李 艾，郝玉芹

（唐山學(xué)院a．環(huán)境與化學(xué)工程系；b．基礎(chǔ)教學(xué)部，河北 唐山063000）

隨著人類生活水平的提高和工業(yè)的迅猛發(fā)展，人們對(duì)油脂的需求量逐步增大，傳統(tǒng)的油脂來源如植物油脂和動(dòng)物油脂已不能滿足需求，因此，開發(fā)新的油脂資源成為必然趨勢(shì)［1］。微生物油脂是繼植物油脂、動(dòng)物油脂之后開發(fā)出來的又一人類食用油脂新資源。微生物油脂又稱單細(xì)胞油脂，是由霉菌、酵母菌、細(xì)菌和藻類等微生物在一定的條件下利用碳?xì)浠衔?、碳水化合物和普通油脂作為碳源、氮源而合成的油脂。它主要是由不飽和脂肪酸組成的甘油三酯［2］，與一般植物油脂有相似的脂肪酸組成，脂肪酸多以C16，C18為主。與動(dòng)植物油生產(chǎn)相比，微生物油脂生產(chǎn)具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長周期較短、生長所需原料豐富，同時(shí)不受場地、季節(jié)、氣候變化等因素限制等優(yōu)點(diǎn)，且生產(chǎn)工藝較簡單，開發(fā)潛力大，適宜進(jìn)行連續(xù)化大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)和開發(fā)。微生物油脂在解決各國油脂原料供應(yīng)問題，以及人類能源和環(huán)境問題將會(huì)發(fā)揮越來越重要的作用。研究表明，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)油脂是開拓油脂新資源的一條有效途徑［3］，我國也一直將篩選優(yōu)良的高產(chǎn)油脂酵母菌株作為科研的重點(diǎn)。由于同一種微生物在不同的培養(yǎng)條件下，其產(chǎn)油量和油脂成分不盡相同［4］，因此，優(yōu)化微生物的發(fā)酵條件對(duì)進(jìn)一步探索微生物的油脂積累具有重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)14份土樣和7株實(shí)驗(yàn)室保藏菌株進(jìn)行初篩、搖瓶復(fù)篩，以便得到1株油脂產(chǎn)量較高的酵母菌，繼而再以該菌株為材料，在搖瓶水平上對(duì)影響油脂積累的發(fā)酵條件進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1．1 材料的選取和制備

分離材料：取自不同地區(qū)的菜地、修車廠等附近的土樣共14份及實(shí)驗(yàn)室保藏酵母菌7株。

染液的配制。蘇丹黑B液：稱取蘇丹黑B 0．5 g，溶于100 m L70%的酒精中，攪拌使其充分溶解。番紅染液：量取2．5%番紅酒精液10 mL，加100 mL蒸餾水稀釋，攪拌使其充分溶解。

培養(yǎng)基的制備。富集培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖20，酵母膏10，蛋白胨20，青霉素鈉0．06。YEPD培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，p H值自然。固體培養(yǎng)基在YEPD基礎(chǔ)上加入1．5%瓊脂。液體種子培養(yǎng)基：同YEPD培養(yǎng)基。發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖40，酵母粉0．5，KH2PO41．0，MgSO4·7H2O 0．5，p H 值自然，在此培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，對(duì)氮源進(jìn)行調(diào)整以優(yōu)化油脂酵母生長條件。

種子液的制備。從保藏的菌種斜面上取一環(huán)菌體接種于50 mL液體種子培養(yǎng)基中，于28℃，250 r／min搖床培養(yǎng)48 h制備種子培養(yǎng)液。

搖瓶培養(yǎng)條件下的發(fā)酵條件優(yōu)化。設(shè)置氮源、發(fā)酵周期、接種量3個(gè)因素。取5 m L種子液轉(zhuǎn)接至45 m L發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，于28℃，250 r／min振蕩培養(yǎng)96 h后，收集菌體進(jìn)行分析。

1．2 分析方法

1．2．1 干重法

取一定體積的發(fā)酵液于離心管中，在4 000 r／min下離心15 min，棄上清液，得到濕菌體，濕菌體于105℃烘干至恒重得到干菌體，以g（干菌體）／L發(fā)酵液表示菌體的生物量［5］。

1．2．2 油脂含量和產(chǎn)量測(cè)定

采用索氏抽提法［6］：首先將圓底燒瓶洗凈放入105℃烘箱中烘干至恒重，用天平準(zhǔn)確稱其質(zhì)量，然后將一定量的干菌體研磨成粉末，用兩層濾紙包裹放進(jìn)索氏抽提器的提取管中，以60～90℃沸程的石油醚為溶劑回流，于90℃水浴中提取3 h左右，菌體內(nèi)油脂隨石油醚進(jìn)入到平底燒瓶內(nèi)，回流6～8 h，拆去索氏提取器，換上蒸餾裝置，蒸餾回收燒瓶內(nèi)石油醚。隨后將平底燒瓶放在105℃烘箱中烘至恒重，用天平準(zhǔn)確稱其重量。抽提前后燒瓶的質(zhì)量差即為所提油脂的重量。

2 結(jié)果與討論

2．1 平板初篩

采集的14份土樣和7株實(shí)驗(yàn)室保藏的酵母菌，經(jīng)平板分離和蘇丹黑染色后，選取蘇丹黑染色深、脂肪粒明顯的16株菌株作為搖瓶初篩的初始菌株。最終初篩結(jié)果見表1。從表1可以看出，微生物主要集中于潮濕的山底及營養(yǎng)豐富的菜地。這可能是由于不同成分的土壤對(duì)微生物生長的影響不同。

表1 平板初篩結(jié)果

2．2 搖瓶初篩

將平板初篩所獲得的酵母菌株，一株接兩瓶進(jìn)行搖瓶發(fā)酵初篩。發(fā)酵結(jié)束后染色，鏡檢，觀察細(xì)胞內(nèi)脂肪粒的生成情況，從而得到了7株油脂含量較高的菌株并對(duì)其編號(hào)，結(jié)果見表2。

表2 搖瓶初篩油脂含量較高菌株

初篩過程中比較了不同濃度的葡萄糖對(duì)酵母產(chǎn)脂的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可以看出用葡萄糖含量為40 g／L發(fā)酵液的酵母經(jīng)蘇丹黑染色后明顯比20 g／L發(fā)酵液的著色深，初步確定在搖瓶復(fù)篩中發(fā)酵液葡萄糖含量為40 g／L。

圖1 不同葡萄糖含量對(duì)同一酵母產(chǎn)脂的影響

2．3 搖瓶復(fù)篩

將初篩得到的7株高產(chǎn)菌株搖瓶發(fā)酵，收集菌體，用索氏提取器抽提細(xì)胞內(nèi)的油脂并測(cè)定其含量，同時(shí)測(cè)定細(xì)胞生物量和殘?zhí)?，測(cè)定結(jié)果見表3。由表3可知，3－1號(hào)酵母的油脂含量和生物量均最高，因此，選擇來自于汽車修理廠的3－1號(hào)酵母菌株作為最終篩選出的產(chǎn)油脂較高的菌株，用于酵母菌產(chǎn)油脂最佳發(fā)酵條件確定的實(shí)驗(yàn)。

表3 搖瓶復(fù)篩菌株指標(biāo)

2．4 酵母菌產(chǎn)油脂的最佳發(fā)酵條件

2．4．1 發(fā)酵周期對(duì)酵母產(chǎn)油的影響

發(fā)酵周期為2 d，3 d，4 d，5 d和6 d，營養(yǎng)物質(zhì)均相同的情況下，28℃，250 r／min振蕩培養(yǎng)，考察發(fā)酵周期對(duì)菌體生物量和油脂含量的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，生物量隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而增加；油脂含量則隨天數(shù)的增長先上升后下降，在第4 d時(shí)油脂含量達(dá)到最大值。因此選擇發(fā)酵周期為4 d。

圖2 發(fā)酵周期對(duì)酵母生物量和油脂含量的影響

2．4．2 氮源對(duì)酵母產(chǎn)油的影響

分別選擇酵母膏、硫酸銨、蛋白胨為氮源，添加量均為0．4%，其他成分均相同，28℃，250 r／min搖瓶發(fā)酵4 d，考察氮源對(duì)酵母菌生物量和油脂含量的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng)?shù)礊榻湍父鄷r(shí)，菌體的生物量最高；當(dāng)?shù)礊榱蛩徜@時(shí)，酵母菌生長的油脂含量最高，即酵母膏最適合菌體生長，而硫酸銨對(duì)油脂合成最有利。綜合考慮兩因素，選定氮源為酵母膏和硫酸銨的混合物。

2．4．3 接種量對(duì)酵母產(chǎn)油的影響

選擇接種量為5%，10%，15%，20%（以種子培養(yǎng)液為1×108為基準(zhǔn)），營養(yǎng)物質(zhì)均相同的情況下，28℃，250 r／min搖瓶發(fā)酵4 d，考察接種量對(duì)酵母菌生物量和油脂含量的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，生物量隨接種量的增加而增加，而油脂含量則隨接種量的增加先上升后下降，在接種量為10%時(shí)達(dá)到最大值，因此選擇最佳接種量為10%。

圖3 氮源對(duì)酵母菌生物量和油脂含量的影響

圖4 接種量對(duì)酵母菌生物量和油脂含量的影響

2．5 酵母菌產(chǎn)油脂最佳發(fā)酵條件的優(yōu)化

以發(fā)酵周期、氮源和接種量為因素做正交實(shí)驗(yàn)。正交因素水平表見表4，菌株產(chǎn)油發(fā)酵條件的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。由表5中生物量的R值可以看出，影響酵母菌細(xì)胞生物量的因素排序?yàn)椋築＞A＞C，即氮源的影響最大，接種量的影響最小；影響酵母菌油脂產(chǎn)量的因素排序?yàn)椋篈＞B＞C，即發(fā)酵周期的影響最大，接種量的影響最小；影響酵母菌油脂含量的因素排序?yàn)锳＞B＞C，即發(fā)酵周期的影響最大，接種量的影響最小。通過正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得出理論上高產(chǎn)油脂酵母菌產(chǎn)油脂的最佳條件為：A2B4C3，即在培養(yǎng)期為4 d，氮源為酵母膏和硫酸銨，接種量為12%時(shí)，該酵母菌的油脂含量最高。

表4 正交因素水平表

表5 菌株產(chǎn)油發(fā)酵條件的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

（續(xù)表5）

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驈钠囆蘩韽S土壤中篩選出一株高產(chǎn)油脂的酵母菌株，這可能因?yàn)樵撏寥栏缓挠蜐n較有利于油脂菌株的富集。通過對(duì)該菌株產(chǎn)油脂發(fā)酵條件的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵周期、接種量、氮源會(huì)影響菌株生長和代謝產(chǎn)物的積累。通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)，得出搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)的最佳產(chǎn)油脂條件為：發(fā)酵周期為4 d，酵母膏和硫酸銨混合物為氮源，接種量為12%。在該條件下所測(cè)得的菌體生物量為12．211 g／L，油脂產(chǎn)量為1．524 g／L，油脂含量為12．48%。

［1］ 張東輝，梁焯，萬霞，等．橘林油脂酵母發(fā)酵條件的初步研究［J］．中國油料作物學(xué)報(bào)，2012，34（1）：82－86．

［2］ 徐華順，羅玉萍，李思光．微生物發(fā)酵產(chǎn)油脂的研究進(jìn)展［J］．中國油脂，1999，24（2）：34－36．

［3］ 高媛，李元媛，王常高．高產(chǎn)油脂酵母的篩選及發(fā)酵條件的研究［J］．化學(xué)與生物工程，2010，27（1）：55－58．

［4］ 蒲海燕，賀稚非，劉春芬．微生物功能性油脂研究概況［J］．糧食與油脂，2005，3（3）：12－14．

［5］ 劉淑君，楊文博，施安輝．高產(chǎn)油脂酵母篩選機(jī)搖瓶發(fā)酵條件的研究［J］．微生物學(xué)通報(bào)，2000，27（2）：93－97．

［6］ 何東平，陳濤．微生物油脂學(xué)［M］．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006：228－232．