葉開(kāi)和，王婧茹，2，馬錦錦，王小康，張曉琦，葉文才，葉春玲

（1.暨南大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東廣州 510632；2.瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院，瑞典斯德哥爾摩 17177；3.暨南大學(xué)中藥與天然藥物研究所，廣東 廣州 510632）

糖尿?。╠iabetesmellitus，DM）是由胰島素絕對(duì)或相對(duì)不足引發(fā)的以慢性高血糖為主要表現(xiàn)的代謝綜合征，DM及其慢性并發(fā)癥已成為繼心腦血管疾病和腫瘤之后人類第3大死亡原因［1］。截至2010年，全球已有 2.85億糖尿病患者［2－3］，其中 90%為2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）患者［4］。T2DM的發(fā)病機(jī)制雖未完全闡明，但胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和胰島β細(xì)胞功能障礙是其發(fā)生發(fā)展的兩個(gè)主要環(huán)節(jié)［5］。對(duì)于胰島β細(xì)胞，其主要功能為合成、分泌胰島素，胰島素是維持機(jī)體正常代謝的關(guān)鍵物質(zhì)。該功能受營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、激素、神經(jīng)等因素的調(diào)控。其中葡萄糖是胰島素分泌機(jī)制的最重要調(diào)控因子［6］。

番石榴（Psidium guajava）為桃金娘科番石榴屬植物。番石榴葉提取物具有抗氧化和清除自由基、降血糖和降血壓等多種藥理活性［7］。本課題組首次發(fā)現(xiàn)番石榴葉總?cè)疲╰otal triperpenoids in Psidium guajava leaf，TTPGL）是番石榴葉降血糖的有效組分（發(fā)明專利號(hào)：ZL201110100466.5）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)高脂飲食＋小劑量鏈脲佐菌素（STZ）誘發(fā)的2型糖尿病大鼠模型，TTPGL有明顯的抗糖尿病作用，且能明顯升高糖尿病大鼠血清胰島素水平［8］?；瘜W(xué)成分研究發(fā)現(xiàn)，TTPGL富含高度氧化的五環(huán)三萜酸。已初步認(rèn)為其降血糖的活性部位以烏蘇烷型多羥基三萜酸為主要成分，其中烏蘇酸（ursolic acid）、2α-羥 基 烏 蘇 酸 （2α-hydroxyl-ursolic acid）、積雪草酸（asiatic acid）和番石榴酸（guavenoic acid，GA）四者的總相對(duì)含量為50%以上。為進(jìn)一步研究TTPGL的抗糖尿病作用，弄清總?cè)浦邪l(fā)揮抗糖尿病作用的活性成分及作用機(jī)制，本文將研究GA對(duì)INS-1胰島β細(xì)胞增殖、胰島素合成與分泌的促進(jìn)作用及初步作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 大鼠胰島素瘤細(xì)胞株，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。

1.1.2 主要儀器 SAFIRZ-Z Microplate Reader，

TZCAN，Austria；SN-682B全自動(dòng) γ計(jì)數(shù)器，上海日環(huán)儀器有限公司；PTC-1152 PCR儀，BIO-RAD，USA；CFD-3120熒光實(shí)時(shí)定量 PCR儀，BIO-RAD，USA。

1.1.3 藥品及主要試劑 番石榴酸（見(jiàn)Fig 1），純度95%，由暨南大學(xué)中藥與天然藥物化學(xué)研究所提供。RPMI 1640培養(yǎng)液（Lot.8112347）、0.05%胰酶-EDTA（1×）（Lot.210175K）、胎牛血清 （Lot.1184652），均購(gòu)自 Gibco公司；D－（＋）－葡萄糖、2β-巰基乙醇、DMSO，購(gòu)自 Sigma公司；MTT（Lot.M1959）購(gòu)自MP；碘［125I］胰島素放射免疫分析試劑盒，購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所；RIPA裂解液（強(qiáng)）、BCA蛋白定量試劑盒，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；TRIzol，購(gòu)自 Invitrogen；ReverTra Ace qPCR RT Kit，購(gòu)自 TOYOBO；SsoFast EvaGreen Supermix qPCR Kit，購(gòu)自BIO-RAD；DNA引物，委托華大基因合成。格列苯脲，暨南大學(xué)中藥與天然藥物化學(xué)研究所提供。

Fig 1 Structural formula of Guavenoic acid（GA）

1.2 方法

1.2.1 INS-1胰島細(xì)胞的培養(yǎng) 培養(yǎng)條件為含有10%FBS、5.6 mmol·L－1葡萄糖、100U雙抗、50 μmol·L－12β-巰基乙醇的 RPMI 1640培養(yǎng)液；于37℃，5%CO2環(huán)境培養(yǎng)。

1.2.2 INS-1胰島細(xì)胞增殖的測(cè)定 取15～20代INS-1胰島細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×108·L－1，接種于96孔板，100μl／孔，分為空白對(duì)照組、溶媒對(duì)照組（含1‰DMSO完全培養(yǎng)液）、給藥組（0.3、1、3、10、30 nmol·L－1GA）。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。種板24 h后，空白對(duì)照給予完全培養(yǎng)液，溶媒組與給藥組給予含有相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，每24 h換液。藥物作用48 h后，棄上清，PBS洗2次后加入120μl含MTT的基礎(chǔ)培養(yǎng)液（1∶5），37℃孵育4 h，酶標(biāo)儀570 nm，630 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度OD值。以增殖率表示INS-1胰島細(xì)胞的增殖程度：

增殖率／%＝（實(shí)驗(yàn)組OD值－空白對(duì)照組OD值）／空白對(duì)照組OD值×100%

1.2.3 INS-1胰島細(xì)胞內(nèi)胰島素含量的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×108·L－1，接種于 48孔板，500μl／孔，24 h后將細(xì)胞培養(yǎng)液吸去，按分組給藥干預(yù)，分為：空白對(duì)照組、溶媒對(duì)照組（含0.1%DMSO完全培養(yǎng)液）、給藥組（0.3、1、3、10、30 nmol·L－1GA）。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。種板24 h后，空白對(duì)照組給予完全培養(yǎng)液，溶媒組與給藥組給予含有相應(yīng)藥物（溶媒）的完全培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，每24 h換液。干預(yù)作用48 h后，棄上清，PBS洗后加入300 μl／孔HBSS緩沖液于37℃平衡30 min；加入預(yù)冷的PBS洗2次。每孔加入400μl酸醇提取液，4℃ 過(guò)夜，次日取上清液，800 r·min－1，4℃離心 5 min，取上清于－20℃保存待測(cè)胰島素量。同時(shí)設(shè)置相應(yīng)的復(fù)孔，不使用酸醇提取液處理，用于蛋白提取。樣品于－80℃保存待測(cè)蛋白含量，用于校正各孔胰島素量。結(jié)果以單位質(zhì)量胰島素濃度（每孔胰島素含量／相應(yīng)的蛋白含量）表示，即103IU·L－1·g－1Pro。

1.2.4 INS-1胰島細(xì)胞胰島素分泌的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至1×108·L－1，接種于 48孔板，500μl／孔，24 h后將細(xì)胞培養(yǎng)液吸去，按分組給藥干預(yù)，分為：空白對(duì)照組、溶媒對(duì)照組（含1‰DMSO完全培養(yǎng)液）、分泌模型組（5.6、16.7 mmol·L－1葡萄糖-HBSS溶液）、陽(yáng)性藥組（150 nmol·L－1格列苯脲，含0.1%DMSO）、給藥組（0.3、1、3、10、30 nmol·L－1GA），其中分泌模型組、陽(yáng)性藥組、給藥組均分為基礎(chǔ)糖刺激組（BIS）、高糖刺激組（GSIS）。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。種板24 h后，空白對(duì)照組給予完全培養(yǎng)液，溶媒組、分泌模型組給予含0.1%DMSO的完全培養(yǎng)液，陽(yáng)性藥組、給藥組給予含有相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，每24 h換液。干預(yù)48 h后，棄上清，PBS洗后加入300μl／孔 HBSS緩沖液于37℃平衡30 min；分泌模型組、陽(yáng)性藥組、給藥組的基礎(chǔ)糖刺激組（BIS），高糖刺激組（GSIS）分別給予5.6、16.7 mmol·L－1葡萄糖-HBSS溶液，300 μl／孔；空白組、溶媒組給予相同體積 HBSS。37℃孵育1 h后，取上清液，－20℃保存待測(cè)胰島素量。使用RIPA提取各孔蛋白，－80℃待測(cè)蛋白含量，用于校正各孔胰島素量。結(jié)果以單位質(zhì)量胰島素濃度（每孔胰島素含量／相應(yīng)的蛋白含量）表示，即103IU·L－1·g－1。

1.2.5 INS-1細(xì)胞胰島素及相關(guān)轉(zhuǎn)錄子mRNA表達(dá)的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至2×108·L－1，接種于 24孔板，500μl／孔，24 h后棄培養(yǎng)液。干預(yù)方法及分組同“1.2.2”，其中GA劑量調(diào)整為：0.3、3、30 nmol·L－1。藥物作用48 h后，棄上清，PBS洗，按TRIzol實(shí)驗(yàn)手冊(cè)提取總RNA，測(cè)定樣品濃度與純度后，逆轉(zhuǎn)錄。參照TOYOBO RT試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以RT產(chǎn)物為模板，加入SsoFast EvaGreen Supermix、對(duì)應(yīng)引物，以10μl體系進(jìn)行熒光定量 PCR，反應(yīng)條件為：95℃ 30 s，95℃ 5 s、61℃／59.9℃／58.7℃（Insulin／PDX-1／MafA）5 s共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)，溶解曲線（65～95）℃（in 0.5℃ inc.）5 s／step。

設(shè)計(jì)引物序列，分別為：RAT-Insulin引物（上游：5′-CACCCAAGTCCCGTCGTGAAGT-3′，下游：5′-GATCCACAATGCCACGCTTCTG-3′）；RAT-PDX-1引物（上游：5′-GGTGCCAGAGTTCAGTGCTAATC-3′，下游：5′-CTTCCCTGTTCCAGCGTTCC-3′）；RAT-MafA引物（上游：5′-AGGAGGAGGTCATCCGACTG-3′，下游：5′-CTTCTCGCTCTCCAGAATGTG-3′）；內(nèi)參 GAPDH引物（上游：5′-CCCACTCCTCCACCTTTGAC-3′，下游：5′-TCTTCCTCTTGTGCTCTTGC-3′），委托華大基因進(jìn)行引物合成。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以上實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果以ˉx±s表示。應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組比較用方差分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)，應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件繪圖。

2 結(jié)果

2.1 番石榴酸對(duì)細(xì)胞增殖的影響 結(jié)果表明，溶媒組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性。與溶媒對(duì)照組比較，較低劑量的 GA（1、3、10 nmol·L－1濃度）能明顯地促進(jìn)INS-1胰島 β細(xì)胞的增殖（P＜0.01），增殖率達(dá)（35.7±2.9）%、（51.2±4.4）%、（20.5±1.8）%，見(jiàn) Fig 2。

2.2 番石榴酸對(duì)細(xì)胞內(nèi)胰島素含量的影響 應(yīng)用放射免疫法測(cè)定GA干預(yù)48 h后的INS-1胰島β細(xì)胞內(nèi)胰島素含量，用對(duì)應(yīng)的總蛋白量校正。結(jié)果表明，溶媒組與空白對(duì)照組比較差異并無(wú)顯著性。給藥組與溶媒對(duì)照組1.77±0.11（103IU·L－1·g－1Pro）比較：GA能明顯地提高INS-1細(xì)胞內(nèi)胰島素含量（P＜0.01），0.3～30 nmol·L－1各濃度作用分別為：6.28±0.72、10.98±0.79、15.45±0.74、11.55±0.81、18.02±1.05（103IU·L－1· g－1Pro）。見(jiàn) Fig 3。

2.3 番石榴酸對(duì)胰島素分泌功能的影響 應(yīng)用放射免疫法測(cè)定INS-1胰島β細(xì)胞在GA干預(yù)48 h后的BIS、GSIS值，用對(duì)應(yīng)的總蛋白量校正。結(jié)果表明，溶媒組與空白對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性。與溶媒對(duì)照組（95.5±13.8）IU·L－1·g－1Pro比較，葡萄糖刺激的模型組INS-1胰島β細(xì)胞胰島素分泌量有所增加，模型組基礎(chǔ)胰島素分泌 BIS升高至（108.5±10.4）IU·L－1·g－1Pro（P＜0.05），GSIS升高至（186.4±28.3）IU·L－1·g－1Pro（P＜0.01）。與模型組比較，陽(yáng)性藥格列苯脲組INS-1β細(xì)胞的BIS、GSIS均有明顯的升高，分別為：（242.0±20.0）、（338.2±28.0）IU·L－1·g－1Pro（P＜0.01）。上述結(jié)果說(shuō)明分泌模型構(gòu)建成功。

GA對(duì)正常INS-1胰島β細(xì)胞的BIS、GSIS作用結(jié)果如下：① 與 BIS模型組（108.5±10.4）IU·L－1·g－1Pro比較，0.3 nmol·L－1的 GA便能明顯促進(jìn)INS－胰島細(xì)胞的 BIS能力（P＜0.05），達(dá)到（147.9±26.9）IU·L－1·g－1Pro；較高濃度 3、10、30 nmol·L－1促進(jìn)作用更為明顯（P＜0.01），分別為（203.6±20.0）、（230.6±20.0）、（403.4±24.0）IU·L－1·g－1Pro。② 與 GSIS模型組（186.4±28.3）IU·L－1·g－1Pro比較，0.3～30 nmol·L－1的GA均能明顯地提高INS-1細(xì)胞的GSIS能力（P＜0.01），分別為：（257.8±28.8）、（265.9±29.6）、（301.1±20.4）、（287.8±27.2）、（500.6±32.9）IU·L－1·g－1Pro。見(jiàn) Fig 4。

Fig 2 Effects of GA on proliferation of INS-1 cellsˉx±s，n＝6）*P＜0.05，**P＜0.01 vs medium.

Fig 3 Effect of GA on INS-1 cells intracellular insulin content（±s，n＝6）**P＜0.01 vs medium

Fig 4 Effects of GA on BIS and GSIS of INS-1 cells（ˉx±s，n＝6）△P＜0.05，△△P＜0.01 vs medium；*P＜0.05，**P＜0.01 vs BISofmodel；＃＃P＜0.01 vs GSIS ofmodel

2.4 番石榴酸對(duì) Insulin、PDX-1、M afA mRNA表達(dá)的影響 GA干預(yù)INS-1胰島β細(xì)胞48 h后，提取總RNA并測(cè)定其濃度與純度（測(cè)定結(jié)果A260／280在1.8～2.0正常范圍內(nèi)），逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，測(cè)定GA對(duì)INS-1細(xì)胞中Insulin、PDX-1、MafA的mRNA相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果如下：

2.4.1 Insulin mRNA相對(duì)表達(dá) 與溶媒對(duì)照組（1.20±0.27）比較，0.3、3、30nmol·L－1的 GA均能明顯上調(diào)INS-1細(xì)胞內(nèi)Insulin mRNA相對(duì)表達(dá)（P＜0.01），分別為 3.29±0.48、4.05±0.25、3.16±0.2。見(jiàn) Fig 5。

2.4.2 PDX-1 mRNA相對(duì)表達(dá) 與溶媒對(duì)照組（0.61±0.03）比較，GA（3、30 nmol·L－1）能明顯上調(diào)INS-1細(xì)胞內(nèi) PDX-1 mRNA相對(duì)表達(dá)（P＜0.01），達(dá)到1.60±0.23、1.58±0.02；而在0.3 nmol·L－1時(shí)則表現(xiàn)明顯的下調(diào)作用（P＜0.01），相對(duì)表達(dá)量為 0.13±0.02。見(jiàn) Fig 6。

Fig 6 Effects of GA on relative RNA expression of PDX-1 in INS-1 cells（±s，n＝6）**P＜0.01 vs medium

2.4.3 MafA mRNA相對(duì)表達(dá) 與溶媒對(duì)照組（0.59±0.11）比較，GA（3、30 nmol·L－1）能明顯上調(diào)INS-1細(xì)胞內(nèi)MafA mRNA相對(duì)表達(dá)（P＜0.01），達(dá)到3.94±0.32、3.17±0.26；而在 0.3 nmol·L－1時(shí)則表現(xiàn)出明顯的下調(diào)作用（P＜0.01），相對(duì)表達(dá)量為0.16±0.02。見(jiàn) Fig 7。

Fig 7 Effect of GA on relative RNA expression of MafA in INS-1 cells（±s，n＝6）**P＜0.01 vs medium.

3 討論

胰島β細(xì)胞損傷減少的程度是DM發(fā)生發(fā)展的一個(gè)關(guān)鍵因素［9－10］。胰島β細(xì)胞約占胰島細(xì)胞總數(shù)的60%～75%，具有合成、分泌胰島素的功能［11］。胰島β細(xì)胞數(shù)量及其功能的正常發(fā)揮，是機(jī)體調(diào)節(jié)糖、脂肪及蛋白質(zhì)代謝的重要保障［12］。胰島β細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)平衡主要取決于細(xì)胞增殖、凋亡以及生長(zhǎng)因子、葡萄糖與氨基酸等物質(zhì)［13］。若藥物能夠促進(jìn)胰島β細(xì)胞的增殖，則可能通過(guò)增加細(xì)胞數(shù)量使胰島素分泌量提高，改善糖尿病的糖代謝異常。

目前研究認(rèn)為磷脂酰肌醇-3激酶－絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶／蛋白激酶 B（PI3K-Akt／PKB）信號(hào)通路對(duì)調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞數(shù)量與功能發(fā)揮著十分重要的作用，已證實(shí)絲氨酸／蘇氨酸激酶Akt是這條通路中的下游分子，是調(diào)節(jié)細(xì)胞功能與誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞增殖的潛在靶點(diǎn)［14］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1 nmol·L－1GA能明顯促進(jìn)INS-1胰島細(xì)胞的增殖，增加胰島素分泌細(xì)胞總量，具有明顯的促增殖作用，但其是否作用于PI3K-Akt／PKB信號(hào)通路還有待進(jìn)一步研究。

在基因水平，胰島素的合成受胰島素基因的調(diào)控，而在胰島素基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約－340 bp處存在一個(gè)高度保守的區(qū)域，該區(qū)域的存在保證了胰島素基因表達(dá)的組織特異性與受代謝調(diào)控的特點(diǎn)。許多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合于該區(qū)域，參與到了胰島β細(xì)胞功能的調(diào)控中，形成了精密的胰島素基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其中較為關(guān)鍵的啟動(dòng)子有：胰腺十二指腸同源盒1（pancreatic duodenal homeobox factor 1，PDX-1）、鳥(niǎo)類 MafA蛋白的哺乳動(dòng)物同系物（mammalian homologue of avian MafA／L-Maf，MafA）［15］等，以上啟動(dòng)子不但能夠調(diào)控胰島素基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)胰島β細(xì)胞其他生命過(guò)程也有作用。在胰島β細(xì)胞中，PDX-1是調(diào)節(jié)胰腺發(fā)育、胰島分化、增殖和維持胰島β細(xì)胞功能起關(guān)鍵作用的胰腺特異性轉(zhuǎn)錄因子［16－18］。文獻(xiàn)報(bào)道，長(zhǎng)期高糖刺激胰島細(xì)胞導(dǎo)致嚴(yán)重的氧化應(yīng)激會(huì)伴隨PDX-1DNA結(jié)合能力的下降，而抑制胰島素基因的轉(zhuǎn)錄［19］。MafA是編碼RIPE3b（in rat）／C1（in human）激活因子的基因，是最重要的控制胰島β細(xì)胞選擇性轉(zhuǎn)錄胰島素基因的Cisregulatory因子［20］。MafA作為堿性亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子，特異性定位于胰島素表達(dá)呈陽(yáng)性的細(xì)胞的核上，可通過(guò)與PDX-1協(xié)同作用在胰島素合成的過(guò)程中起到激活胰島素基因啟動(dòng)子的作用［21］。單獨(dú)上調(diào)MafA的表達(dá)，也可以提高內(nèi)源性胰島素mRNA的水平［22］。近期研究發(fā)現(xiàn) PDX-1、MafA不單作用于調(diào)控胰島素基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)β細(xì)胞的GSIS功能也有重要作用［15］。

胰島β細(xì)胞分泌胰島素的功能是通過(guò)興奮－分泌偶聯(lián)機(jī)制實(shí)現(xiàn)的［23－24］，調(diào)節(jié)其分泌功能的因子有兩大類：第一類為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括葡萄糖、氨基酸與脂肪酸等；第二類為非營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括神經(jīng)遞質(zhì)與激素等［24］。生理狀態(tài)下的胰島β細(xì)胞能夠接受整合這兩大類因子的信號(hào)，將機(jī)體內(nèi)的胰島素分泌維持在正常水平［25］。其中，最及時(shí)最主要的調(diào)節(jié)因素是葡萄糖的水平。胰島β細(xì)胞對(duì)生理范圍的血糖濃度變化非常敏感，對(duì)其產(chǎn)生應(yīng)答，通過(guò)KATP通道途徑調(diào)整胰島素的釋放。異常的葡萄糖刺激胰島素分泌（GSIS）是T2DM早期的特征，其特點(diǎn)是基礎(chǔ)分泌升高和減少對(duì)葡萄糖刺激的反應(yīng)［14］。

本實(shí)驗(yàn)選擇INS-1胰島β細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，側(cè)重于INS-1細(xì)胞有較高的胰島素含量，對(duì)GSIS較為敏感，且該功能在傳代80代內(nèi)保持穩(wěn)定；另外，INS-1細(xì)胞不合成胰高血糖素與生長(zhǎng)抑素，可以排除它們對(duì)結(jié)果的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與INS-1胰島β細(xì)胞特性相符，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)INS-1細(xì)胞中胰島素含量十分豐富；基礎(chǔ)濃度葡萄糖（5.6 mmol·L－1）和高濃度葡萄糖（16.7 mmol·L－1）均可刺激其釋放胰島素，且對(duì)高糖刺激更敏感。以上結(jié)果提示，本實(shí)驗(yàn)INS-1細(xì)胞胰島素分泌成功建立。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)INS-1胰島β細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)胰島素含量和胰島素分泌功能均進(jìn)行了探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GA能明顯增加細(xì)胞內(nèi)胰島素含量，促進(jìn)胰島素分泌，對(duì)BIS、GSIS均有明顯促進(jìn)作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GA對(duì)胰島素分泌的結(jié)果與其增加細(xì)胞內(nèi)胰島素含量的作用相一致。

胰島素合成受胰島素基因的調(diào)控，胰島素基因又受PDX-1、MafA等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。PDX-1表達(dá)缺陷誘導(dǎo)的 glucagon-like peptide-1receptor（GLP-1R）表達(dá)下調(diào)會(huì)影響GLP-1／GLP-1R信號(hào)通路，抑制glucagon-like peptide 1（GPL-1）促胰島素分泌的作用，造成胰島 β細(xì)胞功能損傷［26－27］。值得注意的是MafA活性的下降與β細(xì)胞功能下降的進(jìn)程相關(guān)。研究表明，MafA基因敲除小鼠會(huì)出現(xiàn)胰島素分泌受損進(jìn)而發(fā)展為糖尿病，伴隨有Insulin1、Insulin2、PDX-1、GLUT-2基因表達(dá)水平的下降［21］。有研究闡明MafA在GSIS調(diào)控方面也有重要的作用，過(guò)表達(dá)MafA會(huì)提高GSIS，以及上調(diào)β細(xì)胞中重要的基因表達(dá)（包括 GLUT2、PDX-1、GLP-1等）［28］。MafA可能是一種能夠嚴(yán)格調(diào)控維持β細(xì)胞功能相關(guān)基因的關(guān)鍵因素，特別是對(duì)于GSIS。

本實(shí)驗(yàn)選擇了胰島素基因和對(duì)胰島素基因表達(dá)、胰島β細(xì)胞分泌功能均有作用的轉(zhuǎn)錄因子PDX-1、MafA作為研究對(duì)象，測(cè)定GA對(duì)以上3種基因mRNA相對(duì)表達(dá)的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GA能上調(diào)胰島素基因表達(dá)；GA增加細(xì)胞內(nèi)胰島素含量的作用靶點(diǎn)可能涉及Insulin基因。

GA在濃度 3、30 nmol·L－1時(shí)上調(diào) PDX-1基因表達(dá)，此結(jié)果與Insulin基因表達(dá)結(jié)果相一致，說(shuō)明GA可能是通過(guò)PDX-1調(diào)控Insulin基因表達(dá)，從而增加細(xì)胞內(nèi)胰島素含量。結(jié)合分泌功能結(jié)果進(jìn)行作用機(jī)制分析，GA可能通過(guò)上調(diào)PDX-1的表達(dá)，提高了INS-1細(xì)胞的分泌能力。此外，GA在濃度3、30 nmol·L－1時(shí)能夠上調(diào)MafA表達(dá)，提示其增加細(xì)胞內(nèi)胰島素含量、促進(jìn)胰島素分泌的作用機(jī)制可能與其上調(diào)MafA基因表達(dá)有關(guān)。然而，GA在很低濃度0.3 nmol·L－1時(shí)表現(xiàn)的下調(diào) PDX-1、MafA基因表達(dá)，其原因需進(jìn)一步研究。

綜上所述，GA可促進(jìn)INS-1胰島β細(xì)胞增殖、增加細(xì)胞內(nèi)胰島素含量、促進(jìn)胰島素分泌；其作用機(jī)制可能通過(guò)上調(diào)Insulin、PDX-1、MafA基因的表達(dá)。GA可能有利于改善β細(xì)胞功能，延緩T2DM及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。

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