言，PCR-walking獲得的條帶在400 bp左右，其中200~300 bp為載體序列，在煙草數(shù)據(jù)庫中比對時(shí)容易搜索到重復(fù)序列區(qū)。FPNI-PCR由于其原理與TAIL-PCR方法相同，雖然擴(kuò)增比例較高，但是條帶長度不大，情況和PCR walking相似，很難在煙草基因組數(shù)據(jù)庫中確定T-DNA的插入位點(diǎn)。

因此，在T-DNA插入煙草突變體側(cè)翼序列擴(kuò)增中，使用TAIL-PCR能產(chǎn)生較高的側(cè)翼序列產(chǎn)率，插入位點(diǎn)確定比例更高，并且側(cè)翼序列能在NCBI nr數(shù)據(jù)庫中比對到更多的同源蛋白序列。TAIL-PCR在T-DNA側(cè)翼序列擴(kuò)增效率和蛋白數(shù)據(jù)庫中比對同源蛋白序列的結(jié)果，相對與其他兩種方法都更適合煙草的T-DNA側(cè)翼序列擴(kuò)增。

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The Screening and Optimization of Three Methods to Clone the Flanking Sequences of Transgenic Tobacco

LIU Hui1,3, LIU Guanshan1, LIU Feng2,3, GONG Daping1, ZHANG Xuefeng1,3, CUI Mengmeng1, LU Tiegang2, WANG Yuanying1*

(1. Tobacco Research Institute of CAAS, Key Laboratory of Tobacco Genetic Improvement and Biotechnology, CAAS, Qingdao 266101, China; 2. Biotechnology Research Institute of CAAS, Beijing 100081, China; 3. Graduate School of CAAS, Beijing 100081, China)

As the mutant pool of T-DNA insertion has been constructed, a quantity of T-DNA flanking sequences are in great need to be cloned. TAIL-PCR, PCR-walking and FPNI-PCR have been used to clone the sequences flanked by known sequences. For this reason, it will be great help to choose an efficient method applied to the analysis of the tobacco T-DNA insertion flanking sequences. This study focus on the comparison among the efficiency, T-DNA insertion localization and the researched homologous protein of the three methods, also we optimized the PCR procedures and primers to select an effective method which is suitable for cloning of tobacco T-DNA flanking sequences. By comparing the efficiency, T-DNA insertion localization and the researched homologous protein, the result of TAIL-PCR was the best. This result lays a foundation for the study on tobacco gene function by using mutant.

tobacco; T-DNA; insertion site; flanking sequence; screen

TS413

1007-5119（2014）01-0096-07

10.13496/j.issn.1007-5119.2014.01.018

中國煙草總公司煙草基因組計(jì)劃重大專項(xiàng)項(xiàng)目“煙草突變體庫創(chuàng)制、篩選與分析”[110201101009（JY-03）]；“煙草突變體篩選與鑒定” [110201201004（JY-04）]；“煙草全基因組過表達(dá)和RNA干涉體系構(gòu)建”（110200902036）

劉 慧，女，在讀碩士，研究方向?yàn)闊煵莘肿佑N。E-mail：liuhui20062988@126.com。

通信作者，E-mail：wyytob@126.com

2013-01-08

2013-06-19