陳蓉,陳偉,吳啟南

(1.蘇州市食品藥品檢驗所,蘇州 215104；2.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院,蘇州 215006；3.南京中醫(yī)藥大學藥學院,南京 210046)

基于近紅外指紋圖譜的芡實藥材快速分析*

陳蓉1,陳偉2,吳啟南3

(1.蘇州市食品藥品檢驗所,蘇州 215104；2.蘇州市中醫(yī)醫(yī)院,蘇州 215006；3.南京中醫(yī)藥大學藥學院,南京 210046)

目的 采用近紅外光譜技術對不同產地芡實進行鑒定,建立基于近紅外指紋圖譜的快速分析方法。方法17批不同產地的芡實,采用VARIAN CARY5000型紫外可見近紅外分光光度計采集光譜,利用Origin 7.5版和SPSS 18.0版軟件進行譜圖相關性分析和產地聚類。結果 17個產地芡實特征峰相關性顯著,產地區(qū)分明顯。結論 近紅外光譜法能夠簡便快捷無損地對芡實進行鑒別,可為中藥材的快速檢測提供一定參考。

芡實;近紅外光譜;分析,快速

近紅外光譜(near-infrared spectroscopy)是介于可見光譜區(qū)與中紅外譜區(qū)之間的譜帶。譜區(qū)范圍為4 000～12 500 cm-1(800～2 500 nm),其吸收譜帶主要是C-H、N-H、O-H等含氫基團在中紅外吸收基頻的倍頻及合頻。該技術主要優(yōu)點是:樣品制備過程簡單,無損,無污染；能同時快速測定同一樣本中不同成分,且可重復測量；質量過程可控,滿足在線檢測需求；適用于固態(tài)、粉粒態(tài)、半固態(tài)、液態(tài)等各種樣本。主要缺點是:檢測限高,依賴樣品質量；靈敏度低,要求樣品中成分達到百萬級以上；建模困難,阻礙了近紅外光譜技術普及[1]。

芡實為睡蓮科植物芡(Euryale feroxSalisb)的干燥成熟種仁[2]。始載于《神農本草經》,列為上品[3]。芡實含有多糖、氨基酸、淀粉、黃酮等多種成分,受地理環(huán)境因素的影響,其化學成分也不盡相同,直接測定粉末近紅外光譜,利用各個化學成分吸收特征的疊加,結合中紅外光譜[4],具有指紋性[5-7]。

1 材料與方法

1.1 藥材 芡實來源于全國16個產地及1個對照藥材,經南京中醫(yī)藥大學藥學院吳啟南教授鑒定為睡蓮科植物芡(Euryale feroxSalisb)的干燥成熟種仁。具體信息見表1。

1.2 儀器與設備 VARIAN CARY5000紫外可見近紅外分光光度計,配備積分球漫反射附件,異面復式Littrow單色器(美國VARIAN公司)；DHG-9023A型恒溫干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.3 方法 樣品60℃烘干12 h,不經其他處理,取約2 g裝于石英瓶中測量杯中,以金箔為參比,采用積分漫反射測定。光譜分辨率為8 cm-1,測量范圍2 500～800 nm,掃描次數64次,掃描速度0.633 0 cm·s-1,每個樣品重復測定3次,將各次測得的光譜曲線加和取平均得到各樣品的數據曲線。

1.4 數據處理 利用Origin 7.5版、SPSS 18.0版軟件對近紅外光譜進行數據處理分析。

2 結果

2.1 芡實近紅外光譜測定結果 不同產地芡實樣品的近紅外圖譜如圖1所示。各產地波形和吸光度大小有很大的相似性,表明芡實藥材質量總體平穩(wěn),變異趨勢較小。S3和S11吸光度較大。

表1 芡實樣品資料Tab.1 Sou rces of Euryales semen

另外,中藥材中水分差別較大,在近紅外圖譜中水峰位置常有較大的干擾,故掃描范圍避開水峰位置1 333～1 408 nm、1 785～1 923 nm[8]。此外,可使用紅外水分析儀在60℃下干燥至恒重后置于干燥器中使其溫度與室溫平衡后再采集近紅外光譜,以減少水分對分析的影響。

圖1 芡實近紅外原始圖譜Fig.1 Original NIR spectra of Euryales sem en

2.2 光譜波段的選擇 采用800～2 500 nm全波段范圍建立預測模型。當選取的波長范圍為1 196～2 332 nm時,特征峰較為明顯,故確定此區(qū)段為指紋區(qū),確定了8個共有吸收峰,峰位2 331.017 nm、峰位2 313.353 nm、峰位2 101.412 nm、峰位1 928.765 nm、峰位1 761.000 nm、峰位1 549.000 nm、峰位1 468.118 nm、峰位1 196.000 nm(圖2)。根據特征峰位,計算得到不同產地芡實的近紅外光譜差異(表2)。

2.3 光譜數據再處理 利用Origin7.5版軟件對原始數據進行微分,得到全光程范圍內的近紅外一階導數、二階導數。

樣品的近紅外導數光譜見圖3。各產地芡實一階導數近紅外光譜的相應吸收峰基本一致,主要反映了種子類藥材中植物淀粉多糖等的特征,但在1 350～1 450,1 850～2 250 nm范圍內,各產地光譜信號稍有不同,這些譜段的差異更加明顯。二階導數上增加了多點校正,使得譜圖更加平滑,差異較一階導數小,以上譜段中光譜信號的差異可能是由于各產地芡實化學成分的不同造成的?？傮w來說,樣品因種間差異,主要化合物的種類及含量會有差別,其特征信息很難從峰位、峰強、峰形方面直觀鑒別。但經過數學處理提取特征信息后,便可應用于分類鑒別。

2.4 特征峰相關性分析 對芡實近紅外圖譜共有峰位進行相關性分析,以Pearson相關系數表示,得到共有峰的相關系數矩陣,見表3。

結果顯示,芡實近紅外光譜中有25對呈現顯著的正相關(P≤0.01),有3對呈正相關(0.01≤P≤0.05)。表明芡實近紅外光譜大多峰位之間有很好的協(xié)同作用,可以認為其各共有峰之間彼此聯系。沒有呈負相關的峰位,說明芡實近紅外指紋圖譜中這些峰協(xié)同性性十分明顯,均衡性較好。

表2 芡實特征吸收峰位吸光度Tab.2 Absorbance of characteristic peaks of Euryales semen

圖2 芡實近紅外特征峰標記Fig.2 Marks of characteristic peaks in NIR spectra Euryales semen

2.5 主成分分析 通過SPSS 18.0版軟件中的因子分析對原始數據進行標準化處理。主成分的特征根及貢獻率是選擇主成分的依據。表描述了各成分的貢獻率,由表4可知,前3個成分P6、P7、P5的特征值＞0.110,即7.291,0.575,0.110,對總方差的累積貢獻率達99.698%,故選擇P6、P7、P5為主成分。

根據主成分計算公式可以得到兩個主成分與原8項指標的線性組合如下,可計算綜合得分。

A1=0.135P1+0.134P2+0.134P3+0.132P4+ 0.137P5+0.137P6+0.137P7+0.096P8

A2=-0.235P1-0.253P2-0.282P3-0.019P4-0.028P5-0.037P6-0.026P7+1.240P8

A3=0.653P1+1.198P2+0.979P3-2.355P4+ 0.004P5-0.265P6-0.620P7+0.533P8

以主成分為變量得到三維loading圖(圖4)。在loading圖中選取距離原點較遠的幾個點,得到主成分1中變量的權重值,權重值越大表明該成分在決定樣品區(qū)分中的作用越大,其中前3名變量的權重值分別為0.997,0.997,0.996,分別為P6、P7、P5,它們的峰位分別為1 549.000,1 468.118,1 761.000 nm。與前面分析結果一致,即可判定P6、P7、P5為各產地芡實近紅外光譜的主成分。

2.6 聚類分析 將各色譜峰面積相對于稱樣量量化,運用SPSS18.0版軟件對17個產地芡實樣品進行系統(tǒng)聚類,方法為組間連結,以夾角余弦作為樣品相似度的距離公式。當類間距離在3.5時,17個芡實樣品分為4類,聚類分析結果見圖5。通過聚類分析可以找到不同產地芡實之間的信息特征,達到鑒別區(qū)分的目的。Ⅰ類:四川成都、山東菏澤、安徽蕪湖、湖北武穴、對照藥材、湖南益陽、江蘇蘇州、江蘇寶應、江蘇浦口；Ⅱ類:河北安國、湖北蘄春、廣東肇慶、廣東潮州、江蘇金湖、江蘇建湖；Ⅲ類:福建莆田；Ⅳ類:四川中江。當類間距離在6.5時,聚為三類,即福建莆田、四川中江和其他。而當類間距離在25時,所有的芡實聚為一大類。說明類間距離對分類起到決定性作用,福建莆田、四川中江兩地與其他產地差距較大。福建莆田芡實是引種品,其形態(tài)與其他產地芡實有差異,且長期處于加工食用狀態(tài),很少用于飲片生產,生產目的性已發(fā)生改變。四川中江非芡實的道地產區(qū),種植規(guī)模較小,氣候溫熱,在一定程度上使其成分區(qū)別于其他產地。聚類分析表明,受生長環(huán)境、氣候等條件影響,不同產地芡實在本質上所含的化學成分發(fā)生了變化,從而引起了分類上的差異。

A.一階導數圖譜;B.二階導數圖譜圖3 芡實近紅外一階二階導數圖譜A.first derivative spectra；B.second derivative spectraFig.3 First and second derivative NIR spectra of Euryales semen from different areas

表3 芡實中共有峰間相關性Tab.3 The correlation of common peak in Euryales semen

表4 特征值和貢獻率Tab.4 Eigenvalue and contribution rate %

圖4 芡實近紅外指紋圖譜三維投影圖Fig.4 3D loading scatter p lot of NIR fingerprint of Euryales semen

圖5 聚類分析結果Fig.5 Results of cluster analysis

以各共有峰為變量得到Score圖(圖6)。由圖可見4類樣品緊密地聚集在一起,各自分散在圖中的不同區(qū)域,使不同產地之間獲得了良好的區(qū)分,表明不同產地的芡實近紅外圖譜有一定的差別,能作為產地分類的依據。

圖6 芡實近紅外指紋圖譜Score圖Fig.6 Score spectra of NIR finger of Euryales semen

3 討論

本實驗采用近紅外球面漫反射光譜測定了全國17個產地的芡實樣本近紅外光譜,并采用主成分分析結合聚類判別,建立了芡實近紅外指紋圖譜,結果表明近紅外光譜在芡實藥材產地鑒別和質量評定中有一定的指導意義,建議作為芡實藥材質量評價的手段之一,也可以作為芡實藥材真?zhèn)舞b別的一種新的手段。利用軟件建立標準化模型,再進一步對模型進行驗證,是以芡實中特有的化學成分為基礎的,定性鑒別模型方法學的重要手段。這也可以指導芡實等中藥材研究的新思路。此外,通過增大樣本量,確定成分含量,加以MATLAB、OPUS、TQ、SIMCA-P等軟件的分析,結合中紅外和拉曼光譜,可以進一步對蘇芡和刺芡進行區(qū)分。

在藥檢工作中,近紅外技術用于西藥的快速現場篩查已十分廣泛,藥品快檢車搭載的近紅外儀已經建立了不少品種的模型[9-11],為鑒別假劣藥品提供了有效的技術支持。中藥品種多,產地廣,易導致混亂,作為中藥品質評價提升的一個手段,中紅外結合近紅外分析雖是傳統(tǒng)技術,但通過現代的數據分析軟件和計算藥學的發(fā)展,在評價方面將會得到進一步的提升。模式識別、人工神經網絡、褶合變換的應用,使得模型趨于成熟。因此,紅外技術在保證中藥質量,促進中藥產業(yè)持續(xù)發(fā)展方面具有廣闊的前景。

[1] WETER JG.Applied spectroscopy reviews[J].1985,21 (12):1.

[2] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:151.

[3] 黃奭.神農本草經[M].北京:中醫(yī)藥古籍出版社,1982: 104-105.

[4] 陳蓉,陳廣云,沈蓓,等.基于共有峰率和變異峰率雙指標序列分析法的芡實藥材紅外指紋圖譜研究[J].中國藥房,2012,23(23):2141-2146.

[5] 魏惠珍,方少敏,饒毅,等.近紅外光譜技術快速測定白芍藥材烘干過程中水分[J].中草藥,2011,10(42): 1994-1997.

[6] 孫素琴,周群,張宣,等.傅里葉變換拉曼光譜法無損鑒別植物生藥材[J].分析化學,2000,28(2):211-214.

[7] 孫素琴,杜德國,梁曦云,等.36種靈芝產品傅里葉變換紅外光譜快速鑒別研究[J].分析化學,2001,29(3): 309-312.

[8] 黃蘅,劉慧妍,陳啟釗.近紅外光譜技術在海金沙鑒別中的應用初探[J].現代中藥研究與實踐,2010,2(5):24-25.

[9] 江燕,沈佳特,姜紅.復方氨酚烷胺片的近紅外漫反射光譜鑒別[J].醫(yī)藥導報,2009,28(1):349-351.

[10] 白雁.現代近紅外光譜分析技術在藥品及食品品質評價系統(tǒng)中的應用[M].北京:高等教育出版社,2009:138.

[11] 李萬江,馮海青.近紅外光譜法對藿香正氣水中乙醇的定量分析[J].醫(yī)藥導報,2011,30(10):1351-1352.

DOI 10.3870/yydb.2014.05.032

Rapid Analysis for Fingerprint of Euryales Semen by Near Infrared Spectroscopy

CHEN Rong1,CHEN Wei2,WU Qi-nan3
(1.Suzhou Institute for Food and Drug Control,Suzhou 215104, China;2.Suzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine,Suzhou 215006,China;3.College of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210046,China)

ObjectiveTo authenticateEuryales semencollected from seventeen regions by NIR fingerprint spectra and to establish a rapid analysismethod.MethodsSpectrawere collected by VARIAN CARY5000 ultraviolet visible near infrared spectrophotometer,with correlation and origin clustering method for analysis by using Origin 7.5 and SPSS 18.0 software.ResultsThe correlation of peaks forEuryales semenfrom 17 localities were significant,while the regions were distinguished clearly.ConclusionIt is indicated that the method is rapid,lossless,and it can be applied to authenticateEuryalesfrom different regions,which provides reference to rapid inspection of Chinese medicines.

Euryales semen;Near-infrared spectroscopy;Analysis,rapid

R282.71;R927

A

1004-0781(2014)05-0653-05

2013-06-24

2013-08-23

*“十二五”國家科技支撐計劃項目(2011BAI04B06)

陳蓉(1986-),女,江蘇蘇州人,中藥師,碩士,研究方向:中藥質量評價。電話:(0)13962513952,E-mail:kedingyu@126.com。

吳啟南(1963-),男,江蘇南通人,教授,博士,研究方向:中藥質量評價。電話:025-85811507,E-mail:qnlxw@yahoo.com.cn。