董賢慧，高維娟，孔衛(wèi)娜，張 瑜，邵鐵梅，于文國，柴錫慶，

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 050000；2.河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北石家莊 050000；3.河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050200；4.承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德 067000）

阿爾采末?。ˋlzheimer’s disease，AD）是一種與年齡相關(guān)的以進(jìn)行性記憶和認(rèn)知功能障礙為特征的神經(jīng)變性疾病。特征性病理變化表現(xiàn)為膽堿能神經(jīng)元功能障礙、神經(jīng)元和突觸丟失、細(xì)胞外β-淀粉樣肽（amyloid beta，Aβ）聚集形成老年斑（sennepfaques，SPs）［1］和細(xì)胞內(nèi)高度磷酸化的 tau蛋白形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）。

中藥淫羊藿、黃芪、葛根提取的有效組分具有調(diào)節(jié)臟腑功能，對AD有一定的治療作用。本實(shí)驗(yàn)以APPswe／PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基小鼠為動(dòng)物模型，采用 Morris水迷宮、改良Bielschowsky銀染法以及尼氏染色法探討淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方對 APPswe／PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力及病理學(xué)影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組處理 ♂的APPswe／PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠6月齡20只，隨機(jī)分為模型組（Tg組）和復(fù)方組（Tg effective fraction組），每組10只小鼠。復(fù)方組小鼠給予中藥淫羊藿、黃芪、葛根提取的有效組分復(fù)方灌胃，1次／天，連續(xù)灌胃3個(gè)月。中藥淫羊藿、黃芪、葛根提取的有效組分分別為淫羊藿苷、黃芪甲苷、葛根素，3種有效成分按照比例3∶2∶2，即淫羊藿苷120 mg·kg－1、黃芪甲苷 80 mg·kg－1、葛根素80 mg·kg－1體重給予小鼠灌胃。模型組采用等量生理鹽水灌胃。6月齡C57BL／6J小鼠10只作為陰性對照（Non-Tg）。全部動(dòng)物分別單籠喂養(yǎng)于光照／黑暗為12 h／12 h的恒溫環(huán)境，自由攝食和飲水。

1.2 采用M orris水迷宮檢測各組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力 采用Morris水迷宮對各組小鼠進(jìn)行行為認(rèn)知能力測試。Morris水迷宮主要由圓形水池和自動(dòng)錄像及分析系統(tǒng)組成。圓形水池直徑120 cm、高50 cm，平臺直徑為10 cm，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中保持操作者位置及周圍環(huán)境的相對穩(wěn)定。

1.2.1 定位航行試驗(yàn) 歷時(shí)5 d，每日分上、下午兩個(gè)時(shí)段，固定時(shí)間為每日上午 9：00－11：00，下午14：00－16：00進(jìn)行。每個(gè)時(shí)段分別從4個(gè)不同的入水點(diǎn)入水，將大鼠面向池壁放人水中，記錄2 min內(nèi)尋找到平臺所用的時(shí)間，即逃避潛伏期。若小鼠入水后2 min內(nèi)未能找到平臺，則將其置于平臺上并停留10 s，記錄逃避潛伏期為120 s。每次訓(xùn)練時(shí)間間隔為60 s。同時(shí)記錄各組小鼠的游泳速度，計(jì)算其平均游泳速度。

1.2.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 用于測量動(dòng)物對平臺空間位置準(zhǔn)確記憶，即記憶保持能力。d 6撤除平臺，任選一個(gè)入水點(diǎn)將動(dòng)物放入水中，動(dòng)物在水中游泳120 s，測量120 s內(nèi)小鼠跨過原平臺的次數(shù)，即為跨臺次數(shù)。

1.3 改良Bielschowsky銀染法觀察小鼠腦內(nèi)老年斑 小鼠水迷宮后，甲醛灌注處死后取腦，石蠟包埋，常規(guī)石蠟切片脫臘至水，20%AgNO3水溶液37℃孵育30 min，4%甲醛還原，滴加氨銀染液200 μl室溫孵育10 min，3%甲醛溶液浸泡，逐級酒精脫水、二甲苯透明、中性樹脂封片，光鏡下觀察。

1.4 尼氏染色觀察 取石蠟切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水后入蒸餾水，置于預(yù)熱至60℃的2%硫瑾染色30 min后，以蒸餾水速洗，用95%酒精分色，鏡檢至神經(jīng)元尼氏體清晰呈紫色，無水酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。Morris水迷宮逃避潛伏期采用重復(fù)測量資料的方差分析（RM ANOVA）。

2 結(jié)果

2.1 M orris水迷宮檢測各組小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力情況 水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠的逃避潛伏期與C57對照組小鼠相比明顯延長（P＜0.05），復(fù)方組小鼠的逃避潛伏期與模型組小鼠相比明顯縮短（P＜0.05），如 Fig 1。

Fig 1 Effects of effective fraction of Astragalus，Radix Puerariae，Epimedium on the escape latency of them ice in each group**P＜0.01 vs C57 group；＃＃P＜0.01 vs AD model group.

APPswe／PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠的游泳速度與 C57對照組小鼠相比增大（P＜0.05），復(fù)方組小鼠的游泳速度與模型組小鼠相比無差異（P＞0.05），如Fig 2。

Fig 2 Effects of effective fraction of Astragalus，Radix Puerariae，Epimedium on the average swimming velocity of themice in each group**P＜0.01 vs C57 group.

空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠與C57對照組小鼠相比跨臺次數(shù)減少（P＜0.05），復(fù)方組小鼠跨臺次數(shù)與模型組小鼠相比明顯增多（P＜0.05），如 Fig 3。

2.2 改良Bielschowsky銀染法觀察小鼠腦內(nèi)老年斑 改良Bielschowsky銀染法結(jié)果顯示，C57對照組小鼠大腦皮質(zhì)未見明顯改變，神經(jīng)原纖維排列有序、稀疏，如Fig 4A。模型組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)原纖維增粗、腫脹密集成寬帶狀，深染，神經(jīng)纖維纏結(jié)明顯，分布有大量老年斑，如Fig 4B；復(fù)方組小鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)纖維纏結(jié)情況減輕，可見少量老年斑，如Fig 4C。

Fig 3 Effects of effective fraction of Astragalus，Radix Puerariae，Epimedium on the p latform crossing of them ice in each group*P＜0.05 vs C57 group；＃P＜0.05 vs AD model group.

2.3 尼氏染色觀察小鼠腦內(nèi)病理改變 尼氏染色結(jié)果顯示，C57對照組小鼠海馬各區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊且密集，胞質(zhì)中尼氏體豐富，大腦皮層尼氏小體呈深藍(lán)色，細(xì)胞核淡藍(lán)色，背景略呈淺藍(lán)色，如圖5A；模型組小鼠神經(jīng)元水腫，細(xì)胞數(shù)量減少，排列稀疏，細(xì)胞間隙增大，胞質(zhì)內(nèi)尼氏體減少，分界不清，染成淡藍(lán)色，如Fig 5B；復(fù)方組小鼠較模型組小鼠神經(jīng)元水腫減輕，細(xì)胞數(shù)量增多，排量相對整齊，分界清晰，如Fig 5C。

3 討論

AD是常見的老年人慢性退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，目前其病因、發(fā)病機(jī)制還不是十分清楚，很大程度上制約了AD治療藥物的篩選。

建立動(dòng)物模型的目的是在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物身上復(fù)制人類疾病的模型，用于研究人類疾病的病因、發(fā)病、病理變化以及疾病的預(yù)防和治療。人們已經(jīng)設(shè)計(jì)了各種動(dòng)物模型諸如膽堿能系統(tǒng)損傷模型［2］、鋁模型［3］、tau蛋白模型［4］、Aβ模型［5］等，這些模型盡管可以存在部分特征性病理改變，但是因不能模擬人類疾病漸進(jìn)性的退行性改變，均不太理想。

AD的病因是多元性的，遺傳因素是其中的一個(gè)重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，1號、14號、19號及21號染色體等均與AD發(fā)病密切相關(guān)［6］。其中包括APP基因、早老蛋白（presenilin，PS）基因［7］、載脂蛋白 E（apolipoprotein E，ApoE）基因［8］、Tau蛋白基因［9］、UBQLN1（ubiquilin-1）蛋白基因［10］、α2巨球蛋白基因（α2M）［11］、脂蛋白受體相關(guān)蛋白基因（LRP基因）、組織蛋白酶D基因（CTSD基因）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶基因（ACE基因）、丁酰膽堿酯酶基因（BCHE基因）、超氧化物岐化酶基因、α1-抗糜蛋白酶基因、突觸核蛋白基因及二氫脂酰胺琥珀酰轉(zhuǎn)移酶基因以及其他許多不直接生成蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)元素，此外，目前日趨成熟的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物（transgenic animal）技術(shù)可以在活體上研究某一特定致病基因的作用，這些為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的建立提供了可能。

Fig 4 Effects of effective fraction of Astragalus，Radix Puerariae，Epimedium on the senile plaques in cerebral cortex of them ice in each groupA：Non-Tg；B：Tg；C：Tg effective fraction

Fig 5 Effects of effective fraction of Astragalus，Radix Puerariae，Epimedium on the cellular morphology in cerebral cortex of them ice in each groupA：Non-Tg；B：Tg；C：Tg effective fraction

阿爾采末病轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型種類繁多，包括單轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，像 PDAPP小鼠［12］、Tg2576［13］、APP23［14］、PS轉(zhuǎn)基因小鼠、JNPL3［15］等；雙轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，像 APPswe／PS1M146L、APPSL／PS1M146L、APPSL／PS1kI、APPKM670／671NL／APPV717F［16］、APP／apoE等；還包括多重轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，如 APP／PS1／tau［17－18］、CDK5／p35／tau等。而目前應(yīng)用最為廣泛的為APPswe／PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型，該模型是野生型C57BL／6J小鼠PS1基因E9缺失，不是滅活作用，促使其功能加強(qiáng)，是國際公認(rèn)的AD轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。APPswe／PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠來源于 C57BL／6J小鼠，所以本實(shí)驗(yàn)選擇C57BL／6J小鼠為陰性對照組。

本實(shí)驗(yàn)研究APPswe／PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型行為學(xué)及病理學(xué)變化，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示9月齡APPswe／PS1dE9小鼠定位航行實(shí)驗(yàn)與空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果與同月齡C57小鼠相比均有差異，說明9月齡APPswe／PS1dE9小鼠出現(xiàn)明顯的記憶能力缺陷，這與本實(shí)驗(yàn)中病理學(xué)方法，改良Bielschowsky銀染法結(jié)果發(fā)現(xiàn)9月齡APPswe／PS1dE9小鼠大腦皮質(zhì)散在分布有老年斑和尼氏染色結(jié)果顯示的APPswe／PS1ΔE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠神經(jīng)元水腫，細(xì)胞數(shù)量減少，尼氏體減少的結(jié)果相一致。

根據(jù)中醫(yī)“標(biāo)本兼治”的治療原則，治療AD應(yīng)補(bǔ)腎健脾，益氣養(yǎng)血以培其本；化痰、祛瘀、解毒以治其標(biāo)。因此，我們課題組將淫羊藿、黃芪、葛根有效組分（淫羊霍苷、黃芪總苷、葛根素）進(jìn)行組方，其中淫羊藿歸肝、腎經(jīng)，具補(bǔ)腎填精、生精養(yǎng)髓之功效，為君藥；黃芪歸肺、脾經(jīng)，為補(bǔ)氣圣藥，具補(bǔ)氣健脾、行血化瘀之功效，為臣藥；葛根歸脾、胃經(jīng)，具清熱、降火、排毒之功效，亦可升舉清陽，引諸藥上達(dá)于頭目，為佐藥。三藥合用，共起滋補(bǔ)肝腎、補(bǔ)脾養(yǎng)血，活血化瘀、清熱解毒、健腦益智之功。臨床研究發(fā)現(xiàn)，AD患者在服用黃芪、淫羊藿、葛根等中藥3個(gè)月后，其智力和記憶力得到有效提升，日常生活自理能力也有所增強(qiáng)，且治療中未出現(xiàn)明顯不良事件和副反應(yīng)［19］。

本課題針對AD虛、痰、瘀、毒共存互結(jié)的發(fā)病特點(diǎn)，制定補(bǔ)虛、化瘀、滌痰、解毒的治法，將淫羊藿、黃芪、葛根組方，發(fā)現(xiàn)淫羊藿、黃芪、葛根有效組分復(fù)方可以有效地改善APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，減輕其大腦皮質(zhì)神經(jīng)纖維纏結(jié)、老年斑以及神經(jīng)元水腫等改變。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 張 穎，林森相，華 茜，等.三七和梔子有效成分對AD轉(zhuǎn)基因小鼠早期腦內(nèi)淀粉樣蛋白清除作用的研究［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2012，28（2）：173－9.

［1］ Zhang Y，Lin SX，Hua Q，et al.Research on themechanism of the active ingredients of Sanchi and Gardenia removing the early amyloid in the AD transgenic mouse brain［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28（2）：173－9.

［2］ Kuznetsova E，Schliebs R.β-amyloid，cholinergic transmission，and cerebrovascular system-A developmental study in a mouse model of Alzheimer′s disease［J］.Curr Pharm Des，2013，19（38）：6749－65.

［3］ Nivsarkar M，Banerjee A.Establishing the probablemechanism of L-DOPA in Alzheimer′s disease management［J］.Acta Pol Pharm，2009，66（5）：483－6.

［4］ Lagoja I，Pannecouque C，Griffioen G，et al.Substituted 2-aminothiazoles are exceptional inhibitors of neuronal degeneration in tau-driven models of Alzheimer′s disease［J］.Eur J Pharm Sci，2011，43（5）：386－92.

［5］ Prakash A，Medhi B，Chopra K.Granulocyte colony stimulating factor（GCSF）improvesmemory and neurobehavior in an amyloidβinduced experimentalmodel of Alzheimer′s disease［J］.Pharmacol Biochem Behav，2013，110C：46－57.

［6］ Masoodi T A，Al ShammariSA，Al-Muammar M N，etal.Exploration of deleterious single nucleotide polymorphisms in late-onset Alzheimer disease susceptibility genes［J］.Gene，2013，512（2）：429－37.

［7］ Nizzari M，Thellung S，Corsaro A，et al.Neurodegeneration in Alzheimer disease：role of amyloid precursor protein and presenilin 1 intracellular signaling［J］.JToxicol，2012，187297.

［8］ Reiman EM，Chen K，Liu X，et al.Fibrillar amyloid-beta burden in cognitively normal people at 3 levels of genetic risk for Alzheimer′s disease［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（16）：6820－5.

［9］ Revett T J，Baker G B，Jhamandas J，et al.Glutamate system，amyloidβpeptides and tau protein：functional interrelationships and relevance to Alzheimer disease pathology［J］.J Psychiatry Neurosci，2013，38（1）：6－23.

［10］Viswanathan J，Haapasalo A，B?ttcher C，et al.Alzheimer′s disease-associated ubiquilin-1 regulates presenilin-1 accumulation and aggresome formation［J］.Traffic，2011，12（3）：330－48.

［11］Depboylu C，Lohmüller F，Du Y，et al.Alpha2-macroglobulin，lipoprotein receptor-related protein and lipoprotein receptor-associated protein and the genetic risk for developing Alzheimer′s disease［J］.Neurosci Lett，2006，400（3）：187－90.

［12］Lee JE，Han P L.An update of animalmodels of Alzheimer disease with a reevaluation of plaque depositions［J］.Exp Neurobiol，2013，22（2）：84－95.

［13］Eketj?ll S，Janson J，Jeppsson F，etal.AZ－4217：A high potency BACE inhibitor displaying acute central efficacy in different in vivo models and reduced amyloid deposition in Tg2576mice［J］.J Neurosci，2013，33（24）：10075－84.

［14］Nilsen L H，Mel?T M，Saether O，et al.Altered neurochemical profile in the McGill-R-Thy1-APP ratmodel of Alzheimer′s disease：a longitudinal in vivo 1 H MRS study［J］.J Neurochem，2012，123（4）：532－41.

［15］Lewis J，McGowan E，Rockwood J，et al.Neurofibrillary tangles，amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant（P301L）tau protein［J］.Nat Genet，2000，25：402－5.

［16］McLean D，Cooke M J，Albay R，et al.Positron emission tomography imaging of fibrillar parenchymal and vascular amyloid-βin TgCRND8 mice［J］.ACSChem Neurosci，2013，4（4）：613－23.

［17］Overk C R，Perez SE，Ma C，et al.Sex steroid levels and AD-like pathology in 3xTgAD mice［J］.JNeuroendocrinol，2013，25（2）：131－44.

［18］Marques SC，Lemos R，F(xiàn)erreiro E，etal.Epigenetic regulation of BACE1 in Alzheimer′s disease patients and in transgenic mice［J］.Neuroscience，2012，220：256－66.

［19］李立新，孫麗萍，尉繼偉，等.益氣養(yǎng)陰合劑加減辨證治療老年性癡呆［J］.中國臨床康復(fù)，2005，16（9）：93－4.

［19］Li L X，Sun L P，Wei JW，et al.Modified yiqi yangyinmixture in treating Alzheimer’s disease［J］.Chin J Clin Rehabilitat，2005，16（9）：93－4.