李云凱，張志眾，程 磊

（唐山學(xué)院 環(huán)境與化學(xué)工程系，河北 唐山063000）

蔗糖脂肪酸酯簡(jiǎn)稱蔗糖酯，指蔗糖與正羧酸反應(yīng)生成的一大類有機(jī)化合物的總稱，由親水的蔗糖和親油的脂肪酸組成［1］。蔗糖月桂酸酯是蔗糖酯的一種，是極好的表面活性劑和乳化劑。它無(wú)嗅、無(wú)味、無(wú)毒和無(wú)刺激性，可100%生物降解，對(duì)環(huán)境友好，因此應(yīng)用范圍極其廣泛［2］。傳統(tǒng)的蔗糖月桂酸酯產(chǎn)品多是采用化學(xué)法合成的，合成反應(yīng)在高溫、高壓下進(jìn)行，條件苛刻，終產(chǎn)物帶有顏色，同時(shí)發(fā)生多個(gè)平行反應(yīng)，導(dǎo)致催化反應(yīng)選擇性差，有副產(chǎn)物生成。而采用酶法合成蔗糖月桂酸酯，反應(yīng)條件溫和，且區(qū)位選擇性和立體選擇性強(qiáng)，表面活性性質(zhì)突出，具有很好的應(yīng)用前景。

1 材料和方法

1．1 材料

蔗糖月桂酸單酯（美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)），蔗糖月桂酸酯標(biāo)樣（上海龍尼精細(xì)化工有限公司），蔗糖、月桂酸、DMSO（二甲基亞砜）、叔丁醇均為分析純，固定化脂肪酶采用包埋法自制。

1．2 方法

1．2．1 蔗糖月桂酸酯的酶促合成

在150 m L的錐形瓶中加入一定比例的蔗糖和月桂酸，加入5 mL DMSO／叔丁醇有機(jī)溶劑，再加入一定量的磷酸鹽緩沖液。預(yù)熱至50℃左右完全溶解，冷卻至室溫，加入固定化脂肪酶在搖床上振蕩10 min混勻。然后放置振蕩培養(yǎng)箱中繼續(xù)反應(yīng)6 h，結(jié)束反應(yīng)，檢測(cè)鑒定并計(jì)算產(chǎn)率。

1．2．2 轉(zhuǎn)化率的測(cè)定

結(jié)束反應(yīng)，離心除去脂肪酶，用酚酞作為指示劑加入0．1 mol／L的NaOH中和反應(yīng)體系中殘留的月桂酸，以月桂酸的減少量計(jì)算酯化率，結(jié)果以相對(duì)轉(zhuǎn)化率表示［3－4］：相對(duì)轉(zhuǎn)化率＝反應(yīng)前后月桂酸物質(zhì)的量的差值÷初始反應(yīng)體系月桂酸的物質(zhì)的量×100%。

2 結(jié)果與分析

2．1 月桂酸和蔗糖的摩爾比對(duì)酯化反應(yīng)的影響

保持固定化脂肪酶的量一定，調(diào)節(jié)初始月桂酸與蔗糖的摩爾比為2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，10∶1進(jìn)行酯化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算相對(duì)轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見圖1。

圖1 月桂酸與蔗糖摩爾比對(duì)酯化反應(yīng)的影響

由圖1可知，當(dāng)月桂酸與蔗糖的摩爾比小于2時(shí)，基本上沒(méi)有酯化反應(yīng)發(fā)生；大于2時(shí)，隨摩爾比的增大，轉(zhuǎn)化率增加；摩爾比為8時(shí)能達(dá)到較高的轉(zhuǎn)化率，在90%左右，摩爾比大于8時(shí)轉(zhuǎn)化率變化平緩。因?yàn)槊复呋拇蟛糠址磻?yīng)是正逆反應(yīng)速率都比較顯著的可逆反應(yīng)，要使關(guān)鍵組分進(jìn)行轉(zhuǎn)化，必須保持另一種物質(zhì)的過(guò)量存在反應(yīng)才能以較快的速度向正反應(yīng)方向進(jìn)行，當(dāng)達(dá)到一定限度后，再增加過(guò)量組分的量，反應(yīng)速率增加不再明顯，而且由于酶受空間位阻的影響反而有可能會(huì)使反應(yīng)速率下降［5］。

2．2 固定化脂肪酶用量對(duì)酯化反應(yīng)的影響

稱取固定化脂肪酶的用量為0．1 g，0．2 g，0．3 g，0．4 g，0．5 g，其他條件固定，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行酯化反應(yīng)，反應(yīng)完成后測(cè)定酯化率，計(jì)算相對(duì)轉(zhuǎn)化率。

酶的濃度即用量的提高可以顯著縮短達(dá)到相同轉(zhuǎn)化率時(shí)所用的反應(yīng)時(shí)間，但增加了生產(chǎn)成本，因此需要對(duì)轉(zhuǎn)化率和酶的用量進(jìn)行優(yōu)化。在其他條件不變的情況下，僅改變脂肪酶用量得到的相對(duì)轉(zhuǎn)化率如圖2所示。

圖2 脂肪酶用量對(duì)酯化反應(yīng)的影響

由圖2可知，隨著酶用量的增加，蔗糖月桂酸酯的相對(duì)轉(zhuǎn)化率在一定范圍內(nèi)呈線性方式增加，當(dāng)酶用量達(dá)到0．3 g時(shí)相對(duì)轉(zhuǎn)化率達(dá)到91%，而后再提高酶濃度，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化率幾乎維持不變，說(shuō)明催化活性中心周圍不僅沒(méi)有足夠的底物進(jìn)行反應(yīng)反而造成了活性中心的“浪費(fèi)”［6］。因而，當(dāng)酶用量超過(guò)一定數(shù)值，相對(duì)轉(zhuǎn)化率反而有下降的趨勢(shì)，其原因可能是過(guò)量的酶吸附了反應(yīng)過(guò)程中的溶劑，導(dǎo)致部分底物過(guò)飽和而析出，也可能是過(guò)量的酶加速了逆反應(yīng)的進(jìn)程即產(chǎn)物的分解，對(duì)轉(zhuǎn)化率產(chǎn)生了一定的影響。

2．3 溫度對(duì)酯化反應(yīng)的影響

保持月桂酸、蔗糖及酶用量的比例不變，反應(yīng)溫度分別設(shè)定為25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定酯化率，計(jì)算相對(duì)轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見圖3。

圖3 溫度對(duì)酯化反應(yīng)的影響

由于酶的催化反應(yīng)都存在最適的反應(yīng)溫度，在此溫度范圍酶的催化反應(yīng)速率達(dá)到最大，低于或高于此溫度反應(yīng)速率都會(huì)下降，酯化反應(yīng)的進(jìn)程顯然會(huì)受影響。由圖3可以看出，在30℃時(shí)相對(duì)轉(zhuǎn)化率最大，而后隨著溫度的升高，轉(zhuǎn)化率明顯降低，說(shuō)明此時(shí)酶的催化能力下降，該固定化脂肪酶的最適反應(yīng)溫度為30℃。

2．4 緩沖液p H值對(duì)酯化反應(yīng)的影響

嚴(yán)格配制p H 值分別為6．5，7．0，7．5，8．0，8．5的緩沖液，其他條件不變，在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中進(jìn)行酯化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算相對(duì)轉(zhuǎn)化率。結(jié)果見圖4。

圖4 緩沖液p H值對(duì)酯化反應(yīng)的影響

維持正常的催化反應(yīng)活性，酶要求其反應(yīng)體系的p H值的大小有一定的范圍，同時(shí)，緩沖體系含有的定量的水對(duì)蔗糖分子存在形態(tài)有一定的影響。由圖4可知，當(dāng)緩沖液的p H值增大時(shí)，相對(duì)轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)p H為7．5時(shí)，相對(duì)轉(zhuǎn)化率最大，再增大緩沖液p H值，轉(zhuǎn)化率則會(huì)下降。說(shuō)明固定化脂肪酶的催化活性有最適的p H值，體系p H值偏堿性使轉(zhuǎn)化率降低也可能是反應(yīng)產(chǎn)物的水解加劇所致。

2．5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯化反應(yīng)的影響

調(diào)節(jié)兩種反應(yīng)物初始摩爾比8∶1，脂肪酶用量0．3 g，反應(yīng)溫度設(shè)定在30℃，反應(yīng)體系的p H調(diào)節(jié)為7．5。改變反應(yīng)時(shí)間分別為2 h，4 h，6 h，8 h，10 h進(jìn)行酯化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算相對(duì)轉(zhuǎn)化率。結(jié)果見圖5。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯化反應(yīng)的影響

酶催化反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間要顯著小于使用化學(xué)催化劑時(shí)的反應(yīng)時(shí)間，但時(shí)間太短也會(huì)使反應(yīng)不夠完全，轉(zhuǎn)化率低，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)逆反應(yīng)速率會(huì)增大使反應(yīng)產(chǎn)物水解。由圖5可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間小于6 h時(shí)，產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率一直在顯著的增大，說(shuō)明反應(yīng)過(guò)程是一個(gè)緩慢的進(jìn)程，反應(yīng)需要充足的時(shí)間，但反應(yīng)超過(guò)6 h轉(zhuǎn)化率又有明顯的下降趨勢(shì)，說(shuō)明生成的蔗糖月桂酸酯的水解速率加劇，產(chǎn)物減少。

2．6 固定化脂肪酶的重復(fù)活性測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用的脂肪酶是用包埋法自制的固定化脂肪酶，檢驗(yàn)脂肪酶活性以便判斷其是否可以多次重復(fù)利用，以減小成本或者推廣到其他類似實(shí)驗(yàn)中。固定其他條件均為最優(yōu)條件，以脂肪酶催化的初始反應(yīng)速率為指標(biāo)對(duì)脂肪酶重復(fù)使用4次的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。如圖6所示，隨著重復(fù)次數(shù)的增多，酶催化反應(yīng)的初速率呈顯著下降趨勢(shì)，在使用3次后，酶的反應(yīng)初速率從最初的0．234 mol／（L·min）下降到了0．13 mol／（L·min），下降近一倍，已不適合繼續(xù)進(jìn)行催化反應(yīng)，同時(shí)有解體的趨勢(shì)，故本實(shí)驗(yàn)所用的催化劑的重復(fù)使用次數(shù)控制在2次以內(nèi)為宜，超過(guò)2次則需更換新的催化劑。的吸收峰為羰基的伸縮振動(dòng)吸收，1 113 cm－1是C－O－C的伸縮振動(dòng)吸收，是酯的特征吸收峰。此外還有明顯的2 928 cm－1羥基的伸縮振動(dòng)吸收和951 cm－1附近的糖苷鍵特征吸收，而且反應(yīng)得到的產(chǎn)物和蔗糖月桂酸單酯標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜圖的特征圖譜形狀基本相同，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)合成的產(chǎn)品是蔗糖月桂酸酯，得到的應(yīng)該是單酯和多酯的混合物。

圖6 固定化酶的循環(huán)使用

圖7 蔗糖月桂酸酯的薄層色譜圖

圖8 反應(yīng)物和產(chǎn)物的紅外光譜圖

2．7 產(chǎn)物的薄層色譜分析

圖7為蔗糖月桂酸酯的薄層色譜圖。圖右端有一系列的斑點(diǎn)，最下端為蔗糖月桂酸單酯，其與標(biāo)準(zhǔn)品的位置相對(duì)應(yīng)，其他位置的斑點(diǎn)較淺，應(yīng)該是產(chǎn)物中其他的脂肪酸酯混合物。

2．8 產(chǎn)物的紅外光譜分析

月桂酸、蔗糖月桂酸單酯標(biāo)準(zhǔn)品及產(chǎn)物的紅外光譜圖如圖8所示。由圖8可知，3 322 cm－1附近的峰為－OH的伸縮振動(dòng)吸收，2 916 cm－1為CH 的伸縮振動(dòng)吸收，1 450 cm－1處為DC－H伸縮振動(dòng)吸收。提純的反應(yīng)產(chǎn)物在1 738 cm－1處

3 結(jié)論

在有機(jī)相溶劑DMSO／叔丁醇體系中，以固定化脂肪酶為催化劑催化月桂酸與蔗糖的酯化反應(yīng)，結(jié)果表明，當(dāng)月桂酸與蔗糖的摩爾比大于8，反應(yīng)溫度為30℃，固定化脂肪酶用量為0．3 g，緩沖液體系p H值為7．5，反應(yīng)6 h時(shí)，酯化反應(yīng)的相對(duì)轉(zhuǎn)化率較高，可達(dá)到90%以上。對(duì)自制的固定化脂肪酶重復(fù)活性測(cè)定結(jié)果表明，本催化劑重復(fù)使用次數(shù)控制在2次為宜。通過(guò)對(duì)有機(jī)溶劑提取的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行薄層色譜及紅外光譜分析，證實(shí)所合成的產(chǎn)物為蔗糖月桂酸酯。

［1］ 趙裕蓉，王寧玲．生物法制蔗糖酯──生物表面活性劑［J］．北京化工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)報(bào)，1996，23（4）：6－10．

［2］ 李祖義，徐國(guó)梁，袁長(zhǎng)貴，等．生物表面活性劑催化合成蔗糖酯及其應(yīng)用［J］．上?；?，1999，24（21）：6－8．

［3］ 張軍，徐家立．固定化假絲酵母1619脂肪酶催化油酸油醇酯 的 合 成 ［J］．生 物 工 程 學(xué) 報(bào)，1995，11（4）：325－331．

［4］ 寇秀芬，徐家立．酶法合成糖及糖醇酯［J］．微生物學(xué)報(bào)，2000，40（2）：193－197．

［5］ Sarney D B，Kapeler H，F(xiàn)regapane G，et al．Chemoenzymatic synthesis of disaccharide fatty acid esters［J］．J Am Oil Chem，1994，71（7）：711－714．

［6］ 譚賢勇．非水相酶法合成蔗糖－6－酯的研究［D］．南寧：廣西大學(xué)，2006．