姚秀清，劉秀梅

(遼寧石油化工大學(xué)化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)部，遼寧撫順 113001)

隨著淡水養(yǎng)殖業(yè)集約化、高密度養(yǎng)殖的程度化不斷提高，集中投餌所產(chǎn)生的魚類糞便、殘餌和死亡的動(dòng)植物尸體所引起的水體氮素含量嚴(yán)重超標(biāo)，其中最重要的就是亞硝酸鹽含量［1-3］。它可以氧化魚蝦體內(nèi)的亞鐵血紅蛋白，使其成為高鐵血紅蛋白，導(dǎo)致其喪失運(yùn)輸氧的能力，最后造成魚蝦窒息死亡。所以，控制水體中的亞硝態(tài)氮成為水產(chǎn)規(guī)?；B(yǎng)殖成功的關(guān)鍵因素之一［4］。

本文對(duì)反硝化細(xì)菌進(jìn)行了富集和培養(yǎng)，并對(duì)其降解亞硝酸鹽進(jìn)行了初步的探索，為實(shí)際利用反硝化細(xì)菌進(jìn)行生物脫氮提供基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑

反硝化細(xì)菌(采集校內(nèi)人工湖水樣，用富集培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng));磷酸、檸檬酸、硝酸鈉、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硫酸鋅、硫酸肼、硫酸銅、無水乙醇、鹽酸、無水氯化鈣、磺胺、磷酸氫二鉀均為分析純;N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽，化學(xué)純;富集培養(yǎng)基:水1 L，葡萄糖，硝酸鈉，氯化鈣 0.067 g，磷酸氫二鉀 0.67 g，EDTA 微量，pH 值 7.0 ～7.5。

1.2 菌種的富集培養(yǎng)

將采集到的水樣加入到富集培養(yǎng)基中，用恒溫水浴將溫度控制在28℃左右。加入一定量硝酸鈉，使初始硝酸鹽氮(N-N)在1 500 mg/L左右，以葡萄糖為碳源，使 C/N比為4∶1，每24 h測(cè)定1次N-N和亞硝酸氮(N-N)的濃度，當(dāng)N-N濃度接近為0時(shí)，繼續(xù)添加硝酸鈉和葡萄糖，目測(cè)菌體濃度的變化，富集培養(yǎng)20 d左右，備用。

1.3 反硝化細(xì)菌降解N-N

取一定量的培養(yǎng)液，以4 000 r/min離心10 min，除去上清液，用去離子水稀釋沉淀物然后加入到含有一定濃度亞硝酸鈉的富集培養(yǎng)基(無硝酸鈉)中，以N-N的變化為檢測(cè)指標(biāo)，考察反應(yīng)溫度、投菌量、初始N-N濃度等因素對(duì)反硝化細(xì)菌降解N-N的影響。

1.4 分析方法

圖1 N-N含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of content of nitrite nitrogen

圖2 N-N含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of content of nitrite nitrogen

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種富集培養(yǎng)

圖3 反硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)過程中N-N和N-N濃度的變化Fig.3 The changes of concentration of nitrite nitrogen and nitrate nitrogen during the culture of the denitrifying bacteria

由圖3可知，隨著反硝化細(xì)菌的不斷生長(zhǎng)，NO3－-N濃度不斷降低，在經(jīng)過3 d后，NO3－-N濃度由初始的1 500 mg/L降低到100 mg/L左右，同時(shí)NO2－-N濃度逐漸增加，有一定程度的積累。在富集培養(yǎng)過程中，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足時(shí)，在水體表面會(huì)形成一層氣泡，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏時(shí)，氣泡量減少。為了加快富集進(jìn)度，當(dāng)N-N濃度降低到低于100 mg/L時(shí)，再次向富集培養(yǎng)液中加入一定量的硝酸鈉和葡萄糖，使菌體濃度逐漸增加。

2.2 溫度對(duì)亞硝酸鹽降解的影響

溫度對(duì)亞硝酸鹽降解的影響，見圖4。

圖4 溫度對(duì)N-N去除率的影響Fig.4 The effect of temperature on the removal rate of nitrite nitrogen

由圖4可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，不同溫度下的反硝化細(xì)菌對(duì)N-N的去除率都隨之增加，培養(yǎng)24 h時(shí)，不同溫度下的去除率相差不大，都在9% ～15%。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，去除率相差增大。當(dāng)溫度為28℃時(shí)，48，72，96 h的去除率逐漸增大，為4種溫度中最高值?？梢姺聪趸?xì)菌去除亞硝酸鹽最合適的溫度為28℃。

2.3 投菌量對(duì)亞硝酸鹽降解的影響

選取相同濃度的菌液各10，20，25 mL于28℃分別加入含有相同NO－2-N的培養(yǎng)體系中，考察其對(duì)亞硝酸降解的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 投菌量對(duì)NO－2-N去除率的影響Fig.5 The effect of dosage of denitrifying bacteria on the removal rate of nitrite nitrogen

由圖5可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，NO－2-N的去除率都逐漸增加，但增加的幅度并不相同。當(dāng)投菌量為20 mL時(shí)，在24，48，72 h的去除率都最高，最高達(dá)到68.6%。而投菌量為10 mL和25 mL時(shí)，NO2－-N去除率比較接近，都明顯低于20 mL投菌量的去除率。說明投菌量過高或者過低都不利于反硝化細(xì)菌對(duì)亞硝酸鹽的去除。

2.4 初始亞硝酸鹽濃度對(duì)降解亞硝酸鹽的影響

初始亞硝酸鹽濃度對(duì)降解亞硝酸鹽的影響，見圖6。

圖6 初始亞硝酸鹽氮濃度對(duì)NO2－-N去除率的影響Fig.6 The effect of initial nitrite nitrogen concetration on the removal rate of nitrite nitrogen

由圖6可知，不同初始亞硝酸鹽濃度條件下NO2－-N的去除率有較大的差異，初始濃度為3，10 mg/L時(shí)，NO2－-N的去除率較低。當(dāng)初始濃度為20 mg/L時(shí)，NO2－-N去除率隨時(shí)間增加上升很快，96 h時(shí)能達(dá)到97.1%，為本實(shí)驗(yàn)最適初始亞硝酸鹽濃度。

3 結(jié)論

(1)建立了反硝化細(xì)菌快速富集培養(yǎng)方法，在28～30℃，pH 在 7.0～7.5的厭氧條件下，經(jīng)過20 d的培養(yǎng)，可獲得菌含量比較充足反硝化細(xì)菌。

(2)當(dāng)反硝化細(xì)菌在溫度28℃，初始亞硝酸氮濃度為20 mg/L，投菌量為20 mL時(shí)，NO－2-N去除率最大，可達(dá)到97.1%，達(dá)到較好的亞硝酸的去除效果。

［1］曾慶武，梁運(yùn)祥，葛向陽.反硝化細(xì)菌的分離篩選及其反硝化特性的初步研究［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27(5):616-620.

［2］羅秀針，徐長(zhǎng)安，唐旭，等.反硝化細(xì)菌的篩選及其亞硝酸鹽降解特性研究［J］.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，25(4):513-516.

［3］吳美仙，李科，張萍華.反硝化細(xì)菌及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用［J］.浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2008，31(4):467-471.

［4］邵晴，余曉斌.好氧反硝化細(xì)菌的篩選及反硝化特性研究［J］.生物技術(shù)，2008，18(3):63-65.