尤垂淮，陳冬梅，黃錦文，唐莉娜，徐志兵，張重義，林文雄*

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不同種植方式下烤煙根系差異表達(dá)蛋白質(zhì)分析

尤垂淮1,2，陳冬梅1,2，黃錦文1，唐莉娜3，徐志兵1,2，張重義1,2，林文雄1,2*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)煙草研究所，福州 350002；3.福建省煙草專賣局煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福州 350003）

通過根系差異蛋白質(zhì)組學(xué)探討了種植方式（復(fù)種連作、復(fù)種輪作）對(duì)烤煙生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，共有15個(gè)蛋白質(zhì)表達(dá)豐度發(fā)生變化，用LC-MS/MS鑒定了14個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，經(jīng)生物信息學(xué)分析，11個(gè)蛋白質(zhì)的功能有注釋，其中3個(gè)屬于與香氣形成有關(guān)的蛋白質(zhì)，包括轉(zhuǎn)酮醇酶、單脫氫抗壞血還原酶和O-甲基轉(zhuǎn)移酶，它們?cè)趶?fù)種輪作條件下均上調(diào)表達(dá)，此可能有助于煙葉品質(zhì)提高，而復(fù)種連作處理下調(diào)表達(dá)，可能不利于品質(zhì)提高。還鑒定到涉及能量、抗性、物質(zhì)運(yùn)輸、核酸等功能的蛋白：磷酸甘油酸酯激酶、線粒體內(nèi)膜移位酶亞基Tim13、NBS-LRR、DnaJ、細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸?shù)鞍譙ly1、核糖體蛋白質(zhì)，在復(fù)種輪作下也上調(diào)表達(dá)，此可能促進(jìn)烤煙的生長(zhǎng)，有利于提高煙草產(chǎn)量和品質(zhì)且經(jīng)濟(jì)效益較好。而在復(fù)種連作處理下調(diào)表達(dá)，進(jìn)而可能使得煙草生長(zhǎng)變?nèi)酢a(chǎn)量降低、品質(zhì)變差。

烤煙；雙向電泳；蛋白質(zhì)組學(xué)

煙草屬忌連作作物，生產(chǎn)上因單種連作或復(fù)種連作都存在連作障礙。李天福等[1]研究表明，種植煙草的間隔時(shí)間越短，發(fā)病率越高，而且煙草花葉病、煙草黑脛病、根黑腐病、根結(jié)線蟲病、青枯病、赤星病、炭疽病、角斑病和低頭黑等的發(fā)病率都與連作年限呈不同程度的正相關(guān)。由于煙草各種病害發(fā)生，造成產(chǎn)量和品質(zhì)明顯下降[2]，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)初步估計(jì)，每年全國(guó)煙葉10%~15%的損失由各種病害造成的，嚴(yán)重時(shí)高達(dá)70%~90%，甚至絕收[3]。當(dāng)前，我國(guó)因煙草連作，每年直接及間接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)40億元[4]，煙草可持續(xù)發(fā)展已經(jīng)受到嚴(yán)重威脅，嚴(yán)重影響煙草的生產(chǎn)和區(qū)域經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。有關(guān)煙草連作障礙的研究還處于初步階段，分子機(jī)理方面尚未報(bào)道，需深入研究。

隨著擬南芥（）、水稻（）和楊樹（）等植物全基因組序列測(cè)定的完成和基因組學(xué)研究的深入，植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)成為后基因組時(shí)代的熱點(diǎn)之一[5]。近年來，差異蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用于植物或作物科學(xué)相關(guān)的分子機(jī)制研究日益增多，從分子水平較好地解釋了植物/作物自身遺傳表達(dá)或?qū)Νh(huán)境響應(yīng)的分子機(jī)理。如在植物生理蛋白質(zhì)組學(xué)、植物突變體蛋白質(zhì)組學(xué)、植物遺傳多樣性蛋白質(zhì)組學(xué)和植物發(fā)育蛋白質(zhì)組學(xué)等方面的研究[6-8]。

運(yùn)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來研究烤煙根系蛋白質(zhì)，在國(guó)內(nèi)外還很少報(bào)道。根系作為連接煙草地上部和土壤的“中間橋梁”，同時(shí)分泌各種次生代謝物，在煙草品質(zhì)的形成扮演著非常重要的角色。本研究對(duì)復(fù)種連作和復(fù)種輪作下烤煙根系蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析，旨在分子水平上研究烤煙連作障礙的機(jī)理，為減輕甚至解決烤煙連作障礙提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2007—2010年在南平浦城縣仙陽烤煙試驗(yàn)站基地進(jìn)行，試驗(yàn)田地勢(shì)平坦，土壤質(zhì)地為砂壤，土壤pH 5.0，有機(jī)質(zhì)34.8 g/kg，速效氮180.0 mg/kg，速效磷21.6 mg/kg，速效鉀103.0 mg/kg，全氮2.38 g/kg，全磷0.73 g/kg，全鉀34.5 g/kg，陽離子交換量7.8 cmol/kg。試驗(yàn)采取2種種植方式（表1），即（1）復(fù)種連作模式：早季種煙，煙收獲后種水稻（烤煙-水稻→烤煙-水稻→烤煙）；（2）復(fù)種輪作模式：第1年，早季種煙，煙收獲后種水稻，第2年，早季種水稻，晚季也種水稻（烤煙-水稻→水稻-水稻→烤煙）。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，共6個(gè)小區(qū)。每個(gè)小區(qū)種5畦，每畦植煙44株，共220株，行株距1.2 m×0.5 m。田間管理都按規(guī)范化栽培措施進(jìn)行，從2008年開始實(shí)行田間定位試驗(yàn)，在田間定位第3年即2010年，取樣進(jìn)行相應(yīng)實(shí)驗(yàn)。供試烤煙品種為K326。

表1 種植方式

1.2 取樣

2010年烤煙旺長(zhǎng)后期時(shí)取根系，用水洗凈后甩干，用剪刀剪相同部位根系，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，有代表性9株煙，每3株根系混勻，作為1個(gè)重復(fù)，用錫箔紙包住，迅速置于液氮中，之后一并保存到-80 ℃冰箱備用。

1.3 試劑與儀器

丙烯酰胺、N，N-甲叉丙烯酰胺、載體兩性電解質(zhì)Ampholine（pH 3-10, pH 5-8）、3-[（3-膽酰胺丙基）-二乙胺]-丙磺酸（CHAPS）等產(chǎn)品購(gòu)自國(guó)外；聚乙烯吡咯烷酮、三氯乙酸、甘油、磷酸、甲醛等試劑為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司產(chǎn)品，均為分析純。所有溶液均用Milli-Q超純水配制。

高速冷凍離心機(jī)為德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；真空干燥機(jī)出自上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；Protean IEF等電聚焦系統(tǒng)、SDS-PAGE垂直電泳均產(chǎn)自美國(guó)Bio-Rad公司；凝膠成像系統(tǒng)imagescan為瑞典GE Healthcare公司產(chǎn)品；紫外-可見分光光度計(jì)為美國(guó)VARIAN公司產(chǎn)品；LC-MS/MS液相質(zhì)譜為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品。

1.4 根系蛋白質(zhì)樣品的制備

稱取5 g根系，加入少許聚乙烯吡咯烷酮，在液氮冷凍條件下研磨至粉末，采用Mg-NP40法：參照Lee等[9]的方法并有所改進(jìn)，加入10 mL提取緩沖液（0.5 mol/LTris緩沖液pH 8.3, 2%V/V NP-40，20 mmol/L MgCl2，2%V/V B-巰基乙醇，1 mmol/L苯甲基磺酰氟），置冰上搖床振蕩5~10 min，置冰上超聲30 min。4 ℃，10000 rpm，離心30 min，取上清。加入3倍體積10%三氯乙酸（10%三氯乙酸，0.07%B-巰基乙醇，丙酮），置于-20 ℃冰箱過夜。多洗幾次，期間用80%丙酮（含0.07% B-巰基乙醇）洗1次，直至上清液澄清。最后4 ℃，11 000 rpm，離心25 min，棄上清，低溫真空干燥，制成蛋白質(zhì)干粉，置于-80 ℃冰箱備用。

1.5 蛋白質(zhì)的裂解與濃度測(cè)定

1.5.1 蛋白質(zhì)的裂解 Mg-NP40法提取的根系蛋白質(zhì)干粉與裂解液的比例為1 mg :10 μL。裂解液的配方為：42%尿素 2M Thiourea，65mM DTT，4% CHAPS，0.2%兩性電解質(zhì)（pH 3.5~10）。

1.5.2 蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定 根據(jù)Bradford[10]方法，用牛血清白蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，蛋白濃度為0~90 μg/μL，在λ=595 nm時(shí)，應(yīng)用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1.6 雙向電泳

1.6.1 第一向等電聚焦電泳 參照王經(jīng)源等[11]的方法，進(jìn)行自制一向管膠的制備，在25 ℃，按以下程序，200 v 0.5 h，300 v 0.5 h，400 v 0.5 h，500 v 0.5 h，600 v 0.5 h，800 v 16.5 h，1000 v 4 h，1200 v 2 h，進(jìn)行一向等電聚焦。

1.6.2 膠條平衡 等電聚焦結(jié)束后，取出膠條，加入5 mL平衡液（Tris-HCL（pH6.8）4 mL，SDS 2 g，β-巰基乙醇 5 mL，甘油10 mL，稍加溴酚藍(lán)，藍(lán)色即可），平衡15~30 min。

1.6.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 參照王經(jīng)源等[11]的方法制備二向膠，電泳程序[12]，設(shè)置3個(gè)階段：（1）300 v，15 mA，0.5 h；（2）300 v，20 mA，2 h；（3）300 v，25 mA至溴酚藍(lán)帶達(dá)到膠底部0.6 cm左右，總共約6 h。

1.7 膠體染色與圖像的掃描分析

電泳結(jié)束后，采用硝酸銀染色方法染色[13]。膠片使用imagescan掃描，并用軟件ImageMasterTM 2D Platinum 5.0進(jìn)行圖像分析。

1.8 蛋白質(zhì)點(diǎn)膠內(nèi)酶解及肽段提取

1.8.1 脫銀 向取下的蛋白點(diǎn)加60 μL DD.H2O洗2～3次，10 min/次；加60 μL 100%乙腈，用漩渦振蕩器振蕩5 min，重復(fù)3次，脫水至膠粒完全變白，超凈臺(tái)吹干20~30 min；

1.8.2 膠內(nèi)消化 加入新鮮配制的10 mM DTT（在990 μL 25 mM NH4HCO3加入10 μL 1M DTT 配制）20 μL溶液，57 ℃孵育1 h；冷卻至室溫，用槍頭吸去殘留液。加入20 μL 55 mM碘乙酰胺（55 μL 1M IAM，945 μL 25 mM NH4HCO3現(xiàn)配）20 μL溶液，置于暗室 60 min。吸棄上清，用100微升的移液器加入60 μL 100 mM NH4HCO3溶液，用漩渦震蕩器震蕩混勻，室溫靜置5 min，如此重復(fù)1～3次；用移液器吸棄上清，加入60 μL乙腈，漩渦震蕩器震蕩混勻，室溫靜置5 min，重復(fù)1次；吸棄上清，加入60 μL 100 mM NH4HCO3溶液，漩渦震蕩器震蕩混勻，室溫靜置5 min；接著棄上清，加入60 μL乙腈，漩渦震蕩器震蕩混勻，室溫靜置5 min，重復(fù)1次，超凈臺(tái)吹干30 min。加入15 μL消化液（12.5 ng/μL胰酶（50 mM NH4HCO3配制）溶液），混勻，4 ℃或冰上放置30 min；用移液槍吸出多余的液體，接著加入10 μL 50 mM NH4HCO3溶液，轉(zhuǎn)速6000 rpm離心30 s，37 ℃消化12 h。

1. 9 質(zhì)譜分析

1.9.1 上樣 將其冷卻至室溫，轉(zhuǎn)速6000 rpm離心5 min，用移液槍收集消化液于1.5 mL離心管中；用20 mM碳酸氫銨溶液補(bǔ)至溶液終體積為15~20 μL；將其轉(zhuǎn)移至上樣管；用于質(zhì)譜分析。

1.9.2 LC MS/MS分析 LC MS/MS分析是在福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所進(jìn)行的。LC條件：高效液相色譜儀：Thermo Scientific Surveyor System；色譜柱：BioBasic C18 Column (100×0.18 mm，particle size: 5 um)；樣品量：10 μL；流動(dòng)相：A: 0.1% Formic acid in water；B: 0.1% Formic acid in acetonitrile；梯度：5%~35% B in 20 minutes, 35%~95% B in 2 minutes；流速：2.5 μL/min；MS條件：質(zhì)譜儀：LTQ-XL (Thermo Scientific)；噴霧電壓：3.5 kV；毛細(xì)管溫度：275 ℃；鞘氣流速：15 arb；母離子掃描范圍：400~2000 m/z；Isolation width：2 Da。二級(jí)質(zhì)譜條件：AGC Target 1e4, 1 microscans；碰撞能量：35% CID。

1.10 數(shù)據(jù)庫查詢及蛋白質(zhì)鑒定

質(zhì)譜分析所獲得的原始數(shù)據(jù)用Proteome Discoverer 1.2軟件進(jìn)行相對(duì)定量分析及數(shù)據(jù)庫的檢索。搜索使用的數(shù)據(jù)庫為從NCBI下載的蛋白庫。

2 結(jié) 果

2.1 不同種植方式烤煙根系差異蛋白質(zhì)圖譜

蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜見圖1，在等電點(diǎn)從3.5到10和分子量為14 KD到116 KD的范圍內(nèi)，通過軟件ImageMaster 5.0的分析，去除假點(diǎn)，每塊膠大概有403個(gè)點(diǎn)左右。圖譜清晰，蛋白質(zhì)點(diǎn)圓而多。

2.2 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的LC-MS/MS分析與鑒定結(jié)果

當(dāng)對(duì)應(yīng)上兩點(diǎn)之間差異達(dá)到2倍以上，認(rèn)為表達(dá)量有明顯差異，在根系樣品中檢測(cè)到15差異點(diǎn)，對(duì)這15個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行LC-MS/MS分析和生物信息學(xué)查詢后得到14個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜結(jié)果，見圖1，11個(gè)已知蛋白，3個(gè)未知蛋白，見表2。這11個(gè)蛋白，復(fù)種連作下10個(gè)蛋白下調(diào)表達(dá)，編碼分別是（2、25、35、43、44、48、49、50、52、53）；而只有1個(gè)蛋白上調(diào)表達(dá)，編碼42。

根據(jù)各個(gè)蛋白的功能將鑒定到的11個(gè)蛋白分成以下5大類。

Ⅰ 與植物營(yíng)養(yǎng)代謝相關(guān)蛋白 與植物營(yíng)養(yǎng)代謝相關(guān)蛋白1個(gè)，即轉(zhuǎn)酮醇酶（spot2:transketolase,TK）。

Ⅱ 與能量代謝相關(guān)蛋白 與能量代謝相關(guān)蛋白1個(gè)，為磷酸甘油酸酯激酶（spot50: phosphoglycerate kinase）。

Ⅲ 與植物抗性相關(guān)蛋白 與植物抗性相關(guān)蛋白有5個(gè)，包括線粒體內(nèi)膜移位酶亞基Tim13（spot25: mitochondrial import inner membrane translocase subunit Tim13），核苷酸結(jié)合位點(diǎn)和富亮氨酸重復(fù)的胞內(nèi)受體蛋白（spot44:NBS-LRR(nucleotide binding site plus leucine-rich repeat)），殺蟲晶體蛋白（spot43:I nsecticidal crystal protein）、單脫氫抗壞血還原酶（spot49: monodehydroascorbate reductase (MDHA)），DnaJ蛋白質(zhì)（spot52: DnaJ protein）。

Ⅳ 與物質(zhì)運(yùn)輸以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白 細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸?shù)鞍譙ly1（spot35: Vesicle trafficking protein Sly1），O-甲基轉(zhuǎn)移酶（spot48: O-methyltransferase- like protein），鎂依賴性磷酸酶（spot42: Mg-dependent phosphatase）。

Ⅴ核酸代謝相關(guān)蛋白 核糖體蛋白質(zhì)（spot53: Ribosomal protein-like protein）。

3 討 論

轉(zhuǎn)酮醇酶是在戊糖磷酸循環(huán)以及光合成的還原型戊糖磷酸循環(huán)中起著重要作用的酶，以焦磷酸硫胺素和Mg2+為輔基。此酶的作用是把磷酸酮糖上的乙酮醇基轉(zhuǎn)移給磷酸醛糖。Schenk等[14]研究認(rèn)為，催化2個(gè)碳原子單位從磷酸酮糖可逆地轉(zhuǎn)移到磷酸醛糖上，促進(jìn)磷酸六碳糖、五碳糖、四碳糖和三碳糖之間的可逆轉(zhuǎn)換。轉(zhuǎn)酮醇酶活性的微小下降即可導(dǎo)致植物生長(zhǎng)速度下降、芳香族氨基酸和苯丙氨酸代謝產(chǎn)物的抑制[15]。芳香族氨基酸是烤煙香氣的主要物質(zhì)[16]，苯丙氨酸代謝途徑是影響烤煙香味的主要次生代謝途徑。本研究結(jié)果表明，復(fù)種輪作烤煙根系TK上調(diào)表達(dá)，可能有助于提高煙葉的香氣，進(jìn)而有助于品質(zhì)提高，而復(fù)種連作下調(diào)表達(dá)，可能對(duì)品質(zhì)的提高有影響。

磷酸甘油酸酯激酶是糖酵解途徑中一個(gè)重要的酶，可催化1，3-二磷酸甘油轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸甘油酸，同時(shí)產(chǎn)生1個(gè)分子的ATP[17]。本研究結(jié)果表明，烤煙輪作與連作相比，烤煙根系磷酸甘油酸酯激酶上調(diào)表達(dá)，為烤煙根系生命活動(dòng)提供能量，一定程度上說明，復(fù)種連作烤煙根系活力低，可能不利于根系對(duì)養(yǎng)分的吸收，烤煙生長(zhǎng)較弱。

圖1 不同種植方式下烤煙根系蛋白圖譜

表 2 不同種植方式烤煙根系差異蛋白LC MS/MS質(zhì)譜分析結(jié)果

注：豐度變化為軟件根據(jù)蛋白質(zhì)點(diǎn)的相對(duì)體積生成的數(shù)值。

抗壞血酸在生物體中具有重要的代謝功能和抗氧化的作用，抗壞血酸與植物的抗逆性呈正相關(guān)性[18]。在植物體內(nèi)，抗壞血酸在抗壞血酸過氧化物酶的作用下，氧化生成單脫氫抗壞血酸。單脫氫抗壞血酸不穩(wěn)定，在單脫氫抗壞血酸還原酶的作用下可重新轉(zhuǎn)變成抗壞血酸[19]。因此，單脫氫抗壞血酸還原酶對(duì)于抗壞血酸的再生具有重要作用。而且抗壞血酸具有增強(qiáng)多酚類化合物穩(wěn)定性的作用，多酚是烤煙中的一類重要物質(zhì)，在烤煙的顏色、香氣、吸味等形成以及煙氣安全性方面都有重要影響；多酚本身不但具有弱的清香，而且在燃吸時(shí)產(chǎn)生的熱解成分對(duì)煙氣香味的形成有直接影響，可賦予煙氣烤香和清甜香[20]。核苷酸結(jié)合位點(diǎn)和富亮氨酸重復(fù)的胞內(nèi)受體蛋白，這是植物抗病基因中數(shù)量最多的一類[21]。熱激蛋白具有分子伴侶功能，主要參與生物體內(nèi)新生肽的運(yùn)輸、折疊、組裝、定位以及變性蛋白的復(fù)性和降解，在細(xì)胞生命活動(dòng)中起著重要的作用[22]。DnaJ蛋白作為輔助蛋白通過激活熱激蛋白的ATP酶活性而調(diào)控其活性[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)種輪作下這幾個(gè)蛋白均上調(diào)表達(dá)，可能有助于增強(qiáng)烤煙的抗性和提高煙葉的香氣，而復(fù)種連作下調(diào)表達(dá)，可能導(dǎo)致烤煙抗性弱，品質(zhì)較差。

O-甲基轉(zhuǎn)移酶催化甲基化反應(yīng)，通常以S-腺苷-甲硫氨酸作為甲基的供體。O-甲基轉(zhuǎn)移酶參與苯丙烷代謝途徑，植物體內(nèi)許多重要的次生性代謝物的合成多與甲基轉(zhuǎn)移酶有關(guān)，如木質(zhì)素和育兒酚都是甲基化衍生物，植物體內(nèi)與耐鹽能力有關(guān)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物質(zhì)——芒柄醇也是在肌醇甲基轉(zhuǎn)移酶作用下形成的[24]。木質(zhì)素對(duì)維管植物的機(jī)械支持、水分運(yùn)輸和病蟲害防御等具有重要作用[25]。細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸?shù)鞍譙ly1在細(xì)胞內(nèi)囊泡參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間的運(yùn)輸。本研究結(jié)果表明，復(fù)種輪作下烤煙根系O-甲基轉(zhuǎn)移酶和細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸?shù)鞍譙ly1上調(diào)表達(dá)，加快體內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸，可能有助于烤煙生長(zhǎng)和香氣的形成。磷酸酶是許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路控制磷酸化所必需的，是一種能夠?qū)?duì)應(yīng)底物去磷酸化的酶。鎂依賴性磷酸酶是涉及磷酸化作用重要的酶[26]，而磷酸化目的使蛋白的分子構(gòu)象發(fā)生變化，造成酶活力的缺失或者獲得。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)種連作下鎂依賴性磷酸酶上調(diào)表達(dá)，可能是連作障礙下，刺激了磷酸酶的活性，產(chǎn)生磷酸化作用，造成酶活力的缺失，但磷酸化或去磷酸化并不一定對(duì)應(yīng)著酶的激活或抑制，而且一些酶有多個(gè)磷酸化位點(diǎn)參與激活或抑制的調(diào)控。這個(gè)有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步深入的研究。

核糖體蛋白質(zhì)與核糖體RNA共同組成了核糖體，是合成蛋白質(zhì)的細(xì)胞器。除參與蛋白質(zhì)合成，核糖體蛋白質(zhì)還具有廣泛的核糖體外功能，如獨(dú)立于核糖體外發(fā)揮調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、mRNA翻譯、細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等[27]。在本研究結(jié)果表明，輪作烤煙根系核糖體蛋白質(zhì)上調(diào)表達(dá)，蛋白質(zhì)合成增加，也許有利于烤煙的生長(zhǎng)，而復(fù)種連作烤煙根系蛋白質(zhì)合成少，同時(shí)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄以及細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育能力降低，可能不利于烤煙的生長(zhǎng)。

4 結(jié) 論

復(fù)種輪作模式（烤煙-水稻→水稻-水稻→烤煙），鑒定到轉(zhuǎn)酮醇酶、磷酸甘油酸酯激酶、單脫氫抗壞血酸還原酶、核苷酸結(jié)合位點(diǎn)和富亮氨酸重復(fù)的胞內(nèi)受體蛋白、DnaJ蛋白、O-甲基轉(zhuǎn)移酶、細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸?shù)鞍譙ly1、核糖體蛋白質(zhì)等蛋白，涉及烤煙香氣的形成、營(yíng)養(yǎng)代謝、能量轉(zhuǎn)化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)運(yùn)輸、蛋白質(zhì)代謝等多種途徑，這些酶在復(fù)種輪作模式下均上調(diào)表達(dá)，由此可以表明復(fù)種輪作模式可能為烤煙的生長(zhǎng)提供了良好而又相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境，促進(jìn)根系生長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)煙草生長(zhǎng)，可能有助于提高煙草的產(chǎn)量和品質(zhì)，提高經(jīng)濟(jì)效益。而這些酶在復(fù)種連作模式（烤煙-水稻→烤煙-水稻→烤煙）均下調(diào)表達(dá)，可能影響烤煙生長(zhǎng)，使得烤煙生長(zhǎng)較弱，品質(zhì)較差，經(jīng)濟(jì)效益較低。綜上所述，復(fù)種輪作模式（烤煙-水稻→水稻-水稻→烤煙）有助于消減烤煙的連作障礙。

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Analysis of Root Differential Expression Proteins ofunder Two Planting Systems

YOU Chuihuai1,2, CHEN Dongmei1,2, HUANG Jinwen1, TANG Lina3, XU Zhibing1,2, ZHANG Zhongyi1,2, LIN Wenxiong1,2*

(1. Agro-ecological Institute, Fujian Agricultural and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 2. Institute of Tobacco, Fujian Agricultural and Forestry University, Fuzhou 350002, China; 3. Tobacco Agricultural Science Research Institute of Fujian Province, Fuzhou 350003, China)

Root differential proteomics was employed in this study to explore the impact of different planting patterns (multiple cropping rotation (MR) and consecutive monoculture multiple cropping (MC) modes) on growth of flue-cured tobacco (L). The results showed that a total of 15 protein spots had significant expression difference; 14 protein spots were identified by LC-MS/MS analysis and database searching. Among which, the function of 11 proteins were identified, three proteins were related to the aroma formation, i.e. transketolase, monodehydroascorbate reductase(MDHA), O-methyltransferase-like protein were up-regulated under MR, it was helpful probably to enhance the tobacco quality. While under the MC treatment, they were down-regulated, and the tobacco quality could be worse. Phosphoglycerate kinase, mitochondrial import inner membrane translocase subunit Tim13, NBS-LRR(nucleotide binding site plus leucine-rich repeat), DnaJ protein, Vesicle trafficking protein Sly1, Ribosomal protein-like protein were involved in energy metabolism, plant antioxidation reaction, translocation of solute, metabolism of nucleic acid, respectively. They were very important for the growth development of tobacco and all up-regulated under MR treatments, probably increasing the yield and improving the quality of tobacco, and gaining better economic benefit. They were all down-regulated under MC, which may cause weak growth, low yield and poor quality of tobacco.

flue-cured tobacco; two-dimensional electrophoresis; differential proteomic

TS413

1007-5119（2014）01-0089-07

10.13496/j.issn.1007-5119.2014.01.017

福建省煙草公司項(xiàng)目“福建煙區(qū)以煙為主耕作制度研究”{閩煙合同[2006]18號(hào)}，“福建清香型煙葉適宜區(qū)生態(tài)基礎(chǔ)研究”（閩煙合同[ 2010]-036）

尤垂淮，男，博士研究生，研究方向?yàn)闊煵萆砩鷳B(tài)和栽培技術(shù)。E-mail：you123chui@163.com。

通信作者，E-mail：wenxiong181@163.com

2013-01-05

2013-10-10